Name: Görüntüleme Sitometrisi ile İnsan Monosit türetilmiş dendritik hücrelerle Karakterizasyonu: İki Monosit İzolasyon Protokoller Arasında Bir Karşılaştırma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Öğrenin, insan monosit izolasyon yöntemlerini dendritik hücre üretimi için karşılaştırın ve görüntüleme akış sitometrisiyle hücre yüzey belirteçlerini analiz edin. Bu yöntemler immünoloji araştırmaları için güvenilir hücre saflaştırma sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, Ulusal Alkol Suistimali ve Alkolizm Enstitüsü tarafından desteklenmektedir, ödül K99/R00 AA021264. Başlangıç paketinin bir parçası olarak İmmünoloji Anabilim Dalı, Nöroimmün Farmakoloji Enstitüsü, Herbert Wertheim Tıp Fakültesi ve FIU Araştırma ve Ekonomik Kalkınma Ofisi'nden ek laboratuvar desteği alınmıştır. Gianna Casteleiro, NIH/NIGMS R25 GM061347 tarafından desteklendi. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Genel insan kanı çalışmaları gözden geçirmiş ve IRB protokol onay # IRB-13-0440 Mali İstihbarat Birimi Kurumsal İnceleme Kurulu (KİK) tarafından onaylanmıştır. İnsan leukopaklar Miami, FL topluluk kan bankasından satın alınmıştır. Standart Yoğunluk Gradient Tekniği ile PBMC&#39;ler 1. İzolasyonu <ol><li> T75 şişesi içinde 1x-fosfat tamponlu tuzlu su ile kanı 1 seyreltme: 1 gerçekleştirin. </li><li> Pipet 15 ila 50 ml santrifüj tüpleri içine yoğunluk gradyan solüsyonu ve dikkatli bir şekilde katman - Bu gradyan seyreltilmiş kan (25 30 mL / tüp). </li><li> 1 hızlanma ve 0 yavaşlama ile 1200 x g&#39;de 20 dakika süreyle santrifüjlenir. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, yeni bir 50 ml&#39;lik santrifüj tüpüne arabirim katmanı (beyaz kan hücreleri) toplamak ve PBS içinde iki kere (1.080 x g&#39;de 3 dakika) ardından hücreler yıkanır. Her zaman süpernatant atın. </li><li> Amonyum klorid, potasyum lize (ACK) tampon maddesi ile hücreleri tedavi (kırmızı kan hücreleri lize etmek için). tampon ve 10 ml4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca cubate. </li><li> 1.080 x g&#39;de 3 dakika boyunca, PBS ile iki kez santrifüj hücre yıkayın ve her bir zaman supernatant atın. </li><li> PBMC&#39;ler içerecek olan pelet kaydedin. </li><li> tercih edilen monosit saflaştırma yöntemi ile devam edin. </li></ol> Bağlılık Yöntemiyle 2. Monosit Arıtma <ol><li> L-glutamin (300 mg / ml) ihtiva eden tam bir hücre kültür ortamı hazırlayın penisilin (50 U / ml) -streptomycin (50 ug / ml) ve% 10 cenin sığır serumu ile takviye edilmiştir. </li><li> PBMC&#39;ler nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 seviyesinde tam ortam, 10 ml başına 5 x 10 7 hücre konsantrasyonunda T75 şişesi içinde kültürlenmesi ile yaklaşık 2 saat boyunca yapışmaya izin verin. </li><li> İnkübasyondan sonra, kültür şişesi yapışmayan kayan hücreleri çıkarmak ve yavaşça PBS ile iki kez yapışmış olan hücrelerin yıkayın. </li><li> insan granülosit-Makr 2 ul / ml ile desteklenmiş tam hücre kültür ortamı içinde yapışkan hücreleri inkübeophage koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ve interlökin 4 (IL-4), 10 ug / ml&#39;lik bir stok konsantrasyonu C&#39;de saklandı. </li><li> orta yarısı değiştirin ve sitokinler her 48 saat doldurmak. </li><li> MDDCs monositlerin farklılaşması için 7 gün - 5 bekleyin. </li></ol> Manyetik Ayırma Yöntemiyle 3. Monosit Arıtma <ol><li> 5 ml&#39;lik bir polistiren tüp içine dökün ve hücre / ml&#39;lik bir konsantrasyonda PBS tamponu içinde askıya tekrar standart yoğunluk gradyan tekniği PBMC&#39;ler toplayın. </li><li> 50 ul / ml hücreleri kullanılarak insan monosit zenginleştirme kokteyl ekleyin karıştırın ve 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> İnkübasyondan sonra, 50 ul / ml hücreleri kullanılarak manyetik parçacıkların ilave edilir, iyice karıştırın ve 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> PBS tampon çözeltisi ilave edilerek 2.5 ml&#39;lik toplam hacme kadar hücre süspansiyonu getirmek aşağı 2 ve yukarı pipetlenerek iyice karıştırın - 3 kez. </li><li> Manyetik cihazın içine bir kapak olmadan polistiren tüp yerleştirin ve 2 RT&#39;de kenara.5 dakika. </li><li> inkübasyondan sonra ve bir sürekli hareket halinde, mıknatıs pick up ve temiz bir 50 ml&#39;lik santrifüj tüpüne istenen saflaştırılmış monosit fraksiyonu dökün. </li><li> Tüm hücre kültürü insan granülosit-makrofaj koloni stimüle edici faktör (GM-CSF) 2 ul / ml ile takviye edilmiş ortam ve interlökin 4 yapışık hücreleri inkübe (IL-4), 10 ug / ml&#39;lik bir stok konsantrasyonu C&#39;de saklandı. </li><li> Her 48 saat, orta yarısı değiştirin 5 dakika boyunca 1.080 xg&#39;de aşağı spin ve yeni medya (cRPMI) ve sitokinler ile pelet yeniden askıya. </li><li> MDDCs monositlerin farklılaşması için 7 gün - 5 bekleyin. </li></ol> 4. Tripan Mavi Dışlama Canlılık Testi Not: PBMC, monositler ve MDDCs hücre verimini ve canlılığı elde etmek için bu yöntem kullanınız. <ol><li> Standart tripsin-EDTA kullanılarak ve matara ve PBS kullanarak hücre pelet yıkar gerçekleştirmek Hasat hücreleri. pelet boyutuna bağlı olarak, yenidenpelet çözmek için PBS 5 ila 10 ml askıya. </li><li> Seyreltilmiş hücre peleti ile tripan mavisi reaktif 1 seyreltme: mikro-santrifüj tüpünde, 1 gerçekleştirin. </li><li> Bu karışımı, bir hücre içine kısım 10 ul slayt sayarak ve üreticinin protokolüne uygun olarak, otomatik bir hücre sayacı sonuçları okuyun. otomatik bir hücre sayacı mevcut değilse, benzer hücre sayısı, bir hemasitometre veya manuel sayacı kullanılarak mümkündür. </li></ol> 5. MTT Testi <ol><li> Bir 96-çukurlu plaka içindeki her birine tam ortam 4 x 10 4/100 ul&#39;lik bir konsantrasyonda plakası hücreleri. Hücreler kültüre uyum için 24 saat izin verin. </li><li> Inkübe ve sırasıyla 0 (Yok gün 0), 36 (3 gün) ve 84 (gün 7) saatte okumaları gerçekleştirin. </li><li> İstenilen kuluçka tamamlanmasından sonra, ortamını çıkarın ve tek başına 100 ul PBS ile değiştirin. </li><li> Hazırlama 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) dimetilpropil 10 ml ekleyerek -2,5-difenil tetrazolyum bromür çözeltisi (MTT) (5 mg / ml)sodyum dodesil sülfat, 1 g (SDS) il sülfoksit (DMSO). </li><li> Her bir oyuğa MTT çözeltisi 10 ul (5 mg / ml) ilave edin ve 2 saat daha 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> inkübasyondan sonra, PBS ve dönüştürülmemiş MTT karışımı (sarı renkli çözelti) ihtiva süpernatantlar kaldırmak. </li><li> Her bir oyuğa, SDS-DMSO çözeltisi 100 ul ilave edin ve bir saat daha inkübe edilir. </li><li> Bir mikrolevha okuyucu kullanılarak 540 nm&#39;de absorbansı okumak. </li></ol> 6. Hücre Yüzey Görüntüleme Sitometrisi ile Boyama Analizi <ol><li> Saflaştınldı monositlerden farklılaşma 7 gün sonra, 1.5 ml tüpler uygun sayıya monosit türevli dendritik hücrelerin 1x10 6 Hücre numuneleri dağıtın. </li><li> ısıyla inaktive 50 ul (HI), insan serumu kullanılarak bloke hücreler ile hücre yüzeye lekelemesi başlatın, 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> İnkübasyondan sonra, santrifüj hücreler 5 dakika için 720 x g hızında, süpernatant atılır. </li><li> pelle hücret, ilgili florokrom-eşlenik antikorlar (örneğin, anti-CD11c, anti-CD14 ya da) ekleyin ve ışıktan koruyarak 20 dakika boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. tazminat için gerekli beri ayrı tüplerde) tek florokrom lekeli örnekler / ml hazırlamak. </li><li> İnkübasyondan sonra, 5 dakika boyunca 720 x g&#39;de PBS tamponu ve santrifüj 1 ml her seferinde iki kez yıkama hücreleri. </li><li> ışıktan korunan hücreleri tutulması, akış sitometri analizi için bir hücre / 100 ul bir konsantrasyonda PBS tamponu içinde yeniden askıya. </li><li> canlı hücreler üzerinde kapısı için, önce, imalatçının talimatlarına uygun olarak alet sitometrisi tek hücre görüntüleme akış hücreleri elde etmek Her tüpe DAPI 1 ul ekle. </li></ol> 7. İstatistiksel Analiz <ol><li> Girdi bir e-tablodaki tüm verileri. </li><li> Öğrencinin t-testi ve / veya tek yön uygun olarak ANOVA kullanarak sonuçları karşılaştırın. </li><li> p ise &lt;0.05 istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar göz önünde bulundurun. </li&gt; </ol>

