Et kimlik doğrulaması için peptidler Uygulanan MRM Kütle Spektrometresi kullanarak karışımlar türlerin belirlenmesi ve miktar tayini

Bu yöntemin genel amacı, gıda sahtekarlığı tespiti için bir araç olarak kullanılmak üzere çiğ et karışımlarında bulunan türleri tanımlamak ve miktarını belirlemek için çoklu reaksiyon izleme kütle spektrometresi kullanmaktır. Bu yöntem, sosis veya hamburger gibi ürünlerde bulunan türlerin doğrulanması gibi gıda bütünlüğü alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Yaklaşımımız, protein bileşeninin kütle spektrometresine dayanmaktadır.

Bu tekniğin temel avantajı, hızlı ve kantitatif bir sonuç verebilmesidir. Bu yöntem için ilk olarak, aynı isimle bilinen proteinlerin ve farklı türlerin aslında tür tanımlaması yapacak kadar farklı, ancak nicelikselliğe izin verecek kadar benzer olduğunu fark ettiğimizde aklımıza geldi. Numuneyi sıcak bir blokta 95 santigrat derecede 30 dakika ısıtarak termal olarak denatüre edilmiş referans miyoglobinler.

Numuneyi oda sıcaklığına ulaşana kadar yaklaşık 15 dakika soğutun. Daha sonra sindirimi arttırmak için 30 miligram üre ekleyin ve karıştırın. Numuneye ağırlıkça bir ila 30 enzim / substrat oranında bir tripsin çözeltisi ekleyin.

Daha sonra hafifçe girdaplama ile karıştırın ve gece boyunca 37 santigrat derecede proteolize olmasına izin verin. Daha sonra, proteoliz sonrası numuneyi önce bir ila iki hacim ila hacimce su ile seyrelterek tuzdan arındırın. Bir mililitre metanol ekleyerek 30 miligram ters fazlı malzeme ile doldurulmuş polimerik bir ters faz kartuşunu etkinleştirin.

Ardından, