Name: Yatay Dağ Dağı: Derinin kalın, üç boyutlu doku kesitleri için yeni bir İşleme ve Görüntüleme Protokolü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Keşfedin, fare derisinin kalın üç boyutlu doku kesitleri için yeni bir işleme ve konfokal görüntüleme protokolü. Bu yöntem, antijeniteyi koruyarak karmaşık doku mimarisinin bütünlüğünü sağlar ve hücreleri detaylı incelemeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Thermo-Fisher Scientific&#39;in sponsorluğunu onaylıyor ve konfokal görüntü edinimi sırasında destek için Kings College London&#39;daki Nikon Görüntüleme Merkezi&#39;ne teşekkür ediyoruz.

Tüm hayvan deneyleri, yerel etik onaya tabi tutuldu ve Birleşik Krallık hükümeti Ev Ofisi lisansı koşulları altında gerçekleştirildi. 1. Deri Hasat ve Kriyoprezervasyon <ol><li> Hazırlıklar. <ol><li> 25 mL% 4 PFA içeren 100 mm&#39;lik bir kültür çanağı ve 25 mL&#39;lik 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki adet 100 mm&#39;lik kültür çanağı hazırlayın. </li><li> En uygun kesme sıcaklığı bileşiğiyle (OCT) üçte ikisi kadar dikdörtgen soyulmuş kristal kutuları doldurun. </li><li> Kriyokokarların sonraki adımına yerleştirilebileceği bir metal plakayı -80 ° C derin dondurucuya yerleştirin. </li></ol></li><li> Cilt hasadı, fiksasyon ve kriyoprezervasyon. <ol><li> Hayvan kadavranın dorsal bölgesini kuru bir elektrikli tıraş makinesiyle kırpın. NOT: Bu örnekte, doğum sonrası gün 21 vahşi fareler kullanılmıştır. </li><li> Cilt üzerinde ilgi alanları toplayın. NOT: Fare derisinin dorsomedial bölgesi ( <stronŞekil 1a) eşit olarak aralıklı ve hizalanan, kesitleme için en iyi yönlendirmeyi sağlayan kıl foliküllerinin en yüksek yüzdesini içerir. Altta yatan dermal olmayan dokunun çıkarılması gerekli değildir, ancak gerekirse yapılabilir. </li><li> Hasat gören cildi, saç kökü tanesinin yönsel büyümesini hesaba katarak, kriyormoldun tabanına uyacak şekilde uygun boyutta dikdörtgen parçalara bölün. NOT: Küçük deri dilimleri, yeni başlayanlar için kuluçka ve montaj işlemi sırasında birbirine çarpma ihtimalleri daha düşük olduğu için işlenmesi daha kolay olabilir. Burada gösterilen örnek, bir 22 x 30 x 20 mm cryomold (Şekil 2a) içine uyan dorsal deri, bir yaklaşık 1 cm2 alandır. </li><li> Deri numunelerinin kalınlığına bağlı olarak ( Şekil 1b ) 10-30 dakika, 25 mL% 4 PFA içinde oda sıcaklığında cildi düzeltin. </li><li> Cilt örneklerini 25 mL PBS içinde iki kez yıkayınEn az 5 dakika boyunca ( Şekil 1b ). </li><li> Dondurma işlemi sırasında kristalleşmeye neden olan ve cryosectioning sonuçlarını etkileyebilecek aşırı PBS dokusunu dikkatlice boşaltmak için cilt örneklerini kağıt havlu üzerine koyun. NOT: Standart bir sukroz gradyan gerekli değildir. Bununla birlikte, bu ayrıca kullanıcının takdirine bağlı olarak protokole dahil edilebilir. </li><li> Her cilt örneği için saç köklerinin yöneliminin farkında olun. Görsel yardım için diseksiyon mikroskopu kullanın (özellikle ilk kez protokolü uygulayan herkes). Cilt örneğini OCT dolu dondurma ağzına yerleştirin ve forseps kullanarak kırpılmış saç yüzeyine yapışmış hava kabarcıkları çıkartarak cildin tüm alanlarını OCT ile dengeye getirin ( Şekil 2a ve 2b ). </li><li> Cildi, OCT dolgulu bloğun altına iterek alt kısımyla aynı hizada olacak şekilde itin. NOT: Cilt herhangi bir yönde,Saç folikülü tanecikleri uygun kesim prosedürleri için belirtildiği sürece. Bloklar, kriyoterapi için kriyosataya tutturuldukça, cryomolds yeniden yönlendirilir. Bu adım, kriyostat kesiminin sonraki yönlendirmesini belirlediği için saç kökü yönlendirmesini cryomold üzerinde işaretleyin. </li><li> Dondurucu blokları, dokunun yüzüp çıkmasını önlemek için -80 ° C derin dondurucunun metal plakasına aktarın. </li><li> Görülmeyen hava kabarcığı cildin dondurucu yüzeyine yükselmesine neden olabileceğinden, cryomold&#39;un altında cildin yönünü korumak için dondurma işlemini izleyin. NOT: Dondurulmuş dokuya sahip olan krison kapsülleri -80 ° C&#39;de bir yıldan fazla saklanabilir ve ek bölümler için tekrar kullanılabilir. </li></ol></li></ol><img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig1.jpg" /> Şekil 1. Fare derisinin hasat edilmesi ve fiksasyonu. </strong&gt; ( A ) Deri dokusu, hayvan kadaverinin dorsomedial bölgesinden hasat edildi. Bu bölgedeki kıl folikülleri eşit aralıklarla hizalanır ve bu nedenle oklarla gösterildiği gibi bölümleme esnasında optimum yönlendirme sağlar. ( B ) Kriyomole uyan uygun bir boyuttaki kareleri kestikten sonra, cilt dokusu 15 dakika% 4 PFA içinde sabitlenmiş ve her biri 5 dakika PBS&#39;de iki kez yıkanmıştır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> 2. Kalın Doku Kesitleri <ol><li> Kriyostat üzerine monte edilecek hazırlık ve doku yönlendirmesi. <ol><li> 15 mL PBS ile 100 mm&#39;lik bir kültür çanağı hazırlayın. Kriyostatın üzerinde kolayca erişilebilen bir alana koyun. Buna ek olarak, oyuk başına 2.5 mL PBS ile 12 oyuklu bir plaka hazırlayın; S uzun süreli saklama için örneklere göre etiket4 ° C sıcaklıkta. Bölümleri tutmak için forseps kullanın. </li><li> Kriyostatın sıcaklığını -20 ° C&#39;ye ayarlayın. NOT: Sıcaklık kesitlemeyi etkileyebilir, ancak iyi bir kılavuz -20 ° C&#39;de başlamaktır. </li><li> Yaklaşık iki folikül kalınlığına sahip bölümler elde etmek için kriyostatın kesitlerini 150 μm kalınlığa ayarlayın. NOT: Kesitin kalınlığı, kullanıcının ihtiyaçlarına ve analiz için kullanılacak mikroskop sınırlamalarına bağlı olarak değişebilir. NOT: Örneğin yönü, saç follikülleri ile uygun yönde cilt bölümleri elde etmek için kritiktir. Bu, kriyostat bloğuna düzgün şekilde monte edilerek gerçekleştirilir. Kesit düzleminin saç follikülü yönüne paralel olduğundan emin olun ( Şekil 2c ). Daha önce de belirtildiği gibi, cilt örneğinde kesit düzleminin doğru yönlendirilmesi, elde edilen görüntülerin kalitesini belirlemek için çok önemli bir adımdır.Daha sonraki bir adım. </li></ol></li></ol><img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig2.jpg" /> Şekil 2. Gömme, kriyoprezervasyon ve kesit alma. ( A ) Siyah oklarla belirtilen cryomold&#39;da saç kökü (HF) yönünün işaretlenmesi, kriyoteksiyon sırasında doğru yönlendirme için önemlidir. ( B ) Kesit düzlemi, saç foliküllerinin tam uzunluğunun bozulmadığı bölümler oluşturmak için kıl folikül yönelimi ile hizalanmalıdır. ( C ) Kesitler, saç kökü yönünde siyah oklarla gösterilen kıl folikülü yönüne göre kesilmiştir. cryomold. ( D ) Kalın doku kesitleri metal forsepslerle toplandı ve ( e ) 1x PBS içeren 100 mm&#39;lik bir kültür çanağına aktarıldı. ( F ) Oda sıcaklığında, PBS OC&#39;yi uzaklaştırır.T. Beyaz oklarla gösterildiği gibi kalın doku kesitlerini çevreleyen bileşik. Bölümler daha sonra PBS&#39;de serbestçe yüzerler. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <ol start="2"><li> Cryosectioning. <ol><li> Kriyostatı kullanarak bir kesit kesin. Gömülü deriyi içeren OCT&#39;yi toplamak için forseps kullanın ( Şekil 2d ). NOT: Optimum numune konumlandırması için X, Y ve Z eksenlerinde bağımsız hareket ve ayarlama olanağı sağlayan bir kriyostat kullanın. Bu, ideal hizalı doku kesitlerinin oluşturulmasını sağlar. </li><li> Kriyostatın bölümünü PBS ile dolu 100 mm&#39;lik kültür çanağına aktarın ve bir sonraki dilimle devam edin. Örnekleri bir slaytta toplamayın ( Şekil 2e ). NOT: Oda sıcaklığında, PBS çözülürForseps ile ele alınması kolay deri dilimleri bırakarak ( Şekil 2f ) OCT. NOT: 100 mm kalınlığındaki birçok doku kesitini çözdükten sonra 100 mm&#39;lik kültür çanağında taze PBS gerekli olabilir ve buna göre değiştirilebilir. </li><li> Yüzen cilt bölümlerini 2.5 mL&#39;lik PBS ile dolu 12 çukurlu bir kâğıda doğru şekilde etiketlenmiş kuyuya aktarmak için forseps kullanın ( Şekil 3a , solda). NOT: 4 ° C&#39;de, numuneler en az iki gün boyunca depolanabilir. Kesitten sonra deri içeren OCT bloklarının uzun süre depolanması için, kesme yüzeyini yeni OCT damlacıklarıyla sızdırmaz kılın OCT damlasının dondurulmasından sonra kullanılan OCT bloğunu parafilm içine sarın ve tekrar -80 ° C dondurucuya yerleştirin . </li></ol></li></ol> 3. İmmünofloresan etiketleme. <ol><li> PB tamponunu (% 0.5 yağsız süt tozu,% 0.25 balık cilt jelatin ve% 0.5 Triton X-100 ile takviye edilmiş PBS) leas&#39;ta hazırlayınT 2 saat önce, daha önce tarif edildiği gibi 5 . NOT: Boyama tamponunun tekrar tekrar kullanılması için antikor koruması için PB tamponuna sodyum azid eklenebilir. </li><li> 1.5 mL&#39;lik mikrosantrifüj tüplerine etiketleyin ve tüp başına 500 PB&#39;lik PB tampon ekleyin. Deri dilimlerini PBS&#39;den bloke etmek için PB tamponu içeren ayrı tüplere aktarmak için dikkatle forseps kullanın ( Şekil 3a , sağ). Tüm deri dilimlerinin tamamen suya daldığından emin olun. Mikro santrifüj tüplerini oda sıcaklığında 1 saat süreyle doku bütünlüğünü bozmamak için dakikada 10 osilasyondan daha yüksek olmayan bir hızda bir testere kulakçığı üzerine yerleştirin. NOT: Hızın, testere kulakçığı üzerinde dakika başına 10 salınımı aşmaması kritiktir, çünkü sıkışma meydana getirecektir. <ol><li> Her ne kadar mikrosantrifüj tüpü başına birden fazla dilim eklemek, antikorları kurtarmak mümkün olsa da, tüp başına sadece bir dilim yerleştirin. Antikor kullanımını azaltmak için, bir hacim kullanın250 uL. NOT: Gerekirse, örneğin 96 oyuklu plakalar ile mikro santrifüj tüplerini değiştirin. Bununla birlikte, kalın doku kesitlerinin 1.5 mL&#39;lik mikrosantrifüj tüplerine yerleştirilmesi, sıvı pertürbasyonunun artması nedeniyle dokuda en etkili antikor penetrasyonuna olanak tanır. </li></ol></li><li> Her bir cilt dilimi için ayrı 1.5 mL&#39;lik mikrosantrifüj tüplerini etiketleyin ve 500 uL PB tampon ve uygun birincil antikor miktarı ekleyin. 1 saatlik bloke olduktan sonra cilt dilimlerini, antikorları içeren taze hazırlanmış tüplere aktarın. Dilimleri gece boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. NOT: Bu örnekte, aşağıdaki primer antikorlar kullanılmıştır: 1: 50&#39;lik bir konsantrasyonda FITC sıçan anti-insan CD49f&#39;si ve 1: 100&#39;lük bir konsantrasyonda keçi anti-fare / sıçan integrin alfa 8. </li><li> Ertesi gün, örnek başına 500 μL PBS içeren iki ayrı 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü hazırlayın. Cilt dilimleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca iki kez yıkanır.e. </li><li> Uygulanabilir sekonder antikorların ve 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindolün (DAPI) uygun konsantrasyonu ile 500 uL PB tampon içeren ayrı 1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın. NOT: Bu örnekte kullanılan sekonder antikorlar Alexa Fluor 488 eşek anti-sıçan IgG ve Alexa Fluor 555 eşek anti-keçi IgG&#39;dir ve 1: 500&#39;lük bir konsantrasyonda bulunur. DAPI, 1: 100 konsantrasyonda kullanıldı. </li><li> Cilt örneklerini, ikincil antikor ve DAPI içeren PB tamponuna dikkatlice aktarın ve cilt dilimleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca düşük bir hızda rotator veya çalkalayıcıda inkübe edin. </li><li> Dilimleri 4 ° C&#39;de ikincil antikor ve DAPI içeren PB tamponuna dört güne kadar saklayın ve sodyum azid PBS&#39;ye ilave edilirse muhtemelen daha uzun süre saklayın. </li></ol><img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig3.jpg" /> Şekil 3. İmmunofluoreskopEtiketleme ve montaj. ( A ) Yüzen doku kesitleri 12 yuvalı plakalarda en az iki gün boyunca 4 ° C&#39;de saklanabilir. İmmünoflöresan (IF) etiketlemeden önce, ilgilenilen doku kesitlerini, okla gösterildiği gibi bloke etmek için PB tamponu içeren 1.5 mL&#39;lik mikrosantrifüj tüplerine aktarın. IF etiketi için, 3. adımda ayrıntılı olarak hazırlanan çok adımlı işleme dikkat edin. Basamak 3&#39;ün bir kısmı, ok 2 ile gösterilen birincil antikor çözeltisi, ikincil antikor çözeltisi veya yıkama tamponu içeren yeni hazırlanmış mikrosantrifüj tüplerine doku kesitlerinin dikkatle aktarılmasını gerektirir. ( B ) IF etiketi sonrasında, doku çapraz kesitleri, Kesit mikroskop yardımı ile gliserol damlasında çözülür ve düzleştirilir. ( C ) Doku kesiti, bir kapak kaymasının tabanına tamamen düzleştirildiğinde, bölümün monte edilmesi için düzenli bir mikroskop lamı kullanılır. <aHref = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bu figürde daha büyük bir versiyon görmek için lütfen tıklayınız. 4. Mikroskopik Görselleştirme için Montaj <ol><li> Görüntülemeden önce, cilt dilimlerini, ikincil antikorları ve DAPI&#39;yı uzaklaştırmak için 500 μL PBS içeren ayrı mikrosantrifüj tüplerine aktarın. </li><li> 1000 μL&#39;lik bir pipet kullanın, ancak son derece yapışkan gliserolün uygun pipetlenmesini sağlamak için pipet ucunun ilk 0,5 cm&#39;ini kesin. Bir diseksiyon mikroskop ( Şekil 3b ) altında koyu bir arka plan üzerine bir 22 x 50 mm lamel yerleştirin. </li><li> Kaplama kağıdına bir damla% 100 gliserol ekleyin ( Şekil 3b ). Cilt dilimini mikrosantrifüj tüpünden gliserol damla üzerine aktarın. Düzeltici mikroskopu kullanın ve kıvrılmış olan cilt dilimlerini özenle çözmek için forsepsleri işaretleyin. NOT: Dilim glifte yüzerkenSerum damlacıklarında dokunun doğal görünümünü normal şekline geri döndürerek dengelenebilir. Dilimin doğal olmayan düzleştirmesini zorlamayın çünkü bu dokuya zarar verebilir. </li><li> Deri bölümünün tüm uzunluğu kapak kayma düzeneğine uygun şekilde yönlendirilip düzleştirildiğinde dokuyu monte edin; Düzenli bir mikroskop slayt kullanın. Bu adım cilt dilimini daha da düzleştirir. NOT: Hava sızıntısından kaçının ( Şekil 3c ). </li><li> Önümüzdeki iki gün içinde gliserole monte cilt bölgelerindeki görüntüsünü alın. NOT: Uzun süreli saklama doku ve görüntüleme kalitesini olumsuz etkileyecektir. Bu örnekte, tüm görüntüler 20x&#39;lik bir objektif kullanılarak dik bir konfokal mikroskop kullanılarak elde edildi. </li></ol>

<ol><li>Plikus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+dermal+BMP+signalling+regulates+stem+cell+activation+during+hair+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration.</a> Nature. 451 (7176), 340-344 (2008).</li>
<li>Zhang, Y. V., Cheong, J., Ciapurin, N., McDermitt, D. J., Tumbar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+self-renewal+and+differentiation+phases+in+the+niche+of+infrequently+dividing+hair+follicle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct self-renewal and differentiation phases in the niche of infrequently dividing hair follicle stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (3), 267-278 (2009).</li>
<li>Jensen, U. B., Lowell, S., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatial+relationship+between+stem+cells+and+their+progeny+in+the+basal+layer+of+human+epidermis%3A+a+new+view+based+on+whole-mount+labelling+and+lineage+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The spatial relationship between stem cells and their progeny in the basal layer of human epidermis: a new view based on whole-mount labelling and lineage analysis.</a> Development. 126 (11), 2409-2418 (1999).</li>
<li>Braun, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment%3A+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).</li>
<li>Driskell, R. R., Giangreco, A., Jensen, K. B., Mulder, K. W., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2-positive+dermal+papilla+cells+specify+hair+follicle+type+in+mammalian+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sox2-positive dermal papilla cells specify hair follicle type in mammalian epidermis.</a> Development. 136 (16), 2815-2823 (2009).</li>
<li>Niculescu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+ablation+of+integrin+alpha-6+in+mouse+epidermis+leads+to+skin+fragility+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Conditional ablation of integrin alpha-6 in mouse epidermis leads to skin fragility and inflammation.</a> Eur J Cell Biol. 90 (2-3), 270-277 (2011).</li>
<li>Fujiwara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basement+membrane+of+hair+follicle+stem+cells+is+a+muscle+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche.</a> Cell. 144 (4), 577-589 (2011).</li>
<li>Desciak, E. B., Maloney, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artifacts+in+frozen+section+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatol+Surg%22%5BJournal%5D)">Artifacts in frozen section preparation.</a> Dermatol Surg. 26 (5), 500-504 (2000).</li>
<li>Driskell, R., Jahoda, C. A., Chuong, C. M., Watt, F., Horsley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+dermal+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Defining dermal adipose tissue.</a> Exp Dermatol. 23 (9), 629-631 (2014).</li>
<li>Driskell, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+fibroblast+lineages+determine+dermal+architecture+in+skin+development+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair.</a> Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).</li>
<li>Snippert, H. J., Schepers, A. G., Delconte, G., Siersema, P. D., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slide+preparation+for+single-cell-resolution+imaging+of+fluorescent+proteins+in+their+three-dimensional+near-native+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Slide preparation for single-cell-resolution imaging of fluorescent proteins in their three-dimensional near-native environment.</a> Nat Protoc. 6 (8), 1221-1228 (2011).</li>
<li>Sada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+cellular+lineage+hierarchy+in+the+interfollicular+epidermis+of+adult+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Defining the cellular lineage hierarchy in the interfollicular epidermis of adult skin.</a> Nat Cell Biol. 18 (6), 619-631 (2016).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23722210">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li>
<li>Tetteh, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replacement+of+Lost+Lgr5-Positive+Stem+Cells+through+Plasticity+of+Their+Enterocyte-Lineage+Daughters%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters.</a> Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar, bu yazının yayınlanmasının Thermo-Fisher Scientific Inc. tarafından finanse edildiğini açıklamak istiyorlar.

