Yatay Dağ Dağı: Derinin kalın, üç boyutlu doku kesitleri için yeni bir İşleme ve Görüntüleme Protokolü

Bu histolojik ve görüntüleme protokolünün genel amacı, cildin epitol antijenisitesini ve yapısal bütünlüğünü koruyan, konfokal görüntüleme modalitelerinden tam olarak yararlanılmasına izin veren sağlam bir sistem sunmaktır. Bu yöntem, karmaşık bir üç boyutlu doku mimarisi içinde herhangi bir hücre tipinin doğasını incelemenin gerekliliği olan temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin standart histolojik tekniklere göre en büyük avantajı, sağlam ve uygulanmasının kolay olmasıdır.

Ek olarak, protokol konfokal mikroskopide üç boyutlu analizi mükemmel bir şekilde tamamlar. Bir farenin dorsal medial bölgesinden toplanan cildi dikdörtgen parçalar halinde keserek başlayın. Her parça, bir kriyo kalıbın dibine sığacak şekilde boyutlandırılmalıdır.

Burada 22 milimetre x 30 milimetre x 20 milimetre kriyokalıba uyan bir santimetre karelik bir sırt derisi alanı gösterilmektedir. Sabitledikten sonra, yıkanmış cildi OCT dolgulu kalıbın dibine doğru itin, böylece altla aynı hizada kalır. Kriyo stat kesiminin yönünü belirlediğinden, saç folikülü oryantasyonunu kriyomold üzerinde işaretleyin.

Dokunun yüzmesini ve yerinden çıkmasını önlemek için kriyo bloklarını eksi 80 derecelik bir dondurucuda metal bir plakaya aktarın. Görünmeyen hava kabarcıkları cildin kriyomoldun yüzeyine yükselmesine neden olabileceğinden, kriyokalıbın altındaki cildin yönünü korumak için dondurma işlemini izleyin. Donmuş bir kriyobloku, kesit düzlemi boyunca kriyokalıp üzerinde belirtildiği gibi, saç folikülü oryantasyonuna sahip bir kriyostat aşamasına sabitleyerek başlayın.

Kriyostat üzerinde tam saç folikülü oryantasyonunun uygun şekilde ayarlanması kritik öneme sahiptir, çünkü bu adım, saç foliküllerinin tüm uzunluğu bozulmadan cilt dilimleri oluşturan kesit düzlemini belirler. 100 mikronluk bir kesiti kesmek için kriyostatı kullanın. OCT'yi gömülü deri parçasının etrafından forseps ile kavrayın ve kriyostattan çıkan bölümü PBS ile doldurulmuş 100 milimetrelik kültüre aktarın.

Oda sıcaklığında, PBS OCT'yi çözecek ve forseps ile kullanımı kolay cilt dilimleri bırakacaktır. Bölümlere ayrıldıktan sonra, yüzen deri bölümlerini 2,5 mililitre PBS içeren 12 oyuklu bir plakanın kuyusuna aktarmak için forseps kullanın. Etiketli 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine önce 500 mikrolitre PB tamponu ekleyerek immünofloresan etiketlemeye başlayın.

Deri dilimlerini 12 oyuklu plakadan bloke etmek için tüplere aktarmak için dikkatlice forseps kullanın. Tüm cilt dilimlerinin tamamen suya batırıldığından emin olun. Mikrosantrifüj tüplerini, oda sıcaklığında bir saat boyunca dakikada 10 salınım veya daha az olan bir testere külbütörüne yerleştirin.

Her cilt dilimi için ayrı 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüplerini etiketleyin ve uygun miktarda primer antikor içeren 500 mikrolitre PB tamponu ekleyin. Bir saatlik blokajdan sonra, deri dilimlerini antikorları içeren taze hazırlanmış tüplere aktarın. Dilimleri bir külbütör üzerinde düşük hızda gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, dilimleri 500 mikrolitre PBS içeren 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve bir külbütör üzerinde oda sıcaklığında bir saat yıkayın. Daha sonra, dilimleri uygun ikincil antikor ve DAPI konsantrasyonu ile 500 mikrolitre PB tamponu içeren ayrı 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Oda sıcaklığında bir saat sallanarak inkübe edin, istenirse numuneler daha fazla işlenene kadar dört santigrat derecede dört güne kadar saklanabilir.

Görüntülemeden önce, ikincil antikorları ve DAPI'yi yıkamak için cilt dilimlerini 500 mikrolitre PBS içeren ayrı mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Ardından, diseksiyon mikroskobu altında koyu bir arka plan üzerine 22 mililitreye 50 mililitrelik bir kapak fişi yerleştirin. Ardından, kapak fişine bir damla %100 gliserol eklemek için ucun ucu kesilmiş 1.000 mikrolitrelik bir pipet kullanın.

Deri dilimini mikrosantrifüj tüpünden gliserol damlacığına aktarın. Ardından, diseksiyon mikroskobundan bakarken, gliserol içinde yüzerken doğal şekillerine geri döndürerek kıvrılan cilt dilimlerini dikkatlice çözmek için sivri forseps kullanın. Dilimin doğal olmayan düzleşmesini zorlamayın, çünkü bu dokuya zarar verebilir.

Bölümün tüm uzunluğu kapak kızağı üzerinde düzgün bir şekilde yönlendirildikten ve düzleştirildikten sonra. Dokuyu normal bir mikroskop lamına monte edin, bu adım cilt dilimini daha da düzeltecektir. Önümüzdeki iki gün içinde gliserol takılı cilt bölümlerini görüntüleyin.

Bu görüntü, sırasıyla epidermal bölmeyi ve yönetmen pili kaslarını görselleştirmek için integrin alfa altı ve integrin alfa sekiz ile etiketlenmiş 10 mikron kalınlığında klasik olarak elde edilen bir cilt kriyo kesitini göstermektedir. Bu 100 mikron kalınlığındaki 3D doku kesiti de aynı şekilde etiketlendi. Gösterilen görüntü, büyük bir z yığınının maksimum projeksiyonlarıdır.

Her iki görüntüden elde edilen detaylar burada yan yana karşılaştırılır, klasik donmuş bölümlerde, integrin alfa altı ile görselleştirilen çoğu saç folikülü, yatay tam bağlara kıyasla bölüm başına ağırlıklı olarak eksik saç folikülleri üreterek tüm uzunluk boyunca bölümlere ayrılmamıştır. Sağlam saç folikülleri ve sağlam arrector pili kasları hem klasik hem de yatay ev montajı bölümlerinde ölçüldü. Biyolojik replikat için bir bölüm ölçüldü, burada görüldüğü gibi, tüm montaj bölümü daha yüksek oranda sağlam folikül ve arrector pili kaslarına sahiptir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu kriyoseksiyon tekniği dakikada 15 bölümden daha yüksek hızlarda gerçekleştirilebilir ve montaj doğru şekilde yapılırsa mükemmel yönlendirilmiş numuneler elde edilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, kalın doku kesitlerinin üç boyutlu bir ortamda nasıl işleneceğini ve analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız.