Görüntüleme Sitometrisi ile İnsan Monosit türetilmiş dendritik hücrelerle Karakterizasyonu: İki Monosit İzolasyon Protokoller Arasında Bir Karşılaştırma

Bu çalışmanın genel amacı, in vitro olarak dendritik hücre üretimi için iki farklı insan monosit izolasyon yöntemini karşılaştırmak ve elde edilen monosit türevli popülasyonların CT11c, CT14 hücre yüzey ekspresyonunu görüntüleme akış sitometrisi ile karakterize etmektir. Bu monosit izolasyon protokolleri, araştırma ve klinik uygulamalar için insan dendritik hücrelerinin saflaştırılması için güvenilir yöntemlerin geliştirilmesine katkıda bulunabilir. Bu protokollerin temel avantajı, insan monositlerinin izolasyonunu ve canlı ve fonksiyonel monosit türevi hücrelere farklılaşmasını kolaylaştırmalarıdır.

Ek olarak, bu, tek hücreli görüntüleme akış sitometrisi ile monosit türevli dendritik hücrelerin spesifik popülasyonunu karakterize eden ilk çalışmadır. Bu yöntem, diğer nadir hücrelerin aşağı akış araştırma uygulamaları için yeterli bir verimde izolasyonu için bir alternatif olarak da uygulanabilir. Bu yöntemlerin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü uygun talimat ve deneyim olmadan kan örneklerini güvenli bir şekilde işlemek zor olabilir.

Kan örneğini bir T75 şişesinde PBS ile bire bir oranında seyrelterek başlayın. Daha sonra, 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne 15 mililitre yoğunluk gradyan çözeltisi ekleyin ve seyreltilmiş kanın 25 ila 30 mililitresini gradyan üzerine dikkatlice katmanlayın. Periferik kan mononükleer hücrelerinin uygun bir şekilde ayrılmasını sağlamak için, kanı yoğunluk gradyan çözeltisine hızlı, ancak dikkatli bir şekilde ve katmanları karıştırmadan yükleyin.

Hücreleri santrifüjleme ile ayırın, ardından beyaz kan hücresi arayüz tabakasının yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarılmasını izleyin. Hücreleri PBS'de iki kez yıkayın, son peleti 10 mililitre amonyum klorür potasyum parçalama tamponunda 4 santigrat derecede 15 dakika boyunca yeniden süspanse edin. Daha sonra hücreleri PBS'de iki kez daha yıkayın.

Monositleri yapışma yöntemiyle izole etmek için, nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derece ve yüzde beş karbondioksitte iki saat boyunca yeni bir T75 şişesinde 10 mililitre tam ortam başına elde edilen PBMC peletinin yedi hücresine beş kez 10 kez kültür edin. İnkübasyonun sonunda, yapışmayan yüzen hücreleri atın ve yapışan hücreleri PBS ile iki kez nazikçe yıkayın. Daha sonra, yapışık hücreleri insan GMCSF ve IL4 ile takviye edilmiş tam hücre kültürü ortamı ile besleyin ve kültürü beş ila yedi gün boyunca inkübatöre geri koyun.

Monositleri manyetik ayırma ile izole etmek için, PBMC'yi yoğunluk gradyan ayırma ile topladıktan sonra, beyaz kan hücresi katmanını beş mililitrelik bir polistiren tüpe aktarın ve hücreleri PBS'de mililitre konsantrasyonda beş kez 10 ila yedi hücrede yeniden süspanse edin. Daha sonra, karıştırarak hücrelere mililitre başına 50 mikrolitre insan monosit zenginleştirme kokteyli ekleyin ve hücreleri kokteyl ile 10 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, dikkatli bir şekilde karıştırarak mililitre hücre başına 50 mikrolitre manyetik parçacık ekleyin ve hücreleri beş dakika boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin.

