Name: Hücre-Hücre İletişim Yokluğunda iki Hücresel Türleri Ekleme Co-kültür Sisteminin Geliştirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Öğrenin, geçirgen membranlı insertler kullanarak hücre-hücre teması olmadan parakrin sinyalleşmeyi incelemek için eş kültür sistemi geliştirmeyi. Bu yöntem, salgılanan çözünür faktörlerin etkilerini değerlendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Kanada tarafından MGM'ye verilen bir hibe ile finanse edilmiştir. JR, NSERC-Vanier öğrenci bursiyeridir.

Not: memeli hücresi kültürü için gerekli olan, aşağıdaki adımların her biri, bir laminar akış başlığı içinde steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir. Buna ek olarak, optimum steril hücre ekimi için genel kurallar uygulanır, örneğin., Ipuçları her zaman onlar, çapraz kontaminasyon neden zaman hücrelerinin miktarını azaltarak olabilir atarak düzgün, tüm medya değişiklikleri gerçekleştirme ama nazikçe tüm karıştırarak zaman havaya maruz kalan hücre süspansiyonları Ayrıca, ekler, özel işlem gerektiren plasticware bir tür vb onların homojen pipetleme sağlamak için. ekler manipüle edildiği anda Birincisi, kolayca gözyaşları ve bu nedenle deney tehlikeye atabilecek kırılgan membran, dokunmaktan kaçının. membran delme veya yapışık hücreler ayrışan bir riski olduğu için aynı zamanda, hücre kültür ortamı vakum aspirasyonun yapılması için uygun değildir. Daha sonra, uçlar ve böylece, dikkatli olduğunda mo kullanılması gerekir, çukurlu doku kültürü plakasına gevşek asmak veplasticware Ving veya yapışık hücrelere dissociating önlemek için pipetlerken zaman. büyük gözenek boyutları ile ekler kullanarak Buna ek olarak, hücre kültürü ortamı, bu nedenle, sıklıkla sıvı seviyesinin izlenmesi önemlidir, membrandan girer ve bu olasılığı vardır. Son olarak, aşağıdaki protokol yapışık hücreler için tasarlanmış ve süspansiyon hücreleri için uygun olmak için küçük değişiklikler gerektirir unutmayın. insert ko-kültür deneyler için 1. Genel kurallar <ol><li> ekler de tohumlama hücre tipi 1. <ol><li> kendi ambalajından ekler kakışıyor. </li><li> Uygun boyut boş çukurlu doku kültürü plakasına uçlar yerleştirin. cımbız kullanarak ucun üst kenarı, yani kavrama yapmak. </li><li> eki iyileştirmek ve yapışan hücrelerin yayılması tohumlanmasından önce hücre kültür ortamı ile uçlar koşulu. Bunu yapmak için, hücre kültürü Mediu&#39;nun zarın tüm yüzeyini kaplayanMikropipet kullanıyorum. NOT: Gerekli olduğu kadar çok uçlar için bunu yapın. </li><li> Plaka kapağını çıkarın ve aynı koşullar altında en az 1 saat ya da O / N inkübe (genellikle 37 ° C,% 5-10 CO2). </li><li> ekler klimalı zaman, bir mikropipet kullanarak hücre kültür ortamında bütün çıkarın. kullanılan orta atın. </li><li> çok oyuklu bir plaka ile aynı şekilde taze hücre kültür ortamı içinde tohum hücre tipi 1.. Bunu yapmak için, bir mikropipet ile hücre süspansiyonu uygun bir hacmi çizip ekine sıvısının dağıtılması. NOT: Gereken gibi birçok ekler hazırlayın. </li><li> Bütün ekler tohumlama sonra, yavaşça hücreler eşit dağıtmak için daha sonra ileri geri, sol ve sağ plaka sallayın. Bu hücreler ekler merkezinde birikmesine neden olacağından, dairesel hareketler yapmaktan kaçının. </li><li> plaka kapağı yerleştirin ve hücresel gereksinimleri (genellikle 37 ° C olarak başına,% 5-10 CO tarafından belirtildiği gibi kuluçkaya <sub&gt; 2). </li></ol></li><li> çukurlu doku kültür plakaları içinde Tohum hücre