Hücre-Hücre İletişim Yokluğunda iki Hücresel Türleri Ekleme Co-kültür Sisteminin Geliştirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, geçirgen bir zara sahip ekler kullanarak iki hücre tipinden oluşan bir hücresel ko-kültür sistemi oluşturmak ve böylece salgılanan çözünür faktörlerin difüzyonuna izin vermektir. Bu, bir hücre tipi içeren eklerin, ikinci bir hücre tipi içeren çok kuyulu bir doku kültürü plakasına ince bir şekilde yerleştirildiği bir dizi adımla gerçekleştirilir. Bir numaralı hücre tipini eklerde tohumlamaya ve iki numaralı hücre tipini çok kuyulu bir doku kültürü plakasında tohumlamaya başlıyoruz.

İkinci adım, eklerin iki numaralı hücre tipini içeren plakanın kuyularına aktarılmasıdır. Sonuç olarak, bu, iki hücre tipinin yanı sıra ilgili süpernatanları hasat etme yeteneği verir. Bu nedenle, salgılanan çözünür faktörlerin ilgilenilen hücre tipi üzerindeki etkisini değerlendirmek mümkündür.

Çok hücreli organizmalarda salgılanan çözünür faktörler, parakrin sinyalizasyonunun bir sonucu olarak farklı hücre tiplerinden yanıtlar ortaya çıkarır. Bu nedenle, bir kesici uç ko-kültür sisteminin değeri, hücre-hücre temasının yokluğunda salgılanan çözünür faktörlerin aracılık ettiği hücresel parametrelerdeki değişiklikleri değerlendirmek için orijinal bir yol sunma yeteneğinde yatmaktadır. Insert ko-kültür sistemleri, diğer ko-kültür tekniklerine göre çeşitli avantajlar sunar, örneğin: biri yönlü sinyalizasyonla; iki korunmuş hücre polaritesi; ve hücresel değişikliklerin üç popülasyona özgü tespiti.

Lipopolisakkarit ile aktive edilmiş N9 mikroglia tarafından salgılanan sitokinin nöronal PC12 hücreleri üzerindeki toksik etkilerini ölçmek için spesifik bir protokol bundan sonra detaylandırılacak ve böylece insert ko-kültür metodolojisinin somut bir şekilde anlaşılması sağlanacaktır. Başlamak için, 24 oyuklu doku kültürü plakasını ve 0,4 mikron por politetrafloroetilen eklerini ambalajlarından çıkarın. Ardından, steril cımbız kullanarak ekin en üst kenarını kavrayarak ekleri doku kültürü plakasının boş kuyularına yerleştirin.

Ardından, zar tamamen kaplanana kadar ekleri rutin N9 ortamı ile doldurun. Hücrelerin bağlanma kabiliyetini artırmak için ekleri en az bir saat veya gece boyunca inkübe edin. Uçlar hazır olduğunda, ekleri tohumlamak için kullanılacak bir hücre süspansiyonu elde etmek için N9 mikrogliasını rutin N9 ortamı kullanarak %80 ila 90 birleşme noktasında bölün.

Ardından, mikropipet ucuyla zarı delmemeye dikkat ederek rutin ortamı eklerden çıkarın. Daha sonra, her bir kesici ucu santimetre kare başına 60.000 hücreye 50 mikrolitre hücre süspansiyonu ile veya kesici uç üreticisinin protokolüne göre tohumlayın. Hücre süspansiyonunu dağıtırken, ara sıra tüpü ters çevirerek homojen kalmasını sağlayın.

Tüm ekler eklendiğinde, hücreleri eşit şekilde dağıtmak için plakayı hafifçe ileri geri, ardından soldan sağa sallayın. Dairesel hareketler yapmaktan kaçının çünkü bu, hücrelerin ekin merkezinde birikmesine neden olur. Daha sonra, N9 mikroglia aktivasyonu ile devam etmeden önce ekleri içeren plakayı 24 saat inkübe edin.

10 miligram lipopolisakkarit tartarak başlayın ve daha sonra kullanmak üzere 1.5 mililitrelik bir Eppendorf Tüpünde saklayın. Lipopolisakkarit güçlü bir proinflamatuar endotoksin olduğundan ve özel güvenlik önlemleri gerektirdiğinden, gözlük, eldiven ve partikül solunum cihazı şiddetle tavsiye edilir. Daha sonra, mililitre başına dört, iki ve bir mikrogramlık çalışma çözeltileri elde etmek için ılık N9 tedavi ortamı kullanarak bir dizi seri lipopolisakkarit seyreltmesi oluşturun.

Son olarak, hücreleri rahatsız etmemeye dikkat ederek kültür ortamının yarısını eklerden çıkarın. Daha sonra, mililitre başına iki, bir veya 0.5 mikrogramlık nihai seyreltmeler elde etmek için eklere yavaşça 25 mikrolitre lipopolisakkarit çalışma solüsyonu ekleyin. Ko-kültür deneylerine devam etmeden önce plakayı 24 saat daha inkübe edin.

Bu adım, santimetre kare başına 30.000 hücrede kaplanmış PC12 hücrelerinin farklılaşmış internöronlarını ve önceki bölümde açıklandığı gibi 24 saat boyunca lipopolisakkarit ile aktive edilen N9 mikrogliasını gerektirir. Tüm ortamı eklerden nazikçe çıkararak ve 50 mikrolitre taze, ılık N9 işlem ortamı ile değiştirerek başlayın. Bu, tüm lipopolisakkarit izlerini çıkarmak için gereklidir ve geriye sadece aktive edilmiş N9 mikroglia kalır.

Doku kültürü plakasının oyuklarında eklerin gevşek olduğunu ve ucun duvara çok sert bastırılması durumunda hareket edebileceğini unutmayın. Bu adım, hava ile uzun süreli temas nedeniyle hücrelerin kurumasını önlemek için her seferinde bir ekleme yapılmalıdır. Daha sonra nöronal PC12 hücre ortamını tamamen çıkarın ve 0.6 mililitre taze, ılık PC12 tedavi ortamı ile değiştirin.

Hücrelerin kurumamasını sağlamak için bunu her seferinde bir tane iyice yapın. Cımbız kullanarak, bir parçanın en üst kenarını kavrayın ve nazikçe nöronal PC12 hücrelerini içeren kuyuya yerleştirin. Tüm kesici uçlar aktarıldığında, kesici uçların zarlarının altında hava kabarcıkları olup olmadığını kontrol edin.

Hava kabarcıkları, ek parçanın zarı boyunca herhangi bir değişimi önleyecek ve tüm deneyi tehlikeye atabilecektir. Cımbız kullanarak ek parçayı kuyudan çok nazikçe kaldırarak ve hücre kültürü ortamına geri yerleştirerek hava kabarcıklarını çıkarın, bu işlem çoğu kabarcıktan kurtulmalıdır. Bununla birlikte, kalıcı kabarcıklar için, eki belirli bir açıyla hücre kültürü ortamına nazikçe daldırmayı deneyin.

Yapışan hücrelerin ayrışmasına neden olma eğiliminde olduğundan, ekleri vurmayın veya karıştırmayın. Daha sonra, hem eklerdeki hem de kuyucuklardaki ortam hacimlerini kontrol edin, her iki bölmedeki sıvı kabaca aynı seviyede olmalıdır. Tüm hava kabarcıkları çıkarıldığında ve ortam hacimleri uygun olduğunda, plakayı inkübe edin.

Hücreler, kültür ortamı veya her ikisi de daha sonra N9 mikroglia ve nöronal PC12 hücreleri arasındaki parakrin sinyalizasyonunun etkilerini ölçmek için hasat edilebilir. Proinflamatuar sitokinleri ölçmek için alt bölmenin hücre kültürü ortamı üzerinde enzime bağlı immünosorbent testleri yapıldı. Sonuçlar, aktivasyon periyodundan 24 saat sonra, mililitre başına iki mikrogram lipopolisakkarit ile tedavi edilen N9 mikrogliasının, tedavi edilmeyen mikrogliaya kıyasla interluken-6, tümör nekroz faktörü-alfa ve interferon gama gibi önemli ölçüde daha fazla proinflamatuar sitokin salgıladığını göstermektedir.

Ek olarak, mililitre başına bir mikrogram lipopolisakkarit ile tedavi edilen N9 mikroglia, 24 saat sonra belirgin şekilde daha fazla interferon gama salgılarken, hücre orta interluken-6 ve tümör nekroz faktörü-alfa seviyelerinde önemli bir artış görmek 48 saat sürdü. Buna karşılık, mililitre başına 0.5 mikrogram koşul, aktivasyon süresinden 24 ve 48 saat sonra N9 mikroglia'da sitokin ekspresyonunu arttıramadı. Ayrıca, mililitre başına iki mikrogram grubundaki 24 saatlik veriler, mikroglial popülasyonda bir artış olan mikrogliozis olduğunu göstermektedir.

Bununla birlikte, hücresel numaranın önemli ölçüde artması ancak 48 saat sonra oldu. Son olarak, artmış sitokin sekresyonu ve mikrogliozosa yol açan mikroglial aktivasyonun sonuçlarını değerlendirmek için, ko-kültürlenmiş nöronal PC12 hücrelerinde sitotoksisite değerlendirildi. Hasarlı hücreler tarafından salınan Hücre Dışı Laktat Dehidrojenaz seviyelerinin ölçülmesiyle, nöronal PC12 hücrelerinin, N9 hücreleri üzerindeki lipopolisakkarit konsantrasyonu arttıkça daha fazla hücre ölümü sergilediği bulundu.

Bu nedenle, bu sonuçlar, salgılanan çözünür faktörlerin ko-kültür eklerinin zarını geçebildiğini ve hücre-hücre temasının yokluğunda nöronal PC12 hücrelerinde sitotoksik hasara neden olabileceğini göstermektedir. Burada yalnızca bir insert ko-kültürü senaryosu sunulmuş olsa da, bu çok esnek bir tekniktir. Bu protokolde, bir hücre tipi, ekin kuyuya aktarılması üzerine ikinci hücre tipinin davranışını etkileyen çözünür faktörlerin salgılanmasını azaltmaktan sorumlu molekül ile ön işleme tabi tutulmuştur.

Bununla birlikte, bir veya her iki hücre popülasyonunun daha sonraki bir tedaviye karşı artan zayıflığını veya direncini tespit etmek için her iki hücre tipini bir ko-kültür sisteminde birlikte inkübe etmek mümkündür. Bu teknik, örneğin bazal parakrin karşılıklı sinyalleşmeyi değerlendirmek için herhangi bir tedavi olmaksızın birlikte inkübe edilen iki hücre popülasyonunu kullanabilir. Burada gösterildiği gibi nöroinflamasyon alanında değerli olmasının yanı sıra, insert ko-kültür sistemleri, tümör regenezi, nörolatirisma, apoptoz sinyali veya parakrin sinyalizasyonunun bir bileşeni olan diğer herhangi bir konu ile ilgili çok çeşitli soruları yanıtlamak için kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, artık insert ko-kültür sistemlerinin, salgılanan çözünür faktörün aracılık ettiği değişiklikleri değerlendirmek için nasıl basit bir yol sunabileceğini iyi anlamış olmalısınız. Ve sizi, hücre-hücre temasının yokluğunda çok hücreli parakrin sinyalleme çalışmasında bu insert ko-kültür sistemlerinin yüksek potansiyeline ikna etmiş olmayı umuyoruz.