Burada, klasik donmuş bölümlere göre çeşitli avantajları olan "yatay tam montaj" tekniğini sunuyoruz. Tekniğimizin bir avantajı, standart histoloji ekipmanı ve konfokal mikroskop ile kolayca gerçekleştirilebilmesidir. İkincisi, doku bütünlüğü standart kriyoseksiyonlara göre daha üstün bir şekilde korunur. Örneğin, hipodermal tabaka içindeki adipositler (yani, dermal beyaz adipositler (DWAT))9 standart kriyoseksiyonlarda ciddi şekilde bozulur, bu da yağ yüklü dokuların incelenmesini imkansız hale getirir. Tekniğimiz, bu tabakadaki adipositlerin tam analizine izin verir ve yüksek adiposit içeriğine sahip diğer dokulara uyarlanabilir. Ayrıca, bu, soy izleme çalışmalarında mezenkimal hücrelerin daha iyi saptanmasına izin verir 2,10.
Standart kriyoseksiyonlar, doğaları gereği, konfokal mikroskopi yoluyla bir dokunun gerçek 3D yönlerini asla ortaya çıkaramaz. Bu, saç kökleri ve alt yapıları, klasik kriskesörlerde kullanılan standart 10 μm kalınlığını aşan bir derinliği geçebildiğinden, daha kalın bölümlerin cilt analizinde avantajlı olduğu anlamına gelir. Örneğin bağırsak ve beyin gibi diğer dokuların, dokuyu 3 boyutlu bir yapı olarak görme konusunda benzer zorluklara sahip olması ilgimizi çekiyor 2,7,11,12,13. Şaşırtıcı bir şekilde, tekniğimizin bağırsaklardaki belirli uygulamalarda kullanım için faydalı olduğu zaten gösterilmiştir14. Yatay tam montaj protokolümüzün 3D analiz gerektiren diğer dokulara uygulanma potansiyeline sahip olduğuna inanıyoruz.

