Hücre-Hücre İletişim Yokluğunda iki Hücresel Türleri Ekleme Co-kültür Sisteminin Geliştirilmesi
July 17th, 2016
Çok hücreli organizmalarda, salgılanan çözünür faktörler, parakrin sinyalizasyonunun bir sonucu olarak farklı hücre tiplerinden yanıtlar ortaya çıkarır. Insert ko-kültür sistemleri, hücre-hücre temasının yokluğunda salgılanan çözünür faktörlerin aracılık ettiği değişiklikleri değerlendirmek için basit bir yol sunar.
Bu prosedürün genel amacı, geçirgen bir zara sahip ekler kullanarak iki hücre tipinden oluşan bir hücresel ko-kültür sistemi oluşturmak ve böylece salgılanan çözünür faktörlerin difüzyonuna izin vermektir. Bu, bir hücre tipi içeren eklerin, ikinci bir hücre tipi içeren çok kuyulu bir doku kültürü plakasına ince bir şekilde yerleştirildiği bir dizi adımla gerçekleştirilir. Bir numaralı hücre tipini eklerde tohumlamaya ve iki numaralı hücre tipini çok kuyulu bir doku kültürü plakasında tohumlamaya başlıyoruz.
İkinci adım, eklerin iki numaralı hücre tipini içeren plakanın kuyularına aktarılmasıdır. Sonuç olarak, bu, iki hücre tipinin yanı sıra ilgili süpernatanları hasat etme yeteneği verir. Bu nedenle, salgılanan çözünür faktörlerin ilgilenilen hücre tipi üzerindeki etkisini değerlendirmek mümkündür.
Çok hücreli organizmalarda salgılanan çözünür faktörler, parakrin sinyalizasyonunun bir sonucu olarak farklı hücre tiplerinden yanıtlar ortaya çıkarır. Bu nedenle, bir kesici uç ko-kültür sisteminin değeri, hücre-hücre temasının yokluğunda salgılanan çözünür faktörlerin aracılık ettiği hücresel parametrelerdeki değişiklikleri değerlendirmek için orijinal bir yol sunma yeteneğinde yatmaktadır. Insert ko-kültür sistemleri, diğer ko-kültür tekniklerine göre çeşitli avantajlar sunar, örneğin: biri yönlü sinyalizasyonla; iki korunmuş hücre polaritesi; ve hücresel değişikliklerin üç popülasyona özgü tespiti.
Lipopolisakkarit ile aktive edilmiş N9 mikroglia tarafından salgılanan sitokinin nöronal PC12 hücreleri üzerindeki toksik etkilerini ölçmek için spesifik bir protokol bundan sonra detaylandırılacak ve böylece insert ko-kültür metodolojisinin somut bir şekilde anlaşılması sağlanacaktır. Başlamak için, 24 oyuklu doku kültürü plakasını ve 0,4 mikron por politetrafloroetilen eklerini ambalajlarından çıkarın. Ardından, steril cımbız kullanarak ekin en üst kenarını kavrayarak ekleri doku kültürü plakasının boş kuyularına yerleştirin.
Ardından, zar tamamen kaplanana kadar ekleri rutin N9 ortamı ile doldurun. Hücrelerin bağlanma kabiliyetini artırmak için ekleri en az bir saat veya gece boyunca inkübe edin. Uçlar hazır olduğunda, ekleri tohumlamak için kullanılacak bir hücre süspansiyonu elde etmek için N9 mikrogliasını rutin N9 ortamı kullanarak %80 ila 90 birleşme noktasında bölün.
Ardından, mikropipet ucuyla zarı delmemeye dikkat ederek rutin ortamı eklerden çıkarın. Daha sonra, her bir kesici ucu santimetre kare başına 60.000 hücreye 50 mikrolitre hücre süspansiyonu ile veya kesici uç üreticisinin protokolüne göre tohumlayın. Hücre süspansiyonunu dağıtırken, ara sıra tüpü ters çevirerek homojen kalmasını sağlayın.
Tüm ekler eklendiğinde, hücreleri eşit şekilde dağıtmak için plakayı hafifçe ileri geri, ardından soldan sağa sallayın. Dairesel hareketler yapmaktan kaçının çünkü bu, hücrelerin ekin merkezinde birikmesine neden olur. Daha sonra, N9 mikroglia aktivasyonu ile devam etmeden önce ekleri içeren plakayı 24 saat inkübe edin.