<ol><li>Cella, M., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+maturation+and+antigen+presenting+function+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Imunol%22%5BJournal%5D)">Origin maturation and antigen presenting function of dendritic cells.</a> Curr Opin Imunol. 9, 10-16 (1997).</li>
<li>Banchereau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+of+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunobiology of Dendritic Cells.</a> Ann Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).</li>
<li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392, 245-252 (1998).</li>
<li>Kaouther, M., Ridha, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+Cell-Based+Graft+Tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22ISRN+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Dendritic Cell-Based Graft Tolerance.</a> ISRN Pharmacol. , (2011).</li>
<li>Steinman, R., Gutchinov, B., Witmer, M., Nussenzweig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+are+the+principal+stimulators+of+the+primary+mixed+leukocyte+reaction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells are the principal stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice.</a> J Exp Med. 157, 613-627 (1983).</li>
<li>Nair, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-directed+inhibition+of+DC-SIGN+by+dendritic+cells%3A+Prospects+for+HIV-1+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">RNAi-directed inhibition of DC-SIGN by dendritic cells: Prospects for HIV-1 therapy.</a> AAPS J. 7, E572-E578 (2005).</li>
<li>Agudelo, M., et al. Chapter 10. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAgudelo%2C+M+%22Dendritic+Cells%3A+Types%2C+Life+Cycles+and+Biological+Functions%22">Dendritic Cells: Types, Life Cycles and Biological Functions</a>. , Nova Publishers. 167-177 (2010).</li>
<li>Kajihara, M., Takakura, K., Ohkusa, T., Koido, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+dendritic+cell-tumor+fusion+cells+on+cancer+vaccines+-+past+progress+and+future+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">The impact of dendritic cell-tumor fusion cells on cancer vaccines - past progress and future strategies.</a> Immunotherapy. , (2015).</li>
<li>Suwandi, J., Toes, R., Nikolic, T., Roep, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+tissue+specific+tolerance+in+autoimmune+disease+with+tolerogenic+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Inducing tissue specific tolerance in autoimmune disease with tolerogenic dendritic cells.</a> Clin Exp Rheumatol. 33, 0097-0103 (2015).</li>
<li>Gorelik, M., Frischmeyer-Guerrerio, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+dendritic+cell+responses+to+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive dendritic cell responses to immunotherapy.</a> Curr Opin Allergy Immunol. 15, 575-580 (2015).</li>
<li>Zwolak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood+dendritic+cells+in+alcoholic+and+autoimmune+liver+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Exp+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood dendritic cells in alcoholic and autoimmune liver disorders.</a> Hum Exp Toxicol. 31, 438-446 (2012).</li>
<li>Agudelo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+and+functional+role+of+cannabinoid+genes+in+alcohol+users%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Alcohol+Depend%22%5BJournal%5D)">Differential expression and functional role of cannabinoid genes in alcohol users.</a> Drug Alcohol Depend. 133, 789-793 (2013).</li>
<li>Nair, M. P., Figueroa, G., Casteleiro, G., Muñoz, K., Agudelo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol+Versus+Cannabinoids%3A+A+Review+of+Their+Opposite+Neuro-Immunomodulatory+Effects+and+Future+Therapeutic+Potentials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alcohol+Drug+Depend%22%5BJournal%5D)">Alcohol Versus Cannabinoids: A Review of Their Opposite Neuro-Immunomodulatory Effects and Future Therapeutic Potentials.</a> J Alcohol Drug Depend. 3, 184(2015).</li>
<li>Boukli, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+ER+Stress%2C+the+Unfolded+Protein+Response%2C+and+Pro-+and+Anti-Apoptotic+Protein+Fingerprints+in+Human+Monocyte-Derived+Dendritic+Cells+Treated+With+Alcohol%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">Implications of ER Stress, the Unfolded Protein Response, and Pro- and Anti-Apoptotic Protein Fingerprints in Human Monocyte-Derived Dendritic Cells Treated With Alcohol.</a> Alcohol Clin Exp Res. 34, 2081-2088 (2010).</li>
<li>Nair, M. N., Mahajan, S., Sykes, D., Bapardekar, M., Reynolds, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methamphetamine+Modulates+DC-SIGN+Expression+by+Mature+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Methamphetamine Modulates DC-SIGN Expression by Mature Dendritic Cells.</a> J Neuroimmune Pharmacol. 1, 296-304 (2006).</li>
<li>Napuri, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+Enhances+HIV-1+Infectivity+in+Monocyte+Derived+Dendritic+Cells+by+Suppressing+microRNA-155%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cocaine Enhances HIV-1 Infectivity in Monocyte Derived Dendritic Cells by Suppressing microRNA-155.</a> PLoS ONE. 8, e83682(2013).</li>
<li>Nair, M. P. N., Saiyed, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+methamphetamine+on+expression+of+HIV+coreceptors+and+CC-chemokines+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effect of methamphetamine on expression of HIV coreceptors and CC-chemokines by dendritic cells.</a> Life Sciences. 88, 987-994 (2011).</li>
<li>Nair, M. P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+Modulates+Dendritic+Cell-Specific+C+Type+Intercellular+Adhesion+Molecule-3-Grabbing+Nonintegrin+Expression+by+Dendritic+Cells+in+HIV-1+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cocaine Modulates Dendritic Cell-Specific C Type Intercellular Adhesion Molecule-3-Grabbing Nonintegrin Expression by Dendritic Cells in HIV-1 Patients.</a> J Immunol. 174, 6617-6626 (2005).</li>
<li>Reynolds, J. L., Mahajan, S. D., Sykes, D. E., Schwartz, S. A., Nair, M. P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analyses+of+methamphetamine+%28METH%29-induced+differential+protein+expression+by+immature+dendritic+cells+%28IDC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Proteomic analyses of methamphetamine (METH)-induced differential protein expression by immature dendritic cells (IDC).</a> Biochem Biophys Acta. 1774, 433-442 (2007).</li>
<li>Van Voorhis, W., Hair, L., Steinman, R., Kaplan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dendritic+cells.+Enrichment+and+characterization+from+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Human dendritic cells. Enrichment and characterization from peripheral blood.</a> J Exp Med. 155, 1172-1187 (1982).</li>
<li>Davis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mac-1+and+p150%2C95+beta+2+integrins+bind+denatured+proteins+to+mediate+leukocyte+cell-substrate+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The Mac-1 and p150,95 beta 2 integrins bind denatured proteins to mediate leukocyte cell-substrate adhesion.</a> Exp Cell Res. 200, 242-252 (1992).</li>