Mikroskobik görüntüleme ekipmanının devrimi sofistike, yüksek çözünürlüklü görüntüleme aletleri sağlar. Bununla birlikte, komple bir üç boyutlu (3D) doku kesitinin mikroskobik bir görüntüsünü elde ederken, numune hazırlama önemli zorluklar sunar ve görüntü kalitesini tanımlamada sınırlayıcı faktör olabilir. Her ayrı adım, doku morfolojisini ve hedef proteinlerin antijenikliğini korumak, işleme neden olan eserleri en aza indirgemek ve nihai görüntü kalitesini en üst düzeye çıkarmak için dikkatle düşünmeyi hak ediyor. Örneğin, cildin geleneksel analizi, kök hücre bölmesinin cilt homeostazına katkılarını anatomik olarak analiz etmeye olanak tanıyan saç folikülleri düzgün şekilde yönlendirilmiş epidermis ve dermis manzaralı bir görüntü gerektirir 1 , 2 . Bu, cildin gömülü ve kesit üzerine nasıl yoğunlaşıldığını gerektirir. Önemlisi, saç follikülleri daha kalın olabilirStandart parafin veya dondurulmuş kesit kalınlığını büyük ölçüde aşan 100 μm&#39;den daha büyüktür ve tüm montaj parçaları veya kalın kesitler 3 , 4 , 5&#39;e kıyasla daha düşük bir analiz standardı sağlar. Birlikte ele alındığında, mikroskopik analiz için numune hazırlamanın her bir adımı, görüntü analizini etkileyen kritik bir belirleyicidir. Burada, &quot;yatay bütün montaj&quot; olarak adlandırdığımız kalın, 3D doku kesit analizi için yeni bir işleme protokolü sunuldu. Protokol, antijenikliği oldukça korur ve standart konfokal görüntüleme ekipmanı kullanarak cildin kalın bölümlerinin tam olarak kullanılmasını sağlar. Bu, doku hasadı ve paraformaldehit (PFA) ile desteklenmiş kriyoprezervasyon (1. adım), bir kriyostatla 100 μm kalınlıkta doku kesitlerinin oluşturulması da dahil olmak üzere kalın doku kesiti işleme ve görüntüleme için cildi kullanmanın tam bir rehberidir (basamak 2) Ve immünofloresan etiketleme ve montaj (adım 3 ve 4). Temsilci sonuçlar, bu protokolün potansiyel kullanıcısı için &quot;yatay tüm montajların&quot; avantajlarını vurgulayan iki farklı histolojik hazırlama tekniğinin (klasik cryosectioning ve kalın, 3D doku kesit kesitleri) konfokal görüntülerini karşılaştırır.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>ev yapımı</td></tr><tr><td>Jelatin, soğuk su balık derisinden</td><td>Sigma</td><td>G7765</td><td>250ML</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>BDH Laboratuvar Malzemeleri</td><td>444482V</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. bileşik</td><td>VWR kimyasalları</td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way gömme kalıpları</td><td>Sigma</td><td>E6032-1CS</td><td>Kare S-22</td></tr><tr><td>Yağsız Süt Tozu Bio</td><td> Temel A.Ş.</td><td>NB0669</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>500ML</td></tr><tr><td>4 & asal;, 6-Diamidino-2-fenilindol, dilaktat (DAPI)</td> <td>İnvitrojen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>FITC Sıçan Anti-İnsan CD49f</td><td>BD Pharmingen</td><td>555735</td><td></td></tr><tr><td>Fare / Sıçan Integrin alfa 8 Antikor</td><td>R & D Sistemleri</td><td>AF4076</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 eşek anti-sıçan IgG</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A21208</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 eşek anti-keçi IgG</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A21432</td><td></td></tr><tr><td>CryoStar NX70</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100mm Kültür kapları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık neşterler</td><td>Swann-Morton</td><td>Ref 0501</td><td></td></tr><tr><td>sivri metal forseps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri</td><td>VWR</td><td>211-2130</td><td></td></tr><tr><td>12 Kuyulu plakalar</td><td>Sigma</td><td>CLS3513</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ul ve 1000 ul Pipet</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1000 & mikro; l XL Dereceli TipOne Filtre Ucu (Steril)</td> <td>Star Lab</td><td>S1122-1830</td><td></td></tr><tr><td>20 & l Eğimli TipOne Filtre Ucu (Steril)</td><td>Star Lab</td><td>S1120-1810</td><td></td></tr><tr><td>Sallanan çalkalayıcı plaka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop slaytları, menzel Glaeser</td><td>Thermos Scientific</td><td>631-9483</td><td>Superfrost Plus</td></tr><tr><td>Kapak Camları, Menzel Glaeser</td><td>Thermos Scientific</td><td>MENZBB024060AB</td><td>24 x 60 mm</td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

yatay dağ dağı: derinin kalın, üç boyutlu doku kesitleri için yeni bir İşleme ve görüntüleme protokolü

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Bilimsel bir argümanı destekleyen mikroskopik bir görüntü oluşturmak için bir ilgi dokusu işleme zorlu olabilir. Yüksek kaliteli mikroskobik görüntülerin elde edilmesi tamamen mikroskop kalitesine değil aynı zamanda çoklu kritik eylem veya basamakları içeren doku işleme yöntemlerine de bağlıdır. Dahası, derideki ve diğer dokulardaki mezenkimal hücre türleri, doku hazırlama ve görüntüleme için yeni bir mücadeleyi temsil eder. Burada, doku hasatından mikroskobiye kadar eksiksiz bir süreç sunuyoruz. &quot;Yatay tüm montaj&quot; olarak adlandırılan tekniğimiz, acemilerin hızlı bir şekilde yetkinleşebildikleri ve bir kriyostatla kesilen 60-300 μm kalınlıktaki kesitlerde antijenlerin korunması ve algılanmasına izin veren tekniğidir. Bu kalınlığın kesitleri, üç boyutlu bir çevrede doku mikro mimarisinin gelişmiş görselleştirilmesini sağlar. Buna ek olarak, protokol, mezenkimal hücreleri, görüntü kalitesini arttıran bir şekilde korur.Standart kriyostat veya parafin kesitlerine kıyasla azaltılır, böylece immün boyamanın etkililiği ve güvenilirliği artar. Bu protokolün deri ve muhtemelen diğer doku ve organları görselleştiren tüm laboratuvarlara fayda sağlayacağına inanıyoruz.

Tekniğimizin avantajlarını vurgulamak için, kalın, 3D doku kesit tekniğini &quot;yatay tüm montaj&quot;, klasik dondurulmuş kesitlerle karşılaştırdık. Klasik dondurulmuş kesitler daha önce tarif edildiği gibi kesildi 5 . Te mikroskobik görüntüleri epidermis için görsel bir yapı temin etmek için, temel bazal membran 6 epidermal hücreleri bağlayan bir bileşeni olan alfa-6 (Itga6), integrin immunohistokimyasal. Ayrıca piloerection (ayrıca &quot;goosebumps&quot; olarak da bilinir) sorumlu arrector pili kas (APM), integrin alfa-8 7 ile etiketlendi. Klasik dondurulmuş kesitlerde, Itga6 ile görülen çoğu saç follikülü, tüm uzunluk boyunca kesitlendirilmedi ve kesit başına tam olarak eksik kıl follikülleri üretildi ( Şekil 4a- 4d) </strong&gt;). Kalın doku kesitleri, geleneksel 10 um kesitlere kıyasla daha Z-yığın katmanları elde etmeyi mümkün kılar ve daha eksiksiz bir 3D görüntüsünü sağlar. Bu, saç follikülleri ve üzerinde bulunan bazal membran ile bağlantılı olan APM&#39;lerin bütünlüğünü incelerken daha belirgindir. Klasik kriyoteksiyonlarda APM&#39;lerin büyük kısmı kesir ( Şekil 4a- 4d ). Ek olarak, hipodermal bölmenin doku bütünlüğü, dondurma bölmeleri, iyi bilinen bir dondurarak eriten eser olan ılık cam slaytlara tutturulduğunda adipositlerin tahrip edilmesine kıyasla yatay tüm montajlarda korunur ( Şekil 4a -b , hipodermal Bölgeler) 8 . <img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig4.jpg" /> Şekil 4. Yatay bütün mouNt, klasik bir kriyoseksiyonla karşılaştırılmıştır. ( A ) Klasik olarak elde edilen 10 μm kalınlığındaki deri cryosections ve ( b ) 100 μm kalınlıkta 3D doku kesitleri, epidermal bölmeyi ve arrektör pili kaslarını görselleştirmek için integrin alfa-6 (Itga6) ve integrin alfa-8 (Itga8) ile etiketlendi , sırasıyla. Kalın doku kesitlerinin görüntüleri büyük bir Z istifinin maksimum projeksiyonları olarak gösterilir. Beyaz çerçeveler, ( c ) klasik ve ( d ) yatay tüm montaj bölümlerinde görüntülenen, büyütülen alanları göstermektedir. ( E ) Sağlam kıl follikülleri ve ( f ) bozulmamış arrector pilori kasları hem klasik hem de yatay tüm montaj bölümlerinde nicelendirildi. Ölçek çubukları 100 μm&#39;yu gösterir. Veriler, Ortalama ± Ortalama Ortalama Hata Ortalaması (SEM) olarak gösterilir. Biyolojik çoğaltım başına bir bölüm ( n = 3) nicelendirildi. Eşlenmemiş t-testi * P &lt;0.05, *** P &lt;0.0005. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

Bu çalışma, konfokal görüntüleme yöntemlerinin tam olarak kullanılmasını sağlayan kalın, üç boyutlu doku kesiti analizi için yeni bir işleme ve görüntüleme protokolü sunmaktadır. Bu protokol antijenliği korur ve cilt histolojisini ve potansiyel olarak diğer doku tiplerini analiz etmek için sağlam bir sistemi temsil eder.

Yatay Dağ Dağı: Derinin kalın, üç boyutlu doku kesitleri için yeni bir İşleme ve Görüntüleme Protokolü

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Bu histolojik ve görüntüleme protokolünün genel amacı, konfokal görüntüleme yöntemlerinden tam anlamıyla yararlanmaya olanak tanıyan, derinin epitop antijenitesini ve yapısal bütünlüğünü koruyan sağlam bir sistem sunmaktır. Bu yöntem, karmaşık üç boyutlu bir doku mimarisi içindeki herhangi bir hücre tipinin doğasını inceleme gereksinimi duyulan temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin standart histolojik tekniklere göre temel avantajı, sağlam ve uygulanmasının kolay olmasıdır.Ayrıca, protokol konfokal mikroskopideki üç boyutlu analizleri mükemmel şekilde tamamlamaktadır. Bir farenin dorsal medial bölgesinden alınan deriyi dikdörtgen parçalar şeklinde kırparak başlayın. Her bir parçanın boyutu, bir kriyokalıbın tabanına sığacak şekilde ayarlanmalıdır.22 mm x 30 mm x 20 mm boyutlarındaki bir kriyokalıba sığan bir santimetrekarelik dorsal deri alanı burada gösterilmektedir. Sabitleme işleminden sonra, yıkanmış deriyi OCT ile doldurulmuş kalıbın tabanına, tabana tamamen paralel olacak şekilde itin. Kriyostat kesim yönünü belirlediği için kıl folikülü yönlemini kriyokalıbın üzerine işaretleyin.Dokunun yüzmesini ve yerinden oynamasını önlemek için kriyoblokları -80 °C dondurucudaki bir metal plaka üzerine aktarın. Görünmeyen hava kabarcıkları derinin kriyokalıbın yüzeyine yükselmesine neden olabileceğinden, derinin kriyokalıbın tabanındaki yönelimini korumak için dondurma sürecini izleyin. Kesme düzlemi boyunca kriyokalıpta belirtildiği üzere, kıl folikülü yönüne göre dondurulmuş bir kriyobloku kriyostat tablasına sabitleyerek işleme başlayın.Kriyostat üzerindeki kıl folikülü oryantasyonunun tam olarak ayarlanması kritiktir, çünkü bu adım, kıl foliküllerinin tüm uzunluklarının bozulmadan kaldığı deri kesitlerini oluşturan kesit düzlemini belirler. 100 micron kalınlığında bir kesit almak için kriyostatı kullanın. Gömülü deri parçasının etrafındaki OCT'yi pensle tutun ve kesiti kriyostattan çıkararak PBS ile doldurulmuş 100 millimeter kültür kabına aktarın.Oda sıcaklığında, PBS, OCT'yi çözerek deri kesitlerinin pensle kolayca tutulmasını sağlayacaktır. Kesme işleminden sonra, yüzen deri kesitlerini pens yardımıyla 2,5 milliliters PBS içeren 12 kuyucuklu bir plakanın kuyucuğuna aktarın. Etiketlenmiş 1,5 milliliter mikrosantrifüj tüplerine öncelikle 500 microliters PB tamponu ekleyerek immünofloresan işaretlemeye başlayın.Cilt kesitlerini 12 kuyucuklu plakadan bloklama tüplerine aktarmak için pensetleri dikkatlice kullanın. Tüm cilt kesitlerinin tamamen daldırıldığından emin olun. Mikrosantrifüj tüplerini, oda sıcaklığında bir saat boyunca, dakikada 10 osilasyon veya daha az hızdaki bir tahterevalli sallayıcıya yerleştirin.Her bir deri kesiti için ayrı 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüplerini etiketleyin ve uygun miktarda primer antikor içeren 500 mikrolitre PB tamponu ekleyin. Bir saatlik bloklama işleminin ardından, deri kesitlerini antikorlar içeren taze hazırlanmış tüplere aktarın. Kesitleri, bir sallayıcı üzerinde düşük hızda, dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin.Ertesi gün, kesitleri 500 µL PBS içeren 1,5 mL mikrocentrifüj tüplerine aktarın ve bir sallayıcı (rocker) üzerinde oda sıcaklığında bir saat boyunca yıkayın. Ardından kesitleri, uygun konsantrasyonda sekonder antikorlar ve DAPI içeren 500 µL PB tamponu bulunan ayrı 1,5 mL mikrocentrifüj tüplerine aktarın. Sallama eşliğinde oda sıcaklığında bir saat inkübe edin;le isteğe bağlı olarak, örnekler ileri işlemler yapılana kadar 4 °C'de dört güne kadar saklanabilir.Görüntüleme öncesinde, sekonder antikorları ve DAPI'yi yıkamak için deri dilimlerini 500 µL PBS içeren ayrı mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Ardından, bir diseksiyon mikroskobu altında, 22 mm x 50 mm'lik bir lamel kapak camını koyu renkli bir arka plana yerleştirin. Sonrasında, ucunun ucu kesilmiş 1.000 µL'lik bir pipet kullanarak lamel üzerine bir damla %100 gliserol ekleyin.Deri kesitini mikrocentrifüj tüpünden gliserol damlasının üzerine aktarın. Ardından, diseksiyon mikroskobu altından bakarak, gliserol içinde yüzen ve kıvrılmış olan deri kesitlerini, onları dikkatlice doğal şekillerine geri getirerek sivri uçlu pens yardımıyla açın. Kesitin yapay bir şekilde düzleştirilmesine zorlamayın, çünkü bu durum dokuda hasara yol açabilir.Kesitin tüm uzunluğu lamel üzerinde uygun şekilde yönlendirildiğinde ve düzleştirildiğinde, dokuyu standart bir mikroskop lamı üzerine monte edin; bu adım cilt kesitinin daha da düzleşmesini sağlayacaktır. Gliserol ile monte edilmiş cilt kesitlerini önümüzdeki iki gün içinde görüntüleyin.Bu görüntü, epidermal bölmeyi ve sırasıyla kıl folikülü kaslarını görüntülemek için integrin alfa altı ve integrin alfa sekiz ile işaretlenmiş, klasik yöntemle elde edilmiş 10 mikron kalınlığındaki bir deri kriyoseksiyonunu göstermektedir. Bu 100 mikron kalınlığındaki 3D doku kesiti de aynı şekilde işaretlenmiştir. Gösterilen görüntü, geniş bir z-yığınının maksimum projeksiyonlarıdır.Her iki görüntüdeki ayrıntılar burada yan yana karşılaştırılmıştır; klasik dondurulmuş kesitlerde, integrin alfa altı ile görselleştirilen çoğu kıl folikülü tüm uzunluk boyunca kesilmemiş olup, yatay bütün bağlama (whole mount) yöntemine kıyasla kesit başına ağırlıklı olarak eksik kıl folikülleri oluşturmuştur. Hem klasik hem de yatay bütün bağlama kesitlerinde sağlam kıl folikülleri ve sağlam arrector pili kasları nicelendirilmiştir. Biyolojik replika için bir kesit nicelendirilmiş olup, burada görüldüğü üzere, bütün bağlama kesiti daha yüksek oranda sağlam folikül ve arrector pili kasına sahiptir.Bu kriyoseksiyon tekniği bir kez kavrandığında, eğer numune yerleştirme işlemi doğru yapılmışsa, mükemmel şekilde yönlendirilmiş örnekler elde edilerek dakikada 15 kesitten fazla hızla uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, üç boyutlu bir ortamda kalın doku enine kesitlerinin nasıl işleneceği ve analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

horizontal-whole-mount-novel-processing-imaging-protocol-for-thick

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Ağrılı nöropatiler (PN) olarak nosiseptif intraepidermal sinir lifleri (IENFs) değişiklikleri incelemek için, doğrudan nosiseptif IENFs gözlenen üç boyutlu morfolojik değişiklikleri incelemek olabilir protokolleri geliştirmiştir. IENFs üç boyutlu analiz PN İESL morfolojik değişiklikleri değerlendirmek için bir potansiyele sahiptir.