10 miligram lipopolisakkarit tartarak başlayın ve daha sonra kullanmak üzere 1.5 mililitrelik bir Eppendorf Tüpünde saklayın. Lipopolisakkarit güçlü bir proinflamatuar endotoksin olduğundan ve özel güvenlik önlemleri gerektirdiğinden, gözlük, eldiven ve partikül solunum cihazı şiddetle tavsiye edilir. Daha sonra, mililitre başına dört, iki ve bir mikrogramlık çalışma çözeltileri elde etmek için ılık N9 tedavi ortamı kullanarak bir dizi seri lipopolisakkarit seyreltmesi oluşturun.
Son olarak, hücreleri rahatsız etmemeye dikkat ederek kültür ortamının yarısını eklerden çıkarın. Daha sonra, mililitre başına iki, bir veya 0.5 mikrogramlık nihai seyreltmeler elde etmek için eklere yavaşça 25 mikrolitre lipopolisakkarit çalışma solüsyonu ekleyin. Ko-kültür deneylerine devam etmeden önce plakayı 24 saat daha inkübe edin.
Bu adım, santimetre kare başına 30.000 hücrede kaplanmış PC12 hücrelerinin farklılaşmış internöronlarını ve önceki bölümde açıklandığı gibi 24 saat boyunca lipopolisakkarit ile aktive edilen N9 mikrogliasını gerektirir. Tüm ortamı eklerden nazikçe çıkararak ve 50 mikrolitre taze, ılık N9 işlem ortamı ile değiştirerek başlayın. Bu, tüm lipopolisakkarit izlerini çıkarmak için gereklidir ve geriye sadece aktive edilmiş N9 mikroglia kalır.
Doku kültürü plakasının oyuklarında eklerin gevşek olduğunu ve ucun duvara çok sert bastırılması durumunda hareket edebileceğini unutmayın. Bu adım, hava ile uzun süreli temas nedeniyle hücrelerin kurumasını önlemek için her seferinde bir ekleme yapılmalıdır. Daha sonra nöronal PC12 hücre ortamını tamamen çıkarın ve 0.6 mililitre taze, ılık PC12 tedavi ortamı ile değiştirin.
Hücrelerin kurumamasını sağlamak için bunu her seferinde bir tane iyice yapın. Cımbız kullanarak, bir parçanın en üst kenarını kavrayın ve nazikçe nöronal PC12 hücrelerini içeren kuyuya yerleştirin. Tüm kesici uçlar aktarıldığında, kesici uçların zarlarının altında hava kabarcıkları olup olmadığını kontrol edin.
Hava kabarcıkları, ek parçanın zarı boyunca herhangi bir değişimi önleyecek ve tüm deneyi tehlikeye atabilecektir. Cımbız kullanarak ek parçayı kuyudan çok nazikçe kaldırarak ve hücre kültürü ortamına geri yerleştirerek hava kabarcıklarını çıkarın, bu işlem çoğu kabarcıktan kurtulmalıdır. Bununla birlikte, kalıcı kabarcıklar için, eki belirli bir açıyla hücre kültürü ortamına nazikçe daldırmayı deneyin.
Yapışan hücrelerin ayrışmasına neden olma eğiliminde olduğundan, ekleri vurmayın veya karıştırmayın. Daha sonra, hem eklerdeki hem de kuyucuklardaki ortam hacimlerini kontrol edin, her iki bölmedeki sıvı kabaca aynı seviyede olmalıdır. Tüm hava kabarcıkları çıkarıldığında ve ortam hacimleri uygun olduğunda, plakayı inkübe edin.
Hücreler, kültür ortamı veya her ikisi de daha sonra N9 mikroglia ve nöronal PC12 hücreleri arasındaki parakrin sinyalizasyonunun etkilerini ölçmek için hasat edilebilir. Proinflamatuar sitokinleri ölçmek için alt bölmenin hücre kültürü ortamı üzerinde enzime bağlı immünosorbent testleri yapıldı. Sonuçlar, aktivasyon periyodundan 24 saat sonra, mililitre başına iki mikrogram lipopolisakkarit ile tedavi edilen N9 mikrogliasının, tedavi edilmeyen mikrogliaya kıyasla interluken-6, tümör nekroz faktörü-alfa ve interferon gama gibi önemli ölçüde daha fazla proinflamatuar sitokin salgıladığını göstermektedir.