tipi 2. <ol><li> Bölüm 1 &#39;e göre olan yeni hücre kültürü ortamı içinde tohum hücre tipi 2.. </li><li> insertlerin sayısı için gerekli olduğu kadar çok sayıda çukur hazırlayın. Hücreler eşit kuyularda dağılmasını sağlamak için adım 1.1.7 gibi plakası) sallayın. </li><li> Plaka kapağı yerleştirin ve aynı koşullar altında inkübe (genellikle 37 ° C,% 5-10 CO2). </li></ol></li><li> ekler ferahlatıcı ortam <ol><li> Mikropipet kullanarak, hücre tipi 1. ihtiva eden ekler, kısmen ya da hücre kültür aracı kaldırmak. kullanılan orta atın. </li><li> Taze hücre kültür ortamında uygun bir hacmi çizin. Yavaşça insertin iç duvarı üzerinde ucu kalan yavaşça hücre kültür ortamı dağıtmak. </li><li> plaka kapağı yerleştirin ve adım 1.1.4 başına kuluçkaya yatmaktadır. </li></ol></li><li> çukurlu doku kültür plakaları içinde serinletici orta <ol><li> Bir micropi kullanılmasıPette, kısmen ya da hücre tipi 2. içeren oyuklara hücre kültür ortamının kaldırmak. kullanılan orta atın. </li><li> Taze hücre kültür ortamında uygun bir hacmi çizin. oyuk iç duvarı üzerinde ucu istirahat yavaşça hücre kültür ortamı dağıtmak. </li><li> plaka kapağı yerleştirin ve daha önce kurulmuş hücre kültürü protokollerine göre kuluçkaya yatmaktadır. </li></ol></li><li> Hücre tipi 2. içeren çukurlu doku kültürü plakalarına hücre tipi 1. içeren insert aktarılması. NOT: Her iki hücre tipleri uygun büyüme aşamasına ulaştığınızda bu adımı gerçekleştirin. <ol><li> Daha önce adımlar 1.3) ve 1.4 de tarif edildiği gibi oyuklara eklediği aktarılması önce), gerekli ortam değişiklik yapın. Not: Bu noktada, ekleme, üretici talimatlarına göre belirlenen, her iki bölme içinde uygun ortam hacimleri dağıtılması için önemlidir. </li><li> kavrama, hücre t içeren bir ekin üst kenarını cımbız kullanarak1. ype ve yavaşça 2 uygun iyi içeren hücre tipi # yerleştirin. </li><li> Tüm ekler aktardıktan sonra, insert zarının altında hava kabarcığı olup olmadığını kontrol edin. NOT: Hava kabarcıkları ucun zarından herhangi değiştirilmesini engelleyecek ve tüm deney tehlikeye atabilir. </li><li> Hava kabarcıkları varsa, çok nazikçe iyi kullanan cımbız gelen parçayı kaldırın ve geri hücre kültürü ortamında atılmak. kabarcıklar kaybolur. onlar hala varsa, bir açıda geri hücre kültür ortamına ekler daldırma yavaşça deneyin. NOT: vurmak ya da yapışık hücrelere dissociating önlemek için ekler karıştırın etmeyin. </li><li> tüm hava kabarcıklarını kaldırılması ve her iki bölümlerinde medya hacimleri, plaka kapağı yerleştirin ve inkübe olduğunu kontrol ettikten sonra. </li></ol></li><li> bir ko-kültür sisteminde serinletici ortam NOT: Membran kolayca ekleme arasında medya alışverişi izin verse ve iyi, orta serinletici yapılırTek başına difüzyon ile üst ve alt bölümlerinde dengeye ulaşmak için gerekli zamandan beri hem bölmeler oldukça uzun olabilir. <ol><li> Hücre tipi 1. ihtiva eden ekler de serinletici ortamı adım 1.3) de aynı şekilde yapılır. </li><li> Hücre tipi 2. içeren kuyularda orta yenilemek için hafifçe pipet karşılamak için yeterince geniş bir alan oluşturmak için yan ekleme kaydırın. ) Adım 1.4 olarak orta yenileyin. </li><li> ) Hava kabarcıklarının varlığı için kontrol edin ve 1.5.5 arasındaki adımları 1.5.3 başına hacim) doğrulayın. </li></ol></li></ol> 2. Örnek: nöronal PC12 hücreleri üzerindeki LPS aktive N9 mikroglia tarafından salgılanan sitokinlerin etkilerini ölçen Not: Aşağıdaki adımlar de belirli bir şişeye, ve çanak boyutları için tasarlanmıştır. Ancak, protokol herhangi plasticware boyutları için özelleştirilebilir. medya ve kompozisyon malzemeler Tablosuna bakınız. <ol><li> Tohumlama ve çoklu PC12 hücreleri ayırtoyuklu doku kültürü plakaları <ol><li> Sıcak rutin PC12 hücre kültür ortamı, 37 ° C su banyosu içinde PC12 farklılaşma orta ve tripsin-EDTA. </li><li> 75 cm 2 şişeden% 60-80 izdiham PC12 hücreleri kullanın. </li><li> 15 mm&#39;lik bir Pasteur pipeti ile bir şişe içinde, tüm hücre kültür ortamında vakum aspirasyonun yapılması. </li><li> Yavaşça steril fosfat tamponlu tuzlu su, 5 ml ile hücre mono tabakasının yıkayın ve Pasteur pipeti ile sıvıyı ayırın. Bu aşamada hücreleri ayırmak için dikkatli olun. </li><li> Tripsin-EDTA, 3 ml ile hücre mono tabakasının kapatın ve 37 ° C&#39;de 2-3 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> tüm hücreleri mikroskop altında müstakil emin olun. Çok az sayıda hücre yüzen ise, 5 dakikalık bir süre için daha uzun bir süre için inkübe edilir. </li><li> Tripsin-EDTA inaktive etmek üzere rutin PC12 hücre kültür ortamında 10 ml. </li><li> En hücreler o alttan ayrışmış emin yaparken bir 10 ml pipet ile hafifçe çiğnemekşişeye f. hücre süspansiyonu hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının. </li><li> Aynı 10 mi pipet ile 50 ml santrifüj tüpü içinde hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> 3.200 x g&#39;de 1 dakika boyunca santrifüj </li><li> pelet rahatsız etmemek için özen gösterilirken Pasteur pipeti ile süpernatant atın. </li><li> 10 ml&#39;lik bir pipet ile rutin PC12 hücre kültür ortamında 10 ml. NOT: pelet normalden daha küçük ya da büyük olması durumunda bu hacim ayarlanabilir. </li><li> Pelet homojenize aynı 10 mi pipet ile toz haline getirin. PC12 hücreleri genellikle yukarı pipetle en az 20 yüzden bir araya gelme ve gerekli downare. NOT: dinç öğütülerek gerekli olmakla birlikte, hücre süspansiyonu hava kabarcıkları oluşturarak kaçının. </li><li> 1.5 ml tüp içinde, tripan mavisi hücre süspansiyonu uygun bir seyreltme hazırlar. Daha önce kurulmuş protokollere 74 göre bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. </li><li> Ayrı bir 50 ml tüp içinde, bir hücre süspansiyonu bölünmüşPC12 farklılaşma ortamı ile 24 oyuklu plaka (30,000 ¢ / cm2, de üreticinin protokolüne uygun olarak her 0.6 mi) kuyu tohumlama için seyreltilmiş hücre süspansiyonu uygun olan elde edildi. Not: Daha önceki çalışmalarda protokolleri 75 tarafından belirtildiği gibi, 24 oyuklu bir plaka, daha önce kollajen ile kaplanmalıdır. </li><li> iyi bir mikropipet kullanarak başına hücre süspansiyonu 0.6 ml dağıtın. </li><li> tüm kuyuları numaralı seribaşı olduğunda,) adım 1.1.7 deki gibi plaka sallayın. </li><li> PC12 hücrelerinin diferansiyasyon, ko-kültür deneyleri yapmadan önce PC12 farklılaşma ortamda 15,16 bir% 5 CO2 nemli bir atmosferde 37 ° C&#39;de 7-9 gün süre ile 24 oyuklu plakalar inkübe izin verilmesi. </li><li> Sıvının yarısının çıkarılması ve taze PY12 farklılaştırma ortamının eşit hacimde değiştirerek, her gün ortam değişiklikleri gerçekleştirme. </li></ol></li><li> ekler de N9 mikroglia tohumlama ve LPS ile tedavi <ol><li> Bir gün ko-kültür deneyleri yapmadan önce, 1.1.4 adımda 1.1.1) sonra, hücre yapışmasını optimize etmek için rutin N9 hücre kültür ortamı ile PTFE 0.4 um gözenekli ekler ön tedavi) </li><li> 37 ° C bir su banyosunda ılık rutin N9 hücre kültür ortamı ve