İnsan Cilt Biyopsiler içinde Nosiseptif İntraepidermal Sinir Elyaf üç boyutlu görüntüleme

3 boyutlu (3D) histoloji hacim rekonstrüksiyonu için, bir organın hücrelerden oluşan makroyapılar düzeyindeki değişikliklerinin incelenmesini kolaylaştıran bir görüntü kayıt yaklaşımı sunuyoruz. Bu yaklaşımı kullanarak, vahşi tip ve Igfbp7-boş meme bezleri arasındaki 3 boyutlu değişiklikleri inceledik.

3-Boyutlu Histoloji hacmi ve Fare meme bezlerinin Eğitim için onun Uygulama İmar

Bu tür saç folikülleri ve sinir uçları gibi - - mekansal organizasyon farklı desen sergileyen Memeli cilt yapıları çeşitli bir dizi içerir. Düz bir montaj olarak cilt analiz deri yapıları tam kalınlığı yüksek çözünürlüklü görüntüler üretmek için bu doku 2-boyutlu geometri yararlanır.

Fare Cilt ve Saç Folikül Desenlendirme ve Duyusal Akson Morfoloji Analizi Uygulanması Düz ​​Görüntüleme Dağı

Bu rapor tam kalınlıkta fare deri biyopsi açıklık ve 3D tek hücre çözünürlükte protein ekspresyonu, çoğalan hücreleri ve Sebositler görselleştirmek için bir KÜBİK protokol tanımlamaktadır. Bu yöntem cilt anatomi ve patoloji doğru değerlendirilmesini sağlar ve genetiği değiştirilmiş fare hatları anormal epidermal fenotipleri.

KÜBİK Protokol Tüm Dağı Cilt Hazırlıkları Tek Hücre çözünürlükte Protein Anlatım Görseller

Bu el yazmasında, mineralize dokuların donmuş kesitleri üzerinde birkaç tur floresan görüntülemeden çoklu yanıt ölçümlerinin hizalanmış kompozit görüntülerini üretmek için yüksek verimli, yarı otomatik bir kriyohistoloji platformu sunuyoruz.

Yüksek Verim, Mineralize Dokuların Çoklu Resim Cryohistology

Burada, dallanma morfogenez ve periferik sinirler ve kan damarları yanı sıra bağışıklık hücre dağıtım desenlendirme görselleştirmek sağlayan tüm yetişkin fare kulak deride bir yüksek çözünürlüklü bütün Dağı görüntüleme yöntemi açıklanmaktadır.

Bütün-Confocal mikroskobu yetişkin kulak cilt için mount: nöro-vasküler dallanma morfogenez ve bağışıklık hücre dağıtım modeli sistemi

Yağ dokusu mimarisi ve hücresel bileşeni 3D görüntüleme için ideal bir yöntem olarak bütün Dağı immunostaining ve görselleştirme tekniği göstermek için çalışmanın odak noktasıdır.

Bütün Dağı boyama kullanarak 3D beyaz yağ doku yapısı görselleştirme

Burada, 100 μm'den birkaç milimetreye kadar değişen sabit üç boyutlu hücre kültürü modellerinin boyama ve hücre altı çözünürlükte görüntülenmesini gerçekleştirmek için ayrıntılı, sağlam ve tamamlayıcı protokoller sunuyoruz, böylece morfolojilerinin, hücre tipi bileşimlerinin ve etkileşimlerinin görselleştirilmesini sağlıyoruz.

Üç Boyutlu Organoid ve Küresel Modellerin Boyama ve Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesi

Burada, enfeksiyon sırasında patojenik bakterilerin organ çapında tespit edilmesini ve floresan raportör aktivitelerinin miktarını belirlemeyi sağlayan bir prosedürü açıklıyoruz.

Mikrobiyal enfeksiyonların yüksek çözünürlüklü üç boyutlu tüm organ tomografisi

Yinelemeli ağartma-uzatma-çoğullama (IBEX) ve ticari bir nükleotid etiketleme testinin (Click-iT EdU) kombinasyonu, sabit donmuş murin dokusu kesitlerinde oldukça dinamik süreçlerde bölünen hücre tiplerinin saptanmasını ve sınıflandırılmasını sağlar. Ayrıca, yeni bir açık kaynaklı görüntü işleme hattı, yüksek verimli görüntü elde etme ve analiz sağlar.

Doku Örneklerinde Cilt Hücresi Fenotiplerini ve Proliferasyon Durumlarını Değerlendirmek için Yüksek Verimli Görüntüleme ve Analiz İş Akışı

Bu makale, peritoneal metastazların üç boyutlu mimarisini karakterize etmek için optimize edilmiş bir multipleks immünofloresan protokolünü açıklamaktadır.

Yinelemeli Beyazlatma Genişletilmiş Çokluk Yaklaşımı kullanılarak tümör taşıyan dokunun üç boyutlu görüntülenmesi

Keşfedin, fare derisinin kalın üç boyutlu doku kesitleri için yeni bir işleme ve konfokal görüntüleme protokolü. Bu yöntem, antijeniteyi koruyarak karmaşık doku mimarisinin bütünlüğünü sağlar ve hücreleri detaylı incelemeye olanak tanır.

Yatay Dağ Dağı: Derinin kalın, üç boyutlu doku kesitleri için yeni bir İşleme ve Görüntüleme Protokolü

Daha fazla video keşfet