Ek olarak, mililitre başına bir mikrogram lipopolisakkarit ile tedavi edilen N9 mikroglia, 24 saat sonra belirgin şekilde daha fazla interferon gama salgılarken, hücre orta interluken-6 ve tümör nekroz faktörü-alfa seviyelerinde önemli bir artış görmek 48 saat sürdü. Buna karşılık, mililitre başına 0.5 mikrogram koşul, aktivasyon süresinden 24 ve 48 saat sonra N9 mikroglia'da sitokin ekspresyonunu arttıramadı. Ayrıca, mililitre başına iki mikrogram grubundaki 24 saatlik veriler, mikroglial popülasyonda bir artış olan mikrogliozis olduğunu göstermektedir.
Bununla birlikte, hücresel numaranın önemli ölçüde artması ancak 48 saat sonra oldu. Son olarak, artmış sitokin sekresyonu ve mikrogliozosa yol açan mikroglial aktivasyonun sonuçlarını değerlendirmek için, ko-kültürlenmiş nöronal PC12 hücrelerinde sitotoksisite değerlendirildi. Hasarlı hücreler tarafından salınan Hücre Dışı Laktat Dehidrojenaz seviyelerinin ölçülmesiyle, nöronal PC12 hücrelerinin, N9 hücreleri üzerindeki lipopolisakkarit konsantrasyonu arttıkça daha fazla hücre ölümü sergilediği bulundu.
Bu nedenle, bu sonuçlar, salgılanan çözünür faktörlerin ko-kültür eklerinin zarını geçebildiğini ve hücre-hücre temasının yokluğunda nöronal PC12 hücrelerinde sitotoksik hasara neden olabileceğini göstermektedir. Burada yalnızca bir insert ko-kültürü senaryosu sunulmuş olsa da, bu çok esnek bir tekniktir. Bu protokolde, bir hücre tipi, ekin kuyuya aktarılması üzerine ikinci hücre tipinin davranışını etkileyen çözünür faktörlerin salgılanmasını azaltmaktan sorumlu molekül ile ön işleme tabi tutulmuştur.
Bununla birlikte, bir veya her iki hücre popülasyonunun daha sonraki bir tedaviye karşı artan zayıflığını veya direncini tespit etmek için her iki hücre tipini bir ko-kültür sisteminde birlikte inkübe etmek mümkündür. Bu teknik, örneğin bazal parakrin karşılıklı sinyalleşmeyi değerlendirmek için herhangi bir tedavi olmaksızın birlikte inkübe edilen iki hücre popülasyonunu kullanabilir. Burada gösterildiği gibi nöroinflamasyon alanında değerli olmasının yanı sıra, insert ko-kültür sistemleri, tümör regenezi, nörolatirisma, apoptoz sinyali veya parakrin sinyalizasyonunun bir bileşeni olan diğer herhangi bir konu ile ilgili çok çeşitli soruları yanıtlamak için kullanılabilir.
Bu videoyu izledikten sonra, artık insert ko-kültür sistemlerinin, salgılanan çözünür faktörün aracılık ettiği değişiklikleri değerlendirmek için nasıl basit bir yol sunabileceğini iyi anlamış olmalısınız. Ve sizi, hücre-hücre temasının yokluğunda çok hücreli parakrin sinyalleme çalışmasında bu insert ko-kültür sistemlerinin yüksek potansiyeline ikna etmiş olmayı umuyoruz.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, geçirgen bir membranlı insertler kullanarak bir hücresel ortak kültür sistemi oluşturma yöntemini açıklar. Bu kurulum, hücreler arası doğrudan temas olmadan farklı hücre tiplerine salgılanan çözünür faktörlerin etkilerinin çalışılmasına olanak tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre biyolojisi
- Ortak kültür sistemleri
- Parakrin sinyalizasyon
Arka Plan
- Çok hücreli organizmalar iletişim için salgılanan çözünür faktörler kullanır.
- Parakrin sinyalizasyon çeşitli hücre tiplerinden gelen yanıtları içerir.
- Ortak kültür sistemleri bu etkileşimlerin çalışılmasını basitleştirebilir.
- Insertler, hücre tiplerinin ayrılmasını sağlarken faktörlerin yayılmasını sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Salgılanan çözünür faktörlerin hedef hücre tipleri üzerindeki etkisini değerlendirmek.