<li>Delirezh, N., Shojaeefar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+comparison+between+flask+adherent+and+magnetic+activated+cell+sorted+monocytes+derived+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Iran+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional comparison between flask adherent and magnetic activated cell sorted monocytes derived dendritic cells.</a> Iran J Immunol. 9, 98-108 (2012).</li>
<li>Lehner, M., Holter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin-Free+Purification+of+Monocytes+for+Dendritic+Cell+Generation+via+Discontinuous+Density+Gradient+Centrifugation+Based+on+Diluted+Ficoll-Paque+Plus%3Csup%3E%C2%AE%3C%2Fsup%3E%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">Endotoxin-Free Purification of Monocytes for Dendritic Cell Generation via Discontinuous Density Gradient Centrifugation Based on Diluted Ficoll-Paque Plus®.</a> Int Arch Allergy Immunol. 128, 73-76 (2002).</li>
<li>Van Brussel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+activated+cell+sorting%3A+An+effective+approach+to+study+dendritic+cell+subsets+in+human+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent activated cell sorting: An effective approach to study dendritic cell subsets in human atherosclerotic plaques.</a> J. Immunol Methods. 417, 76-85 (2015).</li>
<li>Mucci, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methodological+approach+for+the+generation+of+humandendritic+cells+from+monocytes+affects+the+maturation+state+of+the+resultant+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%22%5BJournal%5D)">The methodological approach for the generation of humandendritic cells from monocytes affects the maturation state of the resultant dendritic cells.</a> Biologicals. 37, 288-296 (2009).</li>
<li>Yuan, N., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYuan%2C+N+%22The+American+Association+of+Immunologists+%28AAI%29%22">The American Association of Immunologists (AAI)</a>. , AAI. Miami Beach, FL. (2007).</li>
<li>Romani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferating+dendritic+cell+progenitors+in+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Proliferating dendritic cell progenitors in human blood.</a> J Exp Med. 180, 83-93 (1994).</li>
<li>Bennett, S., Breit, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variables+in+the+isolation+and+culture+of+human+monocytes+that+are+of+particular+relevance+to+studies+of+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV.</a> J Leukoc Biol. 56, 236-240 (1994).</li>
<li>Grützkau, A., Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+but+mighty%3A+How+the+MACS%C2%AE-technology+based+on+nanosized+superparamagnetic+particles+has+helped+to+analyze+the+immune+system+within+the+last+20+years%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years.</a> Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).</li>
<li>El-Sahrigy, S. A., Mohamed, N. A., Talkhan, H. A., Rahman, A. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+magnetic+activated+cell+sorted+monocytes+and+monocyte+adherence+techniques+for+in+vitro+generation+of+immature+dendritic+cells%3A+an+Egyptian+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Cent+Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Comparison between magnetic activated cell sorted monocytes and monocyte adherence techniques for in vitro generation of immature dendritic cells: an Egyptian trial.</a> Cent Eur J Immunol. 40, 18-24 (2015).</li>
<li>Curry, C. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCurry%2C+CV+%22Differential+Blood+Count%22">Differential Blood Count</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://emedicine.medscape.com/article/2085133-overview">http://emedicine.medscape.com/article/2085133-overview</a> (2015).</li>
<li>Sallusto, F., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+presentation+of+soluble+antigen+by+cultured+human+dendritic+cells+is+maintained+by+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor+plus+interleukin+4+and+downregulated+by+tumor+necrosis+factor+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha.</a> J Exp Med. 179, 1109-1118 (1994).</li>
<li>Cavanagh, L. L., Saal, R. J., Grimmett, K. L., Thomas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+in+Monocyte-Derived+Dendritic+Cell+Cultures+Is+Caused+by+Progenitor+Cells+Capable+of+Myeloid+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Proliferation in Monocyte-Derived Dendritic Cell Cultures Is Caused by Progenitor Cells Capable of Myeloid Differentiation.</a> Blood. 92, 1598-1607 (1998).</li>
<li>Ardeshna, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-derived+dendritic+cells+do+not+proliferate+and+are+not+susceptible+to+retroviral+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Monocyte-derived dendritic cells do not proliferate and are not susceptible to retroviral transduction.</a> Br J Haematol. 108, 817-824 (2000).</li>
<li>Chapuis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+dendritic+cells+from+monocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro.</a> Eur J Immunol. 27, 431-441 (1997).</li>
<li>Zhou, L. J., Tedder, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD14%2B+blood+monocytes+can+differentiate+into+functionally+mature+CD83%2B+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells.</a> Proc Natl Acad Sci. 93, 2588-2592 (1996).</li>
<li>Caux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B70%2FB7-2+is+identical+to+CD86+and+is+the+major+functional+ligand+for+CD28+expressed+on+human+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells.</a> J Exp Med. 180, 1841-1847 (1994).</li>
<li>Caux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+human+dendritic+cells+through+CD40+cross-linking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking.</a> J Exp Med. 180, 1263-1272 (1994).</li>
<li>Fujii, S. i, Liu, K., Smith, C., Bonito, A. J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Linkage+of+Innate+to+Adaptive+Immunity+via+Maturing+Dendritic+Cells+In+Vivo+Requires+CD40+Ligation+in+Addition+to+Antigen+Presentation+and+CD80%2F86+Costimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The Linkage of Innate to Adaptive Immunity via Maturing Dendritic Cells In Vivo Requires CD40 Ligation in Addition to Antigen Presentation and CD80/86 Costimulation.</a> J Exp Med. 199, 1607-1618 (2004).</li>
<li>Mohammadi, A., Mehrzad, J., Mahmoudi, M., Schneider, M., Haghparast, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+culture+and+maturation+on+human+monocyte-derived+dendritic+cell+surface+markers%2C+necrosis+and+antigen+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+Histochem%22%5BJournal%5D)">Effect of culture and maturation on human monocyte-derived dendritic cell surface markers, necrosis and antigen binding.</a> Biotech Histochem. 90, 445-452 (2015).</li>
</ol>

