Hücre-Hücre İletişim Yokluğunda iki Hücresel Türleri Ekleme Co-kültür Sisteminin Geliştirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, geçirgen bir membrana sahip insertler kullanarak iki hücre tipinden oluşan hücresel bir ko-kültür sistemi oluşturmak ve böylece salgılanan çözünür faktörlerin difüzyonuna olanak sağlamaktır. Bu işlem, bir hücre tipini içeren insertlerin, ikinci bir hücre tipini içeren çok kuyucuklu bir doku kültürü plakasına hassas bir şekilde yerleştirildiği bir dizi adım ile gerçekleştirilir. İşleme, birinci hücre tipini insertlere ve ikinci hücre tipini çok kuyucuklu bir doku kültürü plakasına ekerek başlıyoruz.

İkinci adım, insertlerin iki numaralı hücre tipini içeren plağın kuyucuklarına aktarılmasıdır. Bu işlem, nihayetinde iki hücre tipinin yanı sıra ilgili süpernatantların da toplanabilmesine olanak sağlar. Böylece, salgılanan çözünür faktörlerin ilgilenilen hücre tipi üzerindeki etkisi değerlendirilebilir.

Çok hücreli organizmalarda, salgılanan çözünür faktörler parakrin sinyalleşme sonucunda farklı hücre tiplerinden yanıtlar uyandırır. Bu nedenle, insert ko-kültür sisteminin değeri, hücre-hücre temasının yokluğunda salgılanan çözünür faktörler aracılığıyla hücresel parametrelerdeki değişimleri değerlendirmek için özgün bir yol sunma yeteneğinde yatar. Insert ko-kültür sistemleri, diğer ko-kültür tekniklerine göre çeşitli avantajlar sunar: bir, tek yönlü sinyalleşme; iki, korunan hücre polaritesi ve üç, hücresel değişimlerin popülasyona özgü olarak tespit edilmesi.

Lipopolisakkarit ile aktive edilmiş N9 mikroglial hücreler tarafından salgılanan sitokinlerin nöronal PC12 hücreleri üzerindeki toksik etkilerini ölçmek için kullanılan spesifik bir protokol aşağıda ayrıntılı olarak açıklanacak ve böylece insert ko-kültür metodolojisinin somut bir şekilde anlaşılması sağlanacaktır. Başlamak için, 24 kuyucuklu doku kültürü plağını ve 0,4 mikron gözenekli politetrafloroetilen insertleri ambalajlarından çıkarın. Ardından, steril cımbız kullanarak insertin en üst kenarından tutarak insertleri doku kültürü plağının boş kuyucuklarına yerleştirin.

Ardından, membran tamamen kaplanana kadar insertleri rutin N9 medyumu ile doldurun. Hücrelerin tutunma yeteneğini artırmak için insertleri en az bir saat veya gece boyunca inkübe edin. Insertler hazır olduğunda, insertlere ekilecek hücre süspansiyonunu elde etmek için rutin N9 medyumu kullanarak %80 ila %90 konfluense ulaşmış N9 mikroglial hücreleri ayırın.

Ardından, mikropipet ucuyla membranı delmemeye dikkat ederek rutin besiyerini insertlerden uzaklaştırın. Daha sonra, her bir inserte 50 µL hücre süspansiyonu ile santimetrekare başına 60.000 hücre olacak şekilde veya insert üreticisinin protokolüne uygun olarak ekim yapın. Hücre süspansiyonunu dağıtırken, tüpü ara ara ters çevirerek süspansiyonun homojen kalmasını sağlayın.

Tüm insertlere ekim yapıldıktan sonra, hücreleri eşit şekilde dağıtmak için plakayı önce nazikçe ileri geri, ardından sola ve sağa sallayın. Hücrelerin insertin merkezinde toplanmasına neden olacağı için dairesel hareketlerden kaçının. Ardından, N9 mikroglia aktivasyonuna geçmeden önce insertleri içeren plakayı 24 saat boyunca inkübe edin.

10 mg lipopolisakkarit tartarak başlayın ve daha sonra kullanmak üzere 1,5 ml'lik bir Eppendorf Tüpü'ne yerleştirin. Lipopolisakkarit, güçlü bir pro-inflamatuar endotoksin olduğu ve özel güvenlik önlemleri gerektirdiği için gözlük, eldiven ve partikül maskesi kullanılması şiddetle önerilir. Ardından, mililitre başına dört, iki ve bir mikrogramlık çalışma çözeltileri elde etmek için ılık N9 tedavi ortamı kullanarak lipopolisakkarit ile bir dizi seri dilüsyon hazırlayın.

Son olarak, hücreleri rahatsız etmemeye dikkat ederek insertlerdeki kültür ortamının yarısını uzaklaştırın. Ardından, mililitre başına iki, bir veya 0,5 mikrogramlık final dilüsyonlar elde etmek için insertlere 25 mikrolitre lipopolisakkarit çalışma çözeltisi nazikçe ekleyin. Ko-kültür deneylerine geçmeden önce plağı 24 saat daha inkübe edin.

Bu adım, santimetrekare başına 30.000 hücre şeklinde ekilmiş diferansiye internöron PC12 hücreleri ve önceki bölümde açıklandığı üzere 24 saat boyunca lipopolisakkarit ile aktive edilmiş N9 mikroglia hücreleri gerektirir. İlk olarak, insertlerdeki tüm ortamı nazikçe uzaklaştırarak yerine 50 µL taze, ılık N9 tedavi ortamı ekleyerek başlayın. Bu işlem, yalnızca aktive edilmiş N9 mikroglialarının kalmasını sağlamak için tüm lipopolisakkarit kalıntılarını temizlemek amacıyla gereklidir.

İnsertlerin doku kültürü plağının kuyucukları içinde gevşek olduğunu ve uçla duvara çok sert bastırılırsa hareket edebileceğini unutmayın. Hücrelerin hava ile uzun süreli temas nedeniyle kurumasını önlemek için bu adım, her seferinde tek bir insert olacak şekilde gerçekleştirilmelidir. Ardından, nöronal PC12 hücre ortamını tamamen uzaklaştırın ve yerine 0.6 mL taze, sıcak PC12 tedavi ortamı ekleyin.

Hücrelerin kurumamasını sağlamak için bu işlemi her seferinde bir kuyucuk için yapın. Bir cımbız yardımıyla, bir insertin en üst kenarından tutun ve onu nöronal PC12 hücreleri içeren kuyucuğun içine nazikçe yerleştirin. Tüm insertler aktarıldığında, insert membranlarının altında hava kabarcığı olup olmadığını kontrol edin.

Hava kabarcıkları, insert membranındaki herhangi bir değişimi engelleyecektir ve tüm deneyi tehlikeye atabilir. Bir cımbız yardımıyla inserti kuyucuktan çok nazikçe kaldırıp tekrar hücre kültür ortamına yerleştirerek hava kabarcıklarını giderin; bu işlem çoğu kabarcığı yok edecektir. Ancak, geçmeyen kabarcıklar için inserti belirli bir açıyla hücre kültür ortamına nazikçe daldırmayı deneyin.

Adherent hücrelerin ayrışmasına neden olabileceği için insertlere vurmayın veya karıştırmayın. Ardından, hem insertlerdeki hem de kuyucuklardaki medya hacimlerini kontrol edin; her iki bölmedeki sıvı yaklaşık olarak aynı seviyede olmalıdır. Tüm hava kabarcıkları giderildiğinde ve medya hacimleri uygun olduğunda, plakayı inkübe edin.

N9 mikroglia ile nöronal PC12 hücreleri arasındaki parakrin sinyalleşmenin etkilerini ölçmek için hücreler, kültür ortamı veya her ikisi toplanabilir. Proenflamatuar sitokinleri nicelikle belirlemek için alt bölmenin hücre kültür ortamında enzim bağlı immünosorbent assaylar (ELISA) gerçekleştirilmiştir. Sonuçlar, aktivasyon döneminden 24 saat sonra, 2 µg/mL lipopolisakkarit ile işlem görmüş N9 mikroglianın, işlem görmemiş mikroglialara kıyasla interlökin-6, tümör nekroz faktör-alfa ve interferon gama gibi anlamlı düzeyde daha fazla proenflamatuar sitokin salgıladığını göstermektedir.

Ek olarak, mililitre başına bir mikrogram lipopolisakkarit ile işleme tabi tutulan N9 mikroglia hücreleri, 24 saat sonra belirgin şekilde daha fazla interferon gama salgılamış; interluken-6 ve tümör nekroz faktörü-alfa'nın hücre besiyeri seviyelerinde anlamlı bir artış görülmesi ise 48 saat sürmüştür. Buna karşılık, mililitre başına 0,5 mikrogram koşulu, aktivasyon süresinden sonraki hem 24. hem de 48. saatlerde N9 mikroglia hücrelerinde sitokin ekspresyonunu artırmamıştır. Dahası, mililitre başına iki mikrogram grubundaki 24 saatlik veriler, mikroglial popülasyonda bir artış olan mikrogliyozun gerçekleştiğini göstermektedir.

Buna karşılık, hücre sayısındaki anlamlı artış ancak 48 saat sonra gerçekleşmiştir. Son olarak, artmış sitokin salınımı ve mikrogliyozise yol açan mikroglial aktivasyonun sonuçlarını değerlendirmek amacıyla, ko-kültür edilen nöronal PC12 hücrelerinde sitotoksisite değerlendirilmiştir. Hasarlı hücreler tarafından salınan Ekstraselüler Laktat Dehidrogenaz seviyeleri ölçülerek, N9 hücrelerindeki lipopolisakkarit konsantrasyonu arttıkça nöronal PC12 hücrelerinde daha fazla hücre ölümü meydana geldiği tespit edilmiştir.

Böylece, bu sonuçlar, salgılanan çözünür faktörlerin ko-kültür insert membranını geçebildiğini ve hücre-hücre temasının yokluğunda nöronal PC12 hücrelerindele sitotoksik hasara yol açabildiğini göstermektedir. Burada insert ko-kültürünün yalnızca tek bir senaryosu sunulmuş olsa da, bu oldukça esnek bir tekniktir. Bu protokolde, bir hücre tipi, insert kuyucuğa aktarıldığında ikinci hücre tipinin davranışını etkileyen çözünür faktörlerin salgılanmasını azaltan molekül ile ön işlemden geçirilmiştir.

Bununla birlikte, bir veya her iki hücre popülasyonunun daha sonraki bir tedaviye karşı artan hassasiyetini veya direncini tespit etmek için her iki hücre tipi bir ko-kültür sisteminde birlikte inkübe edilebilir. Bu teknik, örneğin bazal parakrin karşılıklı sinyal iletimini değerlendirmek için, herhangi bir işlem uygulanmadan birlikte inkübe edilen iki hücre popülasyonundan basitçe yararlanabilir. Burada gösterildiği gibi nöroinflamasyon alanında değerli olmasının yanı sıra, ekleme ko-kültür sistemleri tümör rejenezi, nörolathyrisma, apoptoz sinyalizasyonu veya parakrin sinyal iletimi bileşeni içeren diğer tüm konularla ilgili geniş bir soru yelpazesini yanıtlamak için kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, insert ko-kültür sistemlerinin, salgılanan çözünür faktörler tarafından yönlendirilen değişiklikleri değerlendirmek için nasıl basit bir yol sunduğuna dair iyi bir anlayış geliştirmiş olmalısınız. Hücre-hücre temasının olmadığı durumlarda, çok hücreli parakrin sinyallemenin incelenmesinde bu insert ko-kültür sistemlerinin yüksek potansiyeli konusunda sizi ikna edebilmiş olmayı umuyoruz.