- Bu faktörlerin kontrollü bir ortamda aracılık ettiği değişiklikleri değerlendirmek.
- Her iki hücre tipini ve süpernatantlarını analiz için hasat etmeyi kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Insertlere bir hücre tipinin ekimi.
- Bir çok kuyucuk doku kültür plakasına ikinci hücre tipinin ekimi.
- Insertlerin ikinci hücre tipini içeren kuyulara aktarılması.
- Her iki hücre tipi ve bunların ilgili süpernatantlarının hasat edilmesi.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, hedef hücreler üzerindeki çözünür faktör etkilerinin değerlendirilmesine izin verir.
- Parakrin sinyalizasyon mekanizmalarının çalışılmasını kolaylaştırır.
- Her iki hücre tipinden daha fazla analiz için veri toplanmasına olanak tanır.
- Ortak kültür sistemlerine doğrudan bir yaklaşım sağlar.
Sonuçlar
- Ortak kültür sistemi hücre etkileşimlerinin çalışılması için etkilidir.
- Salgılanan çözünür faktörler, hücreler arasında doğrudan temas olmadan analiz edilebilir.
- Bu yöntem, çok hücreli organizmalardaki hücresel iletişimin anlaşılmasına katkıda bulunabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Insert co-culture systems enable biopharma R&D to de-risk target validation by isolating paracrine signaling effects without confounding cell-cell contact. This approach supports mechanistic understanding of cytokine-mediated neuroinflammation and cytotoxic outcomes in neuronal models. The method provides quantitative, population-specific readouts that inform go/no-go decisions in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring secreted factor effects on target cell phenotypes.
- Operational Value: Enables bidirectional signaling assessment while preserving cell polarity and population-specific detection.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking microglial activation states to neuronal cytotoxicity thresholds.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream cytokine or compound screening in neuroinflammatory models.
- Operational Value: Standardizes soluble factor exchange via defined pore-size inserts, ensuring reproducible paracrine signaling assays.
- Scalability: Facilitates multiplexed condition testing (e.g., LPS dose-response) using identical insert-well configurations.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models disease-relevant neuroinflammation by quantifying microglial cytokine secretion and downstream neuronal LDH release.
- Operational Value: Provides continuity from discovery mechanism validation to preclinical risk assessment of neurotoxic compounds.
- Risk Mitigation: Enables mechanism-based go/no-go decisions by establishing causal links between soluble factors and cellular damage.
Pipeline & Workflow Integration
The insert co-culture method integrates into early discovery biology to validate targets, supports assay development for screening campaigns, and informs translational decisions through quantitative paracrine signaling readouts.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about microglial-derived soluble factors in neuronal dysfunction without direct contact confounders.
- Screening: Delivers standardized, quantitative cytokine and cytotoxicity outputs for compound or genetic perturbation evaluation.
- Analytics: Enables comparison of ELISA-measured cytokines (IL-6, TNF-α, IFN-γ) and LDH release across experimental conditions.
- Translational Research: Connects microglial activation states to neuronal viability outcomes, supporting biomarker-aligned risk assessment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying paracrine signaling in cancer, angiogenesis, differentiation, and neuroinflammation contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by isolating paracrine mechanisms from adhesion-dependent artifacts.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized insert seeding, transfer, and bubble removal procedures.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of neuroinflammatory targets before costly in vivo studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions via dose-dependent cytokine and cytotoxicity correlations.
Implementation Considerations
- Requires aseptic technique expertise for insert handling and media exchange without membrane damage.
- Depends on compatible tissue culture plates and inserts with defined pore sizes (e.g., 0.4 μm PTFE) for factor diffusion.
- Necessitates standardized protocols for cell seeding density, activation timing, and co-culture duration across teams.
- Requires validation of air bubble removal and media equilibration to ensure consistent paracrine signaling.
- Limited to studying soluble factor effects; cannot assess contact-dependent signaling or extracellular matrix interactions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
1:54
Seeding of N9 Microglia in Inserts
3:47
Activation of N9 Microglia With Lipopolysaccharide
5:02
Co-Cultivation of Neuronal PC12 Cells With N9 Microglia
7:31
Results: Lipopolysaccharide-activated N9 Microglia Secrete Cytokines That Are Toxic to Neuronal PC12 Cells
9:48
Conclusion
