Bakteriyel, Bağırsak ve Bağışıklık Hücrelerinde Toksikolojik ve İmmünomodülatör Tedaviler için Asenkron Sistemler Geliştirmeye Yönelik 3D Flipwell Mühendisliği

Bağırsak mukoza ortamını taklit eden 3D bir eş-kültür sistemi geliştirdik; seri çapraz konuşmayı incelemek ve ilaç taraması ile mukozal hücresel etkileşimleri anlamak için kullanılabilecek ilaç yanıtlarını değerlendirdik. Farklı gruplar, çok karmaşık biyomühendislik teknikleri kullanarak bağırsak mukozal ortamını modellemek için birkaç farklı kültür sistemi geliştirmiştir. Ama bunun yerine, daha ucuz malzemelerle yapılması çok daha kolay olan bir ortak kültür sistemi geliştirdik.

Ortak kültür sistemimiz, proteinojenik bir ilacın bağırsak bakterileri, epitel ve bağışıklık hücreleri arasında koordineli yanıtları tetiklediğini, muhtemelen bakteriyel metabolitlerimizle konak bağışıklığını aktive ettiğini ve türler arası iletişimi aracılık ettiğini ortaya koydu. Hem aerobik hem de anerobik bakteri suşlarını ve metabolitlerini inceleyerek bağışıklık modülasyonunu ortaya çıkarmayı ve bakteriyel metabolitlere dayalı yeni immünoterapi stratejilerinin yolunu açmayı hedefliyoruz. Başlamak için bir Petri kabı kapağını açın ve kenara koyun.

Petri kabının tabanına bir bistüri bıçağı yerleştirin. Steril cımbız seti alın ve ambalajın alt kısmını nazikçe yukarı kaldırarak çıkarın. Diğer elinizde, steril bistür bıçağını alıp insert'e getirin.

C şeklinde bir hareketle, zarı kenardan delin ve bistüri bıçağını insert tabanının etrafında nazikçe kaydırın, plastik duvara yakın kalın. PET membranını kesin ve ikinci cımbız setiyle çıkarın. Sonra bistüri bıçağıyla beyaz zar talaşlarını kazıyarak insertin kenarını ve kenarını temizleyin.

Sonra, 2-3 milimetrelik silikon bir damlayı insertin altına nazikçe yayarak zara dokunmamaya dikkat edin. İkinci steril forseps setini alın ve membran olmadan koruyucu paketten dikkatlice ilk inserti kaldırın. İki eklemeyi alt kenarların hizalanması için aşağıdan aşağıya birleştirin.

Flipwell yığını yapıştırıldığında, orijinal steril paketin veya derin bir Petri kabının içine koyarak 72 saat kurutun. Belirlenen Petri kaplarının kapağını yığın montajını kapatmak için kullanın. Yığın montajlarını sterilize etmek için, steril forseps kullanarak Flipwell yığınını belirlenen derin Petri çapaq kenarının kenarına asabilirsiniz.

Sonra, biyogüvenlik kabinin cam şafetini kapatın ve ultraviyole ışığı açın. Kolajen kaplamadan önce sızıntı testi yapmak için önce 500 mikrolitre steril PBS veya steril deyonize su ekleyin. Ertesi gün, test için kullanılan sıvıyı aspire edin ve ardından yığınları biyogüvenlik dolabında 1-2 saat kurutabilirsiniz.

Zarı kollajenle kaplamak için Petri kabının kapağını açın ve Flipwell'in Petri kabının kenarından asılı kalmasına izin verin. Insert yığınının bir tarafına dikkatlice 200 mikrolitre kolajen çözeltisi ekleyin. Kolajen çözeltisini bir saat sonra aspire edin, ardından 200 mikrolitre steril PBS pipetleyin. PBS aspire edildikten sonra Petri kabını bir kapağıyla kapatın ve membranı dolapta 60 dakika kurutsun.

Zar kuruyduğunda, steril forseps veya cımbız kullanın ve Flipwell'i karşı tarafa çevirip Petri kabının kenarından asılı bırakın. Bakteriyel insert yapmak için, iki set steril forseps ve 24 delikli ekleri biyogüvenlik kabinin içine yerleştirin. Steril cımbızla, inserti steril paketinden kaldırın.

İkinci cımbız veya forseps seti ile, insertin altındaki küçük plastik ayakları kırın. 24 kuyu inserti, steril Flipwell co-culture insert yığınlarından birine veya orijinal 12 yuvalı insertlere yerleştirerek test edin. Flipwell'lerin tohumlanmasına başlamak için, Flipwell'in apikal tarafının her iki tarafına 500 mikrolitre epitel hücre hatları tohumlanın.

Montajları bir Petri kabı kapağı ile kaplayın, ardından hücreler tutana kadar gece boyunca %5 karbondioksit ile 37 derece Celsius'ta kuluçka yapın. Petri kabı kapağını açın ve DMEM medyasını Flipwell yığınının apikal tarafından aspire edin. Steril forsepsle, Flipwell'i dikkatlice kancadan tutup 180 derece döndürün.

İkinci steril forseps seti ile, Flipwell yığınını diğer kancadan yukarıya bakacak şekilde tutun. Sonra departmanı tekrar Petri kabına indirin ve kancayı Petri çanak kenarına asın. Ko-kültür insert yığınının apikal tarafına 500 mikrolitre THP-1 hücre süspansiyonu ekleyin.

HT-29 ortamını, kolon epitel hücreleri için derin kuyu Petri kabına ortam ekleyerek ayarlayın. Hava kabarcıklarını çıkarmak için, Flipwell yığınını steril forsepsle kolundan tutun. Bir gavage iğnesini dikkatlice insert montajının içine ve altına indirin ve yumuşak ucu hava baloncuğuna çok nazikçe yerleştirin.

Dikkatlice ve çok yavaş enjektör pistonu yukarı çekin ve hava baloncuklarının yavaşça kaybolmasını izleyin. Sonra iğneyi ve şırıngayı dikkatlice Flipwell'den çıkarın. Hava kabarcıkları gavaj iğnesi ile çıkarıldıktan sonra, her iki hücre tipini hücre kültürü kuluçkasında kültürlendirin.

Forsepsle, inserti steril bir Petri kabının içine yerleştirin ve kapağını kapatın. Petri kabını Flipwell'lerle birlikte biyogüvenlik kabine aktarın ve bakteri ekleriyle kabın karşı tarafına bir kenara koyun. Flipwell'in apikal tarafından 300 mikrolitre DMEM ortamı pipetleyin ki bakteri girişi yapılasın, ardından Petri kabı kapağıyla örtün.

Şimdi, 24 delikli bakteri insertlerine 50 ila 100 mikrolitre Bacillus subtilis kültürü ekleyin ve Flipwell üst kısmına yerleştirin. Kolu döndürün ve Flipwell co-culture insert yığınının kenarına asın. Stack'i ikinci steril forseps setiyle tutun.

Üç saatlik kuluçkadan sonra, Flipwell'den bakteri eklemeyi çıkarmak için steril forseps kullanın. Flipwell'i sökmeden 50 mililitrelik konik bir tüpün içine yerleştirin. Flipwell'i elektron mikroskopisi için söküp çıkarmak için, iki elinizle tutun ve yapıştırılmış her bir parçayı söndürün.

Zarla birlikte inserti döndürün ve membran yukarı bakacak şekilde yere koyun. Inserti tutun, zarı dikkatlice bir bistürle kesin, ardından paraform aldehit çözeltisi içeren 1,7 mililitrelik bir tüpün içine yerleştirin. Konfokal mikroskopi için apikal tarafa 300 mikrolitre steril PBS ekleyin.

PBS'yi pipetledikten sonra Petri kabından yığını dikkatlice çıkarın. Şimdi, Flipwell'i çevirin ve Flipwell ortak kültür yerleştirme yığınının şimdi yukarıya bakan RPMI tarafına 300 mikrolitre PBS ekleyin, ardından fosfatla tamponlanmış tuzlu suyu aspire edin. 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, büyük bir PBS damlası oluşturun.

Insert montajını çevirerek insertlere ayrılın. Sonra THP-1 hücreleriyle birlikte Flipwell yığınını dikkatlice 200 mikrolitrelik PBS damlasının üzerine yerleştirin. Kolon epitel hücreleriyle üst tarafa 200 mikrolitre permeabilizasyon tamponu ekleyin ve 10 dakika boyunca bekletin.

İmmünofluoresan boyama için, insertin üstüne 300 mikrolitre primer antikor pipetleyin. 12 kuyruklu bir plakanın kuyusuna 300 mikrolitre primer antikor ekleyin, ardından inserti damlanın üzerine yerleştirin. Antikoru iyi kapat.

Boyama, epiapterin tedavisinden sonra bağırsak epitel bölmesinde mukus salgılanmasında dramatik artışlar gösterdi; bu, epitel belirteç proteini CK20 ve mukoza proteini MUC2'nin artışlarıyla gösterildi. THP-1 monokültürlerinde, sepiapterin tedavisi M1 makrofaj belirteci CD80'nin ifadesini anlamlı şekilde artırırken, M2 makrofaj belirteci CD163'ü aşağı modüle ederek M1 polarizasyonunu göstermiştir. Taramalı elektron mikroskobisi, sep ile işlenmiş eş kültürlerde epitel hücrelerinden artan mukus salgısı ortaya çıktı.

Sepiapterin tedavisi, hem monokültürlerde hem de ortak kültürlerde M1 fenotipine benzeyen makrofaj morfolojisini indüklemiştir. Sepiapterin ile işlenmiş monokültürlerdeki bakteriyel hücreler, biyofilm oluşumuna özgü buruşuk yüzeyler göstermiştir.