Tüm yazarlar hiçbir rakip mali çıkar açıklamamaktadır.

izole edilmesi ve insan kanından MDDCs üretilmesi bilinen zorlukların göre, bu çalışmada MDDCs üretilmesi için iki köklü yöntemlerin bir karşılaştırma sağlamak için amaçlanmıştır. Kıyasla ilk yöntem, cam veya plastik (yapışma yöntemi) 21,22,27 uymaları monositlerin yeteneği yararlanarak MDDCs üretilmesi için iyi bilinen bir geleneksel bir yöntemdir. yapışma kullanım olup, etkili, hızlı ve düşük maliyetli ve karmaşık ekipman kullanımını gerektirmez. Ancak, bu sürecin bazı dezavantajları lenfosit kirlenme, düşü...

Dendritik hücreler (DC), doğal ve adaptif bağışıklık sistemlerinin temel aracılarıdır. Onlar primer immün yanıtları teşvik ve immünolojik hafıza gelişimini kolaylaştırmak için çalışır. Bu hücreler, antijen tutma, taşıma ve T hücre uyarılması için esas olarak sorumlu olan ve bu nedenle, DClerin .Manipulation farklı tedavi etmek için araştırma alanları çok çeşitli boyunca ve klinik ortamda yararlanılabilir 1 profesyonel antijen sunan hücreler (APC&#39;ler) olarak adlandırılır HIV 6,7, kanser 8 gibi enflamatuvar hastalıklar, oto-bağışıklık hastalıkları 9 ve alerjik tepkiler 10. DH&#39;ler ayrıca literatürde alkol bağımlılığı 11-14, ilaç bağımlılığı 13,15 ve HIV enfeksiyonu ve madde kötüye kullanımı, 16-19 kombinasyonu ile ilişkili bilinmeyen ve oluşum mekanizmaları çözmek için Madde Araştırma için kullanılmaktadır. Bu devam eden çalışmalar ve gelecekteki araştırma çalışmaları in immünoloji saha araştırması için son derece önemli DC&#39;ler in vitro nesil olun. Toplam kan tek çekirdekli hücreleri 20% 1 - Bununla birlikte, bir 0,1 teşkil insan kanından DH&#39;lerin izole edilmesine ile ilişkili çeşitli zorluklar bulunmaktadır. Bugüne kadar, DH&#39;lerin in vitro üretilmesi için iyi bilinen yöntemlerin bazıları, 22 ayırma manyetik aktif hücre, floresan aktive hücre sınıflandırma Monositler 21,22 plastik ya da cam yapışması, yoğunluk gradyanlı santrifüj 23, spesifik bir işaretleyici göre ayrılması oluşmaktadır 24, dekstran-kaplı manyetik nanopartiküller 25 ve tam otomatik negatif hücre seçimi 26 ile yüksek oranda saflaştırılmış monositlerin hızlı izolasyon kullanılarak CD14 + monositler pozitif seçim. Ancak, seçim en iyi yöntemi tartışmalıdır. Bu nedenle, DC oluşturma teknikleri geliştirmek için, çeşitli yöntemler hangi geliştirilmiştirBu hücrelerin saflığı önemli ölçüde, periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC), 27 ile izole edilmiş, saflaştırılmış CD34 + projenitör hücreleri ve monositler farklılaşmanın arttırılabilir. Önce belirtildiği gibi, monosit türevli dendritik hücreler (MDDCs) üretmek için yaygın olarak kullanılan bir ve popüler bir yöntem cam veya plastik (yapışma yöntemi) 21,22,27 uymaları monositlerin yeteneğini keşfetmek olduğunu. yapışma yöntemi, karmaşık ekipman kullanımının gerektirmeyen, hızlı ve basit bir yöntemdir. Ancak, bu sürecin bazı dezavantajları lenfosit kirlenme, düşük esneklik ve monosit geçici manipülasyon 28 arasındadır. Yapışma yönteme alternatif bir yöntem, özel olarak negatif seçim 26 tarafından PBMC&#39;lerden monositleri izole etmek için tasarlanmış olan bir insan monosit zenginleştirme kiti kullanılarak toplam PBMC&#39;lerden monositler manyetik izolasyondur. Bu işlem sırasında, istenmeyen hücrelere tetramerik ile çıkarılması için hedeflenirantikor komplekslerinden ayrılmakta ve dekstran-kaplı manyetik parçacıklar. Bu izolasyon yönteminin avantajı, istenmeyen etiketli hücreler hedef hücreler serbest sütun gerek olmadan yeni bir tüp içine boşaltılır edilebilir ise bir mıknatıs kullanılarak ayrıştırılmasıdır. Bugüne kadar, benzersiz bir hücre popülasyonu etiket spesifik monoklonal antikorların mevcudiyeti, manyetik ayırma tekniği ek bir yöntem, ancak immünoloji alanında az hücrelerin izolasyonu için bir zorunluluk değildir, sadece olmuştur. Örneğin, manyetik hücre gibi teknikler araştırma ve klinik uygulamaları 22,29 için yeni yaklaşımların gelişmesine olanak sağlamıştır piyasada mevcut paramanyetik MACS-nanopartiküller ile sıralama. Ayrıca, monosit bağlılık ve MACS teknoloji yöntemleri DC nesil karşılaştıran son araştırmalar monositler 22,30 ayrılmış MACS kullanarak daha yüksek bir DC saflık ve canlılığı ortaya koymuştur. Bu çalışma sunarticari bir insan monosit zenginleştirme kiti kullanılarak yapışma 1), monosit izolasyonu ve 2), monosit izolasyon negatif seçim kriteri: PBMC&#39;lerden izole monositlerde insan DH&#39;lerinin üretimi için iki yöntem arasındaki karşılaştırması. Bu çalışma, yapışma yöntemiyle izole edilmiş monositler ile karşılaştırıldığında monositlerin izole etmek için negatif seçim manyetik ayırma işlemi monosit yaşam kabiliyetinde önemli bir farklılıklar ile monositlerin yüksek verim oluşturur dair kanıt sağlar. Buna karşılık, yedi gün sonra, manyetik ayırma ile izole monositler MDDC canlılığı etkilemeden anlamlı olarak daha yüksek çoğalma kapasitesi ve çift pozitif (CD11c + / CD14 +) fenotip sentezleyen hücrelerin yüksek miktarda MDDCs ayrışmıştır. aynı anda çoğalan ve CD11c ayırma yöntemi edebilen monositleri üretmek için her iki tekniğin becerisi gösterir çünkü genel olarak, bu çalışma + Yukarıda atıfta bulunulan önceki çalışmalardan farklıyaşama yetenekleri tehlikeye sokulmadan kültür içinde yedi gün sonra MDDCs (&gt;% 70). Buna ek olarak, mevcut yaklaşım sitometri görüntüleme akışı ile farklı CD11c / CD14 MDDCs popülasyonlarının ilk kez karakterizasyonu sağlar. DC&#39;ler immünoloji alanında araştırma ile ilgili bir odak noktası rolü oynamaya beri elde edilir ve hangi yöntemleri in vitro onları izole ve kültür için nasıl kullanıldığını göz önüne alındığında Özetle, farklı parametreler dikkate alınmalıdır. Bu nedenle, bu çalışmada iki farklı monosit izolasyon yöntemleri ve nasıl bu yöntemler farklı olarak sonunda dendritik hücre canlılığı, proliferasyon ve fenotip etkileyen monosit canlılığını ve verimini etkileyen anlayışlar sağlamayı amaçlamaktadır. Bu bulgular immünoloji alanında büyük katkı sağlayacaktır ve DC izolasyonu, saflaştırılması ve karakterizasyonu ayrıntılı bir protokol sağlayacaktır.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td>RT'de kullanılmalıdır</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lizsing tamponu</td><td>Kalite Biyolojik</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 orta</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>22400-089</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik-Antimikotik (100x)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>RoboSep tamponu</td><td>StemCell</td><td>20104</td><td></td></tr><tr><td>EasySep İnsan monosit zenginleştirme kiti</td><td>StemCell</td><td>19059</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Otomatik hücre sayacı</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0101</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD4-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi lekesi (% 0.4)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 çok modlu okuyucu</td><td>Biotek</td><td>7131000</td><td></td></tr><tr><td>XTT Sodyum tuzu biyoreaktif (XTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X4626-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit biyoreaktif (DMS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tiazolil mavi tetrazolyum bromür (MTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>m5655-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0302</td><td></td></tr><tr><td>Fenazin Metosülfat (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9626-1G</td><td></td></tr><tr><td>İnaktive (HI) İnsan Serumu</td><td>Chemicon</td><td>S1-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Accuri C6 Akış Sitometresi</td><td>BD Accuri</td><td>653119</td><td></td></tr><tr><td>FlowSight Amnis Akış</td><td>Sitometresi EMD Millipore</td><td>100300</td><td></td></tr></tbody></table>

görüntüleme sitometrisi ile İnsan monosit türetilmiş dendritik hücrelerle karakterizasyonu: İki monosit İzolasyon protokoller arasında bir karşılaştırma

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Dendritik hücreler (DC'ler), lenfosit yanıtlarında, konak savunma mekanizmalarında ve inflamasyonun patogenezinde çok önemli bir rol oynayan bağışıklık sisteminin antijen sunan hücreleridir. DC'lerin izolasyonu ve incelenmesi, ayırt edici özellikleri nedeniyle biyolojik araştırmalarda önemli olmuştur. Bağışıklık sisteminin temel anahtar aracıları olmalarına rağmen, DC'ler kanda çok nadirdir ve toplam kan mononükleer hücrelerinin yaklaşık% 0.1 - 1'ini oluşturur. Bu nedenle, izolasyon yöntemleri için alternatifler, DC'lerin periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) izole edilen monositlerden farklılaşmasına dayanır. Basitlik, satın alınabilirlik, yüksek saflık ve yüksek hücre verimini birleştiren uygun izolasyon tekniklerinin kullanılması dikkate alınması zorunludur. Mevcut çalışmada, DC'lerin üretilmesi için iki farklı yöntem karşılaştırılacaktır. Monositler, manyetik ayırma prosedürü kullanılarak aderans veya negatif olarak zenginleştirildikten sonra IL-4 ve GM-CSF ile DC'lere farklılaştırıldı. Monosit ve MDDC canlılığı, proliferasyonu ve fenotipi, canlılık boyaları, MTT testi ve görüntüleme akış sitometrisi ile CD11c/CD14 yüzey belirteç analizi kullanılarak değerlendirildi. Manyetik ayırma yöntemi, adezyon yöntemiyle karşılaştırıldığında daha yüksek proliferatif kapasiteye sahip monositlerin önemli ölçüde daha yüksek bir yüzdesini vermesine rağmen, bulgular her iki tekniğin de kültürde yedi gün sonra canlı CD11c + MDDC'lere çoğalabilen ve farklılaşabilen monositleri aynı anda üretme yeteneğini göstermiştir. Her iki yöntem de %70'> CD11c+ MDDC verdi. Bu nedenle sonuçlarımız, insan DC'lerinin izolasyonu ve karakterizasyonu için güvenilir yöntemlerin geliştirilmesine katkıda bulunan içgörüler sağlar.

<html> Manyetik Ayırma ile Monosit Verim bağlılık Yöntemi ile Monosit Verimi Higher karşılaştırıldığında edilir PBMC&#39;ler ve monositlerin ayrılması izolasyon gün tripan mavisiyle çıkarma metodu kullanılarak Şekil 1 ekran PBMC ve monosit hücre sayımı sunulan veriler. manyetik ayırma ile izole monositler PBMC kadar yüzde 25 paya sahip olması ortalama bağlılık yöntemi ile izole monositler topla...

Bu çalışma, in vitro dendritik hücreler (DC'ler) elde etmek için iki farklı insan monosit izolasyonu yöntemini karşılaştırmaktadır. Monositler yapışma ile seçilir veya manyetik ayırma ile negatif olarak zenginleştirilir. Monosit verimi ve canlılığı ile MDDC canlılığı, proliferasyonu ve CD11c/CD14 yüzey marker ekspresyonu her iki yöntem arasında karşılaştırılacaktır.

Görüntüleme Sitometrisi ile İnsan Monosit türetilmiş dendritik hücrelerle Karakterizasyonu: İki Monosit İzolasyon Protokoller Arasında Bir Karşılaştırma

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Bu çalışmanın genel amacı, in vitro dendritik hücre üretimi için kullanılan iki farklı insan monosit izolasyon yöntemini karşılaştırmak ve elde edilen monosit kaynaklı popülasyonların CT11c, CT14 hücre yüzeyi ekspresyonunu görüntüleme akış sitometrisi ile karakterize etmektir. Bu monosit izolasyon protokolleri, araştırma ve klinik uygulamalar için insan dendritik hücrelerinin saflaştırılmasına yönelik güvenilir yöntemlerin geliştirilmesine katkıda bulunabilir. Bu protokollerin temel avantajı, insan monositlerinin izolasyonunu ve bunların canlı ve fonksiyonel monosit kaynaklı hücrelere farklılaşmasını kolaylaştırmalarıdır.Ek olarak, bu çalışma, monosit kaynaklı dendritik hücrelerin spesifik popülasyonunu tek hücreli görüntüleme akış sitometrisi ile karakterize eden ilk çalışmadır. Bu yöntem, diğer nadir hücrelerin, sonraki araştırma uygulamaları için yeterli verimde izole edilmesi amacıyla bir alternatif olarak da uygulanabilir. Uygun talimat ve deneyim olmadan kan örneklerinin güvenli bir şekilde işlenmesi zor olabileceğinden, bu yöntemlerin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşımaktadır.Kan örneğini, bir T75 flask içinde PBS ile bire bir oranda seyrelterek başlayın. Ardından, 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne 15 ml yoğunluk gradyan çözeltisi ekleyin ve seyreltilmiş kanın 25 ila 30 ml'sini gradyanın üzerine dikkatlice katmanlar halinde yerleştirin. Periferik kan mononükleer hücrelerinin uygun şekilde ayrılmasını sağlamak için, kanı yoğunluk gradyan çözeltisinin üzerine hızlıca ancak dikkatlice ve katmanları karıştırmadan yükleyin.Hücreleri santrifügasyonla ayırın ve ardından beyaz kan hücresi ara katmanını yeni bir 50 mililitre konik tüpe aktarın. Hücreleri iki kez PBS ile yıkayın ve son peleti 10 mililitre amonyum klorür potasyum lizleme tamponu içinde 4 derece santigrat sıcaklıkta 15 dakika boyunca yeniden süspande edin. Ardından hücreleri iki kez daha PBS ile yıkayın.Monositleri yapışma yöntemiyle izole etmek için, elde edilen PBMC peletinden her 10 ml tam besiyeri başına 5 × 10⁷ hücreyi yeni bir T75 flask içinde, nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C ve %5 CO2 koşullarında iki saat boyunca kültüre edin. İnkübasyonun sonunda, yapışmayan yüzen hücreleri uzaklaştırın ve yapışan hücreleri PBS ile iki kez nazikçe yıkayın. Ardından, yapışan hücreleri insan GMCSF ve IL4 ile desteklenmiş tam hücre kültürü besiyeri ile besleyin ve kültürü beş ila yedi gün boyunca inkübatöre geri yerleştirin.Monositleri manyetik ayırma yoluyla izole etmek için, yoğunluk gradyanı ayırmasıyla PBMC toplandıktan sonra lökosit tabakasını beş mililitrelik bir polistiren tüpe aktarın ve hücreleri 5 × 10⁷ hücre/mL konsantrasyonunda PBS içinde yeniden süspande edin. Ardından, hücrelere mililitre başına 50 µL insan monosit zenginleştirme kokteyli ekleyip karıştırın ve hücreleri kokteylele birlikte 4 °C'de 10 dakika inkübe edin. Daha sonra, hücrelerin mililitresi başına 50 µL manyetik partikül ekleyip dikkatlice karıştırın ve hücreleri 4 °C'de beş dakika inkübe edin.İkinci inkübasyonun sonunda, toplam hacmi iki virgül beş mililitreye tamamlamak için hücrelere PBS ekleyin ve pipetleme yöntemiyle iki ila üç kez karıştırın. Ardından, polistiren tüpü oda sıcaklığında uygun bir manyetik düzeneğe yerleştirin. İki buçuk dakika sonra, tüp hala mıknatıs içindeyken, saflaştırılmış monosit fraksiyonunu yeni bir 15 mililitrelik konik tüpe boşaltın.Ardından, saflaştırılmış monositleri, az önce gösterildiği gibi GMCSF ve IL4 ile takviye edilmiş hücre kültürü ortamında beş ila yedi gün boyunca kültüre edin. Yedi günlük farklılaşmanın ardından, monosit kaynaklı dendritik hücrelerden 1x10⁶ hücrelik alikotları uygun sayıda 1,5 ml'lik tüplere dağıtın ve spesifik olmayan bağlanmaları önlemek için her örneğe 50 µL ısı ile inaktive edilmiş insan serumu ekleyin. 10 dakika sonra hücreleri santrifüjleyin ve pelletleri, ışıkça korunmuş olarak 4 °C'de 20 dakika boyunca uygun floresan konjuge primer antikorlar içinde yeniden süspande edin.Ardından hücreleri bir mililitre PBS ile iki kez yıkayın ve peletleri, her 10⁶ hücre için 100 µL PBS içinde yeniden süspande edin. Analizden hemen önce, her tüpe bir mikrolitre DAPI ekleyin. Sonrasında, numuneleri üreticinin talimatlarına uygun olarak tek hücre görüntüleme akış sitometresinde okuyun.Ortalamada, adezyon yöntemiyle izole edilen monositler toplam periferik kan mononükleer hücresi veya PBMC popülasyonunun yaklaşık yüzde altı virgül ikisini oluştururken, manyetik ayırma ile izole edilen monositler toplam PBMC'nin yüzde 25'ine kadarını oluşturur. Her iki yöntemle izole edilen monositler eşit derecede canlıdır. Her iki yöntemle saflaştırılmış monositlerden farklılaştırılan MDDC'ler, öncelikle toplam tek hücreler içindeki DAPI negatif veya canlı hücreler üzerinden kapılandı (gate edildi), ardından her bir hücre popülasyonun kapılaması gerçekleştirildi.Her iki izolasyon yöntemi de düşük bir tekil CD14 pozitif popülasyonu sağlamış ve her iki yöntem de yüksek bir toplam CD11c pozitif popülasyonu vermiştir. Tüm CD11c pozitif hücreler üzerinde ileri fenotipik analiz yapılmış ve manyetik izolasyon daha yüksek oranda çift pozitif CD11c pozitif CD14 pozitif hücre vermesine rağmen, bu etki yapışma yöntemi ile karşılaştırıldığında anlamlı bulunmamıştır. Bu çift pozitif CD11c pozitif, CD14 pozitif hücreler, CD14 monositik belirtecini henüz kaybetmemiş erken evre diferansiye MDDC'ler olabilir.Tekli CD11c pozitif hücreler analiz edildiğinde, adezyon yöntemi en yüksek CD11c pozitif, CD14 negatif hücre verimini sağlar. Bu tekli pozitif hücreler, geç evre diferansiye MDDC'ler olabilir. Adezyon ve manyetik izolasyon teknikleri, uygun şekilde uygulandığında ve uzmanlaşıldığında sırasıyla üç ila dört ve bir ila iki saat içinde tamamlanabilir.Bu prosedürü uygularken, besiyeri yenilendiğinde her 48 saatte bir taze dendritik hücre farklılaşma sitokinlerinin bulundurulması gerektiğini unutmamak önemlidir. Kan gibi biyotehlikeli sıvılarla çalışmak son derece zararlı olabilir; bu prosedürler gerçekleştirilirken her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman ve imha yöntemleri kullanılmalıdır. Bu çalışma, immünoloji alanındaki araştırmacıların terapötik tedavi için insan monositleri ve dendritik hücrelerin kullanımıyla ilgili araştırmalar yapmalarının önünü açmaktadır.Bu videoyu izledikten sonra, in vitro ortamda monosit türevli farklı hücre popülasyonları üretmek için insan monosit izolasyonunun nasıl optimize edileceği konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız.

characterization-human-monocyte-derived-dendritic-cells-imaging-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

İnsan makrofaj üretimi için basit ve etkin bir protokol sunuyoruz. İnce beyaz kat çifte yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile işlenir ve izole edilmiş monositlerin, sonra Teflon kaplı bir hücre kültürü torbalarda makrofajlara ayrılır. Bu makrofaj verim maksimize ve daha sonraki deneyler için hücre hasat kolaylaştırır.

İnsan Çift Gradient Santrifüj ile Monositlerinde ve teflon kaplı Hücre Kültürü Çantalar Makrofagların Onların Farklılaşma İzolasyonu

Burada, insan anti-pıhtılaşmış kanının yoğunluk gradyanlı santrifüjlenmesinden sonra periferik kan mononükleer hücrelerinden manyetik boncuk ayrılması ile monositlerin nasıl izole edildiğini gösteriyoruz. 5 günlük inkübasyonun ardından, insan monositleri olgunlaşmamış dendritik hücrelere ayrılır ve klinik olmayan bir ortamda deneysel prosedürler için hazır hale gelir.

Tüm kan İnsan monosit türevli dendritik hücrelerin oluşumu

Bu protokol, akış sitometrisi ile yetişkin fare merkezi sinir sisteminde makrofaj alt popülasyonlarının bir analizini sağlar ve bu hücrelerin eksprese ettiği çoklu belirteçlerin çalışması için yararlıdır.

Akış Sitometresi ile Merkezi Sinir Sisteminden Mikroglia ve Monosit Türevi Makrofajların Analizi

Burada monosit alt kümeleri tam kan akış sitometresi tarafından karakterize için bir iletişim kuralı mevcut. Bu nasıl alt kümeleri kapı ve onların ifade yüzey işaretlerinin değerlendirmek özetleyen ve M1 (iltihabi) ve M2 işaretleri (anti-inflamatuar) ifadesi değerlendirme bir örnek vererek içerir.

İnsan monosit alt kümeleri tam kan tarafından karakterizasyonu Akış Sitometresi Analizi

Burada, monosit subpopulation altında akış tüp bebek belirli yüzey işaretleyicileri ve confocal floresan mikroskopi kullanımı ile ticareti ölçer entegre bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralı diğer belirli yüzey işaretçileri kullanarak diğer lökosit alt türlerinden profil olarak sıralı işe alma adımları de keşfetmek için kullanılabilir.

Monosit altgrupları Vitro akışında altında alımı eş zamanlı çalışma

Burada sunulan izole etmek için optimize edilmiş bir protokoldür, culturing, transfecting, ve HIV enfekte bireyler ve sağlıklı kontroller insan birincil monositayırt.

Birincil İnsan Monositlerinin İzolasyon, Transfeksiyon ve Kültürü

Diseke implantlardan hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrisi ile karakterizasyonu, implantlara karşı immün yanıt paterninin anlaşılmasına önemli ölçüde katkıda bulunabilir. Bu makale, diseke implantlardan hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrik analizi için boyanması için kesin bir yöntemi açıklamaktadır.

Diseke İmplant Dokularının İmmün Fonksiyon Analizi için Yüksek Boyutluluk Akış Sitometrisi

Burada, 10 ng / mL GM-CSF / IL-4 ile 7 günlük kültürden sonra farelerden yüksek saflıkta kemik iliği kaynaklı dendritik hücreleri izole etmek ve üretmek için ekonomik ve etkili bir yöntem sunuyoruz.

Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücrelerin Farelerden İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi için Ekonomik ve Verimli Protokol

Bir sialidaz tedavisi kullanılarak izole edilmiş periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) de-sialillenmiş insan monosit türevli dendritik hücreler (mo-DC'ler) oluşturmak için benzersiz, kapsamlı bir protokol sunulmaktadır. Ayrıca, mo-DC'lerin fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonunu değerlendirmek ve sialidaz tedavisinin mo-DC'lerin olgunlaşma seviyesini nasıl iyileştirdiğini değerlendirmek için yöntemler açıklanmaktadır.

Farklı Sialillenmiş Fenotiplere Sahip Monosit Kaynaklı Dendritik Hücrelerin Üretimi

Monositler ve makrofajlar, sağlık ve hastalık için çok önemli olan çok plastik ve yeniden programlanabilir bağışıklık hücreleridir. Belirli farklılaşma programları ve fenotipleri benimseyerek çok çeşitli uyaranları algılar ve bunlara yanıt verirler. Makrofaj polarizasyonunu ve yeniden programlamayı incelemek için bir in-vitro modeli standartlaştırdık ve araştırma için değerli bir araç sağladık.

İnsan Monositinden Türetilmiş Makrofajların İn vitro Tahliller için Yeniden Programlanması

Farmakolojik ajanların naif monosit türevli dendritik hücrelerden in vitro olarak tolerojenik dendritik hücreler üretme kapasitesini değerlendirmek ve otolog düzenleyici T hücresi üretimi ile potansiyellerini doğrulamak için bir prosedür tanımladık.

İnsan CD14+ Monositlerinden Tolerojenik Dendritik Hücrelerin Üretilmesi için İmmünomodülatör Ajanları Test Etmek İçin Basit ve Etkili Bir Yöntem

Öğrenin, insan monosit izolasyon yöntemlerini dendritik hücre üretimi için karşılaştırın ve görüntüleme akış sitometrisiyle hücre yüzey belirteçlerini analiz edin. Bu yöntemler immünoloji araştırmaları için güvenilir hücre saflaştırma sağlar.

Görüntüleme Sitometrisi ile İnsan Monosit türetilmiş dendritik hücrelerle Karakterizasyonu: İki Monosit İzolasyon Protokoller Arasında Bir Karşılaştırma (Video) | JoVE Journal

Görüntüleme Sitometrisi ile İnsan Monosit türetilmiş dendritik hücrelerle Karakterizasyonu: İki Monosit İzolasyon Protokoller Arasında Bir Karşılaştırma

Daha fazla video keşfet