tripsin-EDTA. </li><li> Bu sırada, daha sonra kullanılmak üzere, 1.5 ml bir tüp içinde LPS&#39;nin yaklaşık 10 mg ağırlığında. NOT: LPS güçlü bir pro-inflamatuar endotoksin ve özellikle güvenlik önlemleri, gözlük, eldiven gerektirir ve bir partikül maske şiddetle tavsiye edilir beri. </li><li> 75 cm 2 şişeden% 80-90 izdiham N9 hücreleri kullanın. </li><li> ) 2.1.14 adımları 2.1.3) izleyin. Her zaman rutin N9 hücre kültür ortamı yerine rutin PC12 hücre kültür ortamı kullanın. Ayrıca) N9 mikroglia kadar PC12 hücreleri gibi birlikte çok daha az pipetleme yukarı kümelenir yoktur ve aşağı adım 2.1.13 gerekli olabileceğini unutmayın. </li><li> Ayrı bir 50 ml tüp içinde, N9 hücre kültürü ortamı ile bir hücre süspansiyonu O split24 oyuklu plakalar içinde tutmak için tasarlanmış ekler (60,000 ¢ / cm2, üreticinin protokolüne uygun olarak uç başına 0.05 mi, zar yüzeyi alanı için üretici bilgileri) tohumlama için uygun bir seyreltilmiş hücre süspansiyonu btain. Not: Bu Eklemelerimin üretici tarafından kollajen ile kaplanır ve hücre yapışması için optimize edilmiştir. </li><li> bir mikropipet kullanarak uç başına hücre süspansiyonu 0.05 ml dağıtın. </li><li> Tüm ekler numaralı seribaşı olduğunda,) adım 1.1.7 deki gibi plaka sallayın. </li><li> 4 ug 2 ug / ml / ml, 1 ug / ml çalışma solüsyonlar elde etmek için N9 işleme ortamı kullanılarak LPS&#39;nin seri dilüsyonları gerçekleştirin. </li><li> Pipet 0.05 ila 2 mg / ml bir nihai seyreltme elde etmek üzere bir insertlerin grubu 4 ug / ml çalışma çözeltisi ilave edildi. </li><li> farklı set ekler diğer iki çalışma çözümleri için yineleyin 2.2.10), / ml ve 0.5 ug / ml 1 ug son dilüsyonları elde edilmiştir. </li><li> İçindeko-kültür deneyleri yapmadan önce LPS ile N9 Mikroglia aktivitesi sağlamak için% 5 CO2 nemli bir atmosferde 37 ° C&#39;de 24 saat boyunca ek içeren plakalar cubate. </li></ol></li><li> Co-yetiştirilmesi N9 mikroglia ile nöronal PC12 hücreleri <ol><li> PC12 hücrelerinin farklılaşma 7-9 gün sonra, 37 ° C bir su banyosunda ılık N9 muamele ortamı ve PC12 muamele ortamı ile LPS ile kuluçkalamadan 24 saat sonra N9 mikroglia aktive eder. </li><li> N9 muamele ortamı içinde 0.1 ml, tüm kullanılan ortam yerine adım 1.3) &#39;deki gibi N9 mikroglia için toplam Orta değişiklik yapın. Her insert.This için bunu yapın ekler sadece aktif N9 mikroglia bırakarak, LPS tüm izlerini kaldırmak için gereklidir. </li><li> ) Adım 1.4 olarak nöronal PC12 hücreleri için toplam orta değişikliği gerçekleştirin. % 5 CO2 nemli bir atmosferde 37 ° C&#39;de 24 saat veya 48 saat boyunca, N9-PY12 ko-kültürler) adım 1.5 olarak 24 oyuklu plakalara ekler transfer .Incubate. </li><li> 24 sonrasısaat veya 48 saat, süpernatan ve / veya sitotoksisite, enzime bağlı immünosorbent tahlil için hücreler (ELISA), Western blot ya da diğer tayinleri hasat edilir. </li></ol></li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Herhangi bir ekleme ko-kültür sistemi deney en kritik adım aslında kullanmak için uygun parçayı seçiminde yaşıyor. Gözenek büyüklüğü ve membran malzemesi ekilmiş olan hücre türü ve deney amacı dikkate unutulmadan, ayrıntılı göz önüne alınmalıdır. Örneğin, chemotaxic deneyler, hücre-hücre temas yokluğunda salgılanan çözünür faktörlerin neden olduğu hücre davranışı modülasyon analiz hücre birleşik kültürlerinden daha membran aynı tip kullanabilir. Hücre göçü ve hücre-hücre temasını engelleyecek, hücre göçü izin vermek içi...

In vitro doku, organ veya sistemlerin çalışma çok hücreli organizmaları oluşturan çeşitli hücresel alt tipleri arasındaki mevcut çok karmaşık ilişkileri kolaylaştırmak için bir girişimdir. Nitekim, in vitro çalışmalar mümkün tek hücre popülasyonlarının ayrıntılı bir anlayış elde etmek için yapmak. 1) kolayca hücresel ortamı manipüle 2) yeteneği hücresel etkileşimleri azaltılmış ve: in vitro deneylerde iletken iki temel avantajı vardır. Bu nedenle, bu iki avantajı izin bilim adamları, tüm organizmalarda dış etkilerin sonuçları düzenleyen potensitesi, in vivo spesifik hücre tiplerinin davranışını tahmin etmek. Bu anlamda, in vitro hücre kültürü genellikle temel ve uygulamalı yaşam bilimleri bağlayan bir köprü görevi görür. Bununla birlikte, in vitro çalışma birkaç dezavantajları da vardır, en önemlisi belli bir rezervasyon fizyolojik yaşamak olabilir varlık olduğunugözlenen fenotipleri al alaka. Gerçekten de, tek bir hücre tipi, bir kap içinde büyütüldüğü zaman, kültür bir değişik ölçüde kaybeder, diğer hücre tipleri, doku ve menşe organizmanın ve çapa içinden hümoral ortam katkısı ile hücre-hücre bağlantıları bunu etkin doku hücre fonksiyonu için bazen çok önemli bir belirli üç boyutlu yapıyı korumak için. Hücre-hücre ilişkileri sorunu karışık kültür teknikleri geliştirilmesi yolu ile ele alınmıştır. Bu yöntemde, iki ya da daha fazla hücre popülasyonları aynı kültür kabı içinde bir araya büyütülür. Ancak, bu karışık kültürler önemli sakıncaları taşımaktadır. Bir yandan, bazı hücre alt tipi fiziksel kaynaklı doku birbiriyle etkileşmeyen ve salgılanan çözünür faktörlerin ve yakın reseptörleri tarafından sürekli parakrin iletişim itimat. Bu yakın sitokin sinyal bağımlı enflamatuvar süreçler için de geçerlidir. Karışık c&#39;deultures, fiziksel etkileşimleri kaçınılmaz ve imkansız değişmiş sonuçlar verebilir hücre-hücre temas yokluğunda parakrin iletişim çalışma yapmak. Öte yandan, karışık bir popülasyon içinden hücreye özel yorumlara elde sonuçları önemli ölçüde etkileyebilecek sert ayırma tekniklerinin kullanımı olmadan olanaksız hale gelir. Bu önemli sorunları çözmek için, şartlandırılmış medya kullanımı bölümlere kültür ve parakrin sinyalizasyon çalışması için izin veren bir teknik olarak geliştirilmiştir. Bu yöntem, hücrelerin bir popülasyonu içeren tüpler bir hücre tipi, bu şekilde durumunu adlandırılmış ortamının üstte yüzen transferini gerektirir. Bununla birlikte, önemli bir dezavantajı, kısa ömürlü moleküllerin hücre ikinci nüfusun oyuklarına transfer edilmesi şartına ortam içinde yeterince uzun süre hayatta kalmamasıdır. Hatta uzun ömürlü moleküller büyük ölçüde nedeniyle difüzyon zamanla seyreltilmiş edilecektir. Bundan başka, her iki hücrepopülasyonlar sadece tek yönlü parakrin iletişim ziyade aktif çift yönlü iletişim katılmak. Bu da in vivo var gibi doğru çok hücreli ilişkileri yeniden hayati önem taşımaktadır geribildirim sinyalizasyon olmaması yol açar. Bunun bir sonucu olarak ve daha iyi in vitro hücre ortamında in vivo koşullarında orijinal simüle etmek için ihtiyacı ile, hücre kültürü teknikleri çeşitli gelişmeler yılda elde edilmiştir. En önemli gelişmeler biri 1953 yılında Grobstein tarafından ilk defa kullanılan hücre kültürleri bölümlere yönelik mikro gözenekli membran ile geçirgen desteklerin kullanımı olmuştur 1. Böyle geçirgen destekler çok sayıda hücre tiplerini barındırmak için ve kullanılacak yılda uyarlanmış olan çeşitli uygulamalarda kullanılır. Günümüzde, bu desteklerin bir multiwell doku kültürü plaka veya Circu kuyulara dinlenmek için tasarlanmış gibi içi boş ekler varlar yemekler. Bir ko-kültür sisteminde, uç oyuk ise bir hücre türü içeren ya da tabak da vücut sıvısı ortamı (Şekil 1) iki farklı hücre popülasyonlarının katkı çalışma sağlayan diğer hücre popülasyonu içerir. Bunun bir sonucu olarak, (apikal salgılama ya da sinyal alımı vs bazolateral), hücre kutup ve böylece karışık kültürler ve koşullandırılmış ortam tekniklere kıyasla uç ko-kültür sistemleri önemli bir avantaj kazandıran, korunur. Membran malzemelerin çeşitli türleri mevcuttur en yaygın olanları olan polyester (PET), polikarbonat (PC) veya kollajen kaplı politetrafloroetilen (PTFE), bunlar 0.4 um ila 12.0 um arasında değişen farklı gözenek boyutları vardır ve. malzeme ve delik boyutlarının Bu çeşitler ile sınırlı değildir kullanan aşağıdaki için farklı seviyelerde elverişli olmaları optik özellikleri, membran kalınlığı ve hücre yapışmasına alakalı değişken özellik uygulayan insert tayfı sunar: -ders çalışıyorHücre farklılaşması, embriyonik gelişim, tümör metastazı ve geçirgen membran vasıtasıyla chemotaxic deneyleri ile yara iyileşmesi; epitel ya da endotel mono tabakaları yoluyla ulaşım değerlendirerek ilaç penetrasyonunu -evaluating geçirgen desteklerde kültüre ve; intikallerde hücresi ko-kültürler, hücre-hücre temas yokluğunda salgılanan çözünür faktörlerin neden olduğu hücre davranışı modülasyonlar analiz. Bu çalışmanın amacı, bir ekleme ko-kültür sistemi kullanılarak hücre-hücre temas yokluğunda salgılanan çözünür faktörler aracılık ettiği hücresel değişiklikleri değerlendirmek için yukarıda belirtilen üçüncü fonksiyon yerine getirmek için, genel yöntem yönergelere tanımlamaktır. Araştırmanın Birkaç farklı alanları hücre popülasyonları üzerinde salgılanan çözünür faktörlerin etkisiyle ilgili soruları cevaplamak için insert