İkinci inkübasyonun sonunda, toplam hacmi iki nokta beş mililitreye çıkarmak için hücrelere PBS ekleyin ve iki ila üç kez pipetleyerek karıştırın. Ardından polistiren tüpü oda sıcaklığında uygun bir manyetik cihaza yerleştirin. İki buçuk dakika sonra, tüp hala mıknatısın içindeyken, saflaştırılmış monosit fraksiyonunu 15 mililitrelik yeni bir konik tüpe boşaltın.

Daha sonra, saflaştırılmış monositleri ve GMCSF ve IL4 ile desteklenmiş tam hücre kültürü ortamını, az önce gösterildiği gibi beş ila yedi gün boyunca kültürleyin. Yedi günlük farklılaşmadan sonra, monositten türetilmiş dendritik hücrelerin altı hücre alikuatını uygun sayıda bir nokta beş mililitrelik tüplere bir kez 10 kez dağıtın ve spesifik olmayan herhangi bir bulguyu bloke etmek için her numuneye 50 mikrolitre ısıyla inaktive edilmiş insan serumu ekleyin. 10 dakika sonra, hücreleri santrifüjleyin ve peletleri uygun floresan konjuge primer antikorlarda ışıktan korunarak dört santigrat derecede 20 dakika boyunca yeniden süspanse edin.

Daha sonra hücreleri bir mililitre PBS'de iki kez yıkayın, peletleri bir kere on ila altı hücrede 100 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin. Analizden hemen önce, her tüpe bir mikrolitre DAPI ekleyin. Ardından, üreticinin talimatlarına göre tek hücreli bir görüntüleme akış sitometresindeki numuneleri okuyun.

Ortalama olarak, yapışma yöntemiyle izole edilen monositler, toplam periferik kan monosit hücresi veya PBMC popülasyonunun yaklaşık yüzde altı nokta ikisini oluştururken, manyetik ayırma ile izole edilen monositler, toplam PBMC'nin yüzde 25'ini oluşturur. Her iki yöntemle de izole edilen monositler eşit derecede canlıdır. Her iki yöntemle saflaştırılan monositlerden farklılaşan MDDC'ler, önce toplam tek hücrelerden DAPI negatif veya canlı hücrelere dayalı olarak kapılandı, ardından her hücre popülasyonunun kapılanması yapıldı.

Her iki izolasyon yöntemi de düşük tek CD14 pozitif popülasyon ve her iki yöntem de yüksek toplam CD11c pozitif popülasyon verdi. Tüm CD11c pozitif hücreler üzerinde daha fazla fenotipik analiz yapıldı ve manyetik izolasyon çift pozitif CD11c pozitif CD14 pozitif hücrelerin daha yüksek bir yüzdesini vermesine rağmen, bu etki uyum yöntemi ile karşılaştırıldığında anlamlı değildi. Bu çift pozitif CD11c pozitif, CD14 pozitif hücreler, CD14 monositik belirtecini henüz düşürmemiş erken evre diferansiye MDDC'ler olabilir.

Tek CD11c pozitif hücreleri analiz ederken, aderans yöntemi CD11c pozitif, CD14 negatif hücrelerin en yüksek verimini verir. Bu tek pozitif hücreler geç evre diferansiye MDDC'ler olabilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, yapışma ve manyetik izolasyon teknikleri, uygun şekilde gerçekleştirilirse sırasıyla üç ila dört ve bir ila iki saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü denerken, ortam yenilendiğinde her 48 saatte bir taze dendritik hücre farklılaşma sitokinlerine sahip olmayı unutmamak önemlidir. Kan gibi biyolojik olarak tehlike arz eden sıvılarla çalışmak son derece zararlı olabilir ve bu prosedürler gerçekleştirilirken her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman ve bertaraf yöntemlerinin kullanılması gerekir. Bu çalışma, immünoloji alanındaki araştırmacıların insan monositlerinin ve dendritik hücrelerin terapötik tedavi için kullanımını araştırmalarının yolunu açmaktadır.

Bu videoyu izledikten sonra, in vitro olarak farklı monosit türevi hücre popülasyonları oluşturmak için insan monosit izolasyonunun nasıl optimize edileceğini iyi anlamış olmalısınız.