ko-kültür sistemlerinin kullanımını sağlamak. çeşitli düzeylerde hücresel davranışı modüle Nitekim, parakrin sinyal bütün dokularda uygun olupve insert ko-kültür sistemleri yapan sistemler, bu alanlarda gelişmeler sağlamak için vazgeçilmezdir. Bunun aksine, bu sinyal transdüksiyonunu onaylayabilir insertlerin kullanımı doğrudan hücre-hücre teması yoluyla olup salgılanan faktörler gereğidir. Insertlerin en önemli kullanım alanlarından biri salgılanan sitokinlerin etkileri bağışıklık çeşitli hücresel oyuncu değerlendirilir inflamasyon çalışmaları 2-14 bulunmaktadır. Özellikle, merkezi sinir sistemi (MSS) inflamasyon çalışma büyük ölçüde daha iyi nöro-inflamasyonu 15-21 sürüş nöronlar ve mikroglia farklı parakrin rollerini tanımlamaya izin insert ko-kültür çalışmaları, kazanç olmuştur. Bu sistemler de azaltmak ya da pro-enflamatuar faktörler 22-26 sekresyonunu inhibe etme kabiliyetleri dayanır moleküllerin, anti-inflamatuar potansiyelinin çalışma devreye sokuldu. Araştırma mekanizmaları, özellikle kanser 27-31 ilişkin anjiyogenez 32-34 ve inflammati altında yatantümörigenezinde 35-42, bu aynı zamanda insert ko-kültür sistemleri yararlanır. Ayrıca, çözünür faktörler farklılaşma ve çeşitli çalışmalar söz konusu alanda 43-50 sorulara cevap ekler kullandık sürücü süreçlerde birinci derecede öneme sahiptir. MSS nöral doku olarak görmeye çok sınırlı bir yenilenme potansiyeli, neurotrophism çalışma vardır ve nöro temel ve yaygın ko-kültür sistemleri 51-56 kök hücrelerin kullanımı ile sağlanmıştır. Buna ek olarak, ekler de nefroloji 57,58, endotel etkileşimleri ve anjiyogenez 59-62, apoptoz obezite ve metabolik sendrom 22,23,66-67 yılında 63-65, inflamasyonu sinyalizasyon, iç kulak saç hücre koruması gibi çok farklı alanlarda kullanılmaktadır 68,69 ve hatta mantar virulans 70,71 ve Parazitoloji 72,73 yılında. Bu makalede, bir experim kurmak için genel metodolojik kurallar sunmaktadırBir ekleme ko-kültür sistemi kullanılarak salgılanan çözünür faktörler tarafından aracılık hücresel değişikliklerin değerlendirilmesi açısından ent. Özellikle, sinir hücresi ko-kültür ve nöro sürecini inceleyerek kendi kullanımları hakkında dikkatimizi durulacak. pilota mümkün kılacak ekler deneyler çok geniş bir spektrum göz önüne alındığında, hücre kültürü tekniğinin her yönüyle kapsayacak şekilde dayanılmaz. Bir örnek olarak, belirli bir protokol uç ko-kültür yöntemi somut bir anlayışı sunan, detaylı olarak açıklanacaktır lipopolisakarit (LPS) tarafından salgılanan sitokinlerin etkileri nöronal PC 12 hücreleri üzerinde N9 mikroglia -etkinleştirilmiş ölçülmesi.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640 orta</td><td>Sigma</td><td>R8755</td><td>37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta/Besin Karışımı F-12 Jambon Sigma</td><td></td><td>D6421</td><td>37 °C Sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu, 0.365 gm/L L-glutamin ile desteklenmelidir</td></tr><tr><td>At serumu</td><td>ATCC</td><td>30-2040</td><td>37 ° C'de ılık; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>MultiCell</td><td>80350</td><td>37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>murin submaksiller bezinden Sinir Büyüme Faktörü-7S</td><td>Sigma</td><td>N0513</td><td>Liyofilize tozu, 0.1&ndash içeren tamponlu salin veya doku kültürü ortamı çözeltisinde sulandırın; % 1.0 sığır serum albümini veya% 1-10 serum</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td>37 ° C'de sıcak; C su banyosu kullanmadan önce</td></tr><tr><td>Lipopolisakkaritler&nbsp; Escherichia coli&nbsp; 055:B5</td><td>Sigma</td><td>L2880</td><td>24</td></tr><tr><td>oyuklu plakalarla kullanım için Toksik Hücre kültürü ekleri</td><td>BD Falcon</td><td>353095</td><td>0.4 & mu; m gözenekler</td></tr><tr><td>24 oyuklu plakalar</td><td>TrueLine</td><td>TR5002</td><td>Kullanmadan önce kollajen ile kaplayın</td></tr><tr><td>Rutin PC12 hücre kültürü ortamı</td><td></td><td></td><td>Rutin N9 hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; %85 RPMI orta</td><td></td><td></td><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; % 90 DMEM-F12 orta</td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; % 10 ısıyla inaktive edilmiş at serumu</td><td></td><td></td><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; % 10 ısıyla inaktive edilmiş at serumu</td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; % 5 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PC12 farklılaşma ortamı</td><td></td><td></td><td>N9 tedavi ortamı</td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; %99 RPMI orta</td><td></td><td></td><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; % 99 DMEM-F12 orta</td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; % 1 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu</td><td></td><td></td><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; % 1 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu</td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 50 ng/mL sinir büyüme faktörü</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PC12 tedavi ortamı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; %99 RPMI orta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; % 1 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hücre-hücre İletişim yokluğunda iki hücresel türleri ekleme co-kültür sisteminin geliştirilmesi

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

Salgılanan çözünür faktörlerin hücresel yanıtların modifikasyonundaki rolü, tüm doku ve sistemlerin çalışmasında tekrarlayan bir temadır. Çok hücreli organizmaları oluşturan çeşitli hücresel alt tipler arasındaki çok karmaşık ilişkileri basitleştirmek amacıyla, araştırmacıların tek hücre popülasyonlarını ayrıntılı bir şekilde anlamalarına yardımcı olmak için in vitro teknikler geliştirilmiştir. Bu tekniklerden biri, salgılanan çözünür faktörlerin yayılmasına izin veren geçirgen bir zara sahip ekler kullanır. Bu nedenle, eklerde büyütülen bir hücre popülasyonu, hücre-hücre temasının yokluğunda parakrin sinyallemeyi takiben hücresel değişiklikleri değerlendirmek için farklı bir hücre tipi içeren bir kuyu veya tabakta birlikte kültürlenebilir. Bu tür insert ko-kültür sistemleri, diğer ko-kültür tekniklerine göre, yani çift yönlü sinyalleme, korunmuş hücre polaritesi ve hücresel değişikliklerin popülasyona özgü tespiti gibi çeşitli avantajlar sunar. Enflamasyon, kanser, anjiyogenez ve farklılaşma alanında kullanılmasının yanı sıra, bu ko-kültür sistemleri, özellikle nöroinflamasyon bağlamında, merkezi sinir sisteminde bulunan farklı hücresel alt tipler arasında var olan karmaşık ilişkilerin incelenmesinde birincil öneme sahiptir. Bu makale, bir insert ko-kültür sistemi kullanarak salgılanan çözünür faktörlerin aracılık ettiği hücresel değişiklikleri değerlendirmek için bir deney kurmak için genel metodolojik yönergeler sunmaktadır. Ayrıca, lipopolisakkarit ile aktive olan N9 mikroglia tarafından salgılanan sitokinlerin nöronal PC12 hücreleri üzerindeki nöroinflamatuar etkilerini ölçmek için spesifik bir protokol detaylandırılacak ve insert ko-kültür metodolojisinin somut bir şekilde anlaşılmasını sağlayacaktır.

insert ko-kültür sistemlerinin kullanılması MSS farklı hücresel oyuncular arasında parakrin ilişkileri vitrin nöro süreçlerin çalışmada özellikle uygun olduğunu. MSS Bağışıklık onların istirahat dallanmış devlet (Şekil 2A) çevreleri izlemek ve algılama bozuklukları yeteneğine sahip mikroglia denilen yerleşik hücreler tarafından çoğunlukla başarılı olduğunu olabilir sorun düzgün nöronal fonksiyon 76-78 için gerekli çok değerli homeostasis. Bir amoeboid şekli <s...

Çok hücreli organizmalarda, salgılanan çözünür faktörler, parakrin sinyalizasyonunun bir sonucu olarak farklı hücre tiplerinden yanıtlar ortaya çıkarır. Insert ko-kültür sistemleri, hücre-hücre temasının yokluğunda salgılanan çözünür faktörlerin aracılık ettiği değişiklikleri değerlendirmek için basit bir yol sunar.

Hücre-Hücre İletişim Yokluğunda iki Hücresel Türleri Ekleme Co-kültür Sisteminin Geliştirilmesi

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Bu prosedürün genel amacı, geçirgen bir membrana sahip insertler kullanarak iki hücre tipinden oluşan hücresel bir ko-kültür sistemi oluşturmak ve böylece salgılanan çözünür faktörlerin difüzyonuna olanak sağlamaktır. Bu işlem, bir hücre tipini içeren insertlerin, ikinci bir hücre tipini içeren çok kuyucuklu bir doku kültürü plakasına hassas bir şekilde yerleştirildiği bir dizi adım ile gerçekleştirilir. İşleme, birinci hücre tipini insertlere ve ikinci hücre tipini çok kuyucuklu bir doku kültürü plakasına ekerek başlıyoruz.İkinci adım, insertlerin iki numaralı hücre tipini içeren plağın kuyucuklarına aktarılmasıdır. Bu işlem, nihayetinde iki hücre tipinin yanı sıra ilgili süpernatantların da toplanabilmesine olanak sağlar. Böylece, salgılanan çözünür faktörlerin ilgilenilen hücre tipi üzerindeki etkisi değerlendirilebilir.Çok hücreli organizmalarda, salgılanan çözünür faktörler parakrin sinyalleşme sonucunda farklı hücre tiplerinden yanıtlar uyandırır. Bu nedenle, insert ko-kültür sisteminin değeri, hücre-hücre temasının yokluğunda salgılanan çözünür faktörler aracılığıyla hücresel parametrelerdeki değişimleri değerlendirmek için özgün bir yol sunma yeteneğinde yatar. Insert ko-kü

development-an-insert-co-culture-system-two-cellular-types-absence

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, yumurtalık kanseri hücrelerinin ve birincil insan mezotelyal hücrelerinin proksimal bir ko-kültür modelini geliştiriyoruz. Fizyolojik olarak ilgili bu model, doğrudan hücresel teması önlerken salgılanan faktörlerin lokalize konsantrasyonlarının korunduğu parakrin sinyalizasyonun incelenmesine izin verir.

Proksimal Kültür Sistemi: Hücreler Arasındaki Parakrin Sinyalleşmeyi İncelemek İçin Bir İn Vitro Kültür Tekniği

Bu video, perivasküler endotel hücreleri ile internöronların bir ko-kültürünü oluşturmak için bir tekniği göstermektedir. Hücreler, bir kültür kabının içine yerleştirilmiş tek oyuklu bir ek parçaya eklenir. Hücreler tabağa yapıştıktan sonra, ek parça çıkarılır, bu da hücrelerin çoğalmasına ve etkileşime girmesine ve bir ko-kültür oluşturmasına izin verir.

Periventriküler Endotel Hücreleri ile İnternöronların Ko-Kültürünün Kurulması

Tümör mikroçevresini (TME) taklit etmek için geçirgen bir mikro gözenekli membran ekini uyarladık. Model, karışık bir hücre kültüründen oluşur, floresan etiketleme veya hücre sıralama kullanmadan yüksek oranda zenginleştirilmiş bireysel hücre popülasyonlarının basitleştirilmiş üretimine izin verir ve normal veya stres koşulları altında TME içinde hücreler arası iletişimin incelenmesine izin verir.

Tümör mikroçevresinin A Mimik: Hücreler arası İletişim Zenginleştirilmiş hücre popülasyonları oluşturma ve incelenmesi için Basit Bir Yöntem

Bu yazıda, yeni tasarlanmış bir 3D baskılı ek, bir ko-kültür modeli olarak sunulmuş ve endotel hücreleri ile keratinositler arasındaki parakrin hücreler arası iletişimin incelenmesiyle doğrulanmıştır.

Basit 2D ve 3D hücre kültürlerini mümkün kılmak için tasarlanmış yenilikçi bir 3D baskılı ek parça

Protokol, üç boyutlu (3D) baskılı bir iskele ile iki tür yapışık hücre hattının biyolojisini özetleyebilen yeni bir in vitro deneysel modeli göstermektedir. Bu modelin inşası ve hücre hazırlığı ve hücre kültüründen analiz ve değerlendirmeye kadar işletme prosedürleri açıklanmaktadır.

İki Tip Yapışık Hücre Hattı Kullanan Ko-Kültür Modeli

Burada, nanofibröz membran bazlı iki katmanlı sistemde fibroblastlarla kültürlenen epitel hücrelerinin membrana nasıl stabil bir şekilde yapışabileceğini ve zar üzerinde büyüyebileceğini gösteriyoruz.

Nanolifli membranlar kullanılarak epitel hücrelerinin üç boyutlu bir kokültür modülünün kurulması

Bu makale, 3D Flipwell mühendisliğine ve kullanımına rehberlik edecek temel adımları içeren ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Ko-kültür ek yığınlarının nasıl bir araya getirileceğini ve bağırsak mukozal ortamını modellemek için bağırsak bakterileri, bağırsak epiteli ve makrofajların tabakalı katmanlarını birlikte kültürlemek için nasıl kullanılacağını açıklıyor ve gösteriyoruz.

Bakteriyel, Bağırsak ve Bağışıklık Hücrelerinde Toksikolojik ve İmmünomodülatör Tedaviler için Asenkron Sistemler Geliştirmeye Yönelik 3D Flipwell Mühendisliği

Çalışma, doku kök hücresinden türetilen bağırsak organoidleri kullanılarak bakteriyel enfeksiyonun in vitro incelenmesi için bir yöntem sunmaktadır. Protokol, organoidlerin iki boyutta nasıl kültürleneceğini ve farklılaştırılacağını, onları yapışkan-invaziv Escherichia coli ile enfekte edeceğini ve epitel bariyer sızıntısı, enfeksiyon görüntüleme ve epitel RNA yanıtı gibi önemli okumaları nasıl değerlendireceğini açıklar.

Konak-bakteri etkileşimlerini incelemek için invazin veya bazal zar ekstraktı üzerine iki boyutlu organoid kültürü

Bu makale, bir roman protokol ve reaktif bileşikler ve tedavilerin yüksek içerik analizi kullanarak nöronlar ve astrositler ortak kültürleri üzerinde nörotoksik etkileri hassas ölçümü için tasarlanmıştır ayarlamak açıklamaktadır. Sonuçlar yüksek bir içerik analizi nörotoksisite değerlendirmesi için heyecan verici yeni bir teknoloji temsil ettiğini göstermektedir.

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

Ras-GAP ve ERK1 çift inhibisyonu yoluyla SC1 fonksiyonları. Biz LIF yokluğunda fare ES hücre kendini yenileme destekleyen SC1 fonksiyonu test edilmiş ve SC1 fare ES hücre kültürleri kendini yenileme korumak mümkün olduğunu göstermiştir.

Kendini yenileme LIF Yokluğunda Mesc Destek SC1 (Pluripotin) kullanımı

Öğrenin, geçirgen membranlı insertler kullanarak hücre-hücre teması olmadan parakrin sinyalleşmeyi incelemek için eş kültür sistemi geliştirmeyi. Bu yöntem, salgılanan çözünür faktörlerin etkilerini değerlendirir.

Hücre-Hücre İletişim Yokluğunda iki Hücresel Türleri Ekleme Co-kültür Sisteminin Geliştirilmesi

Daha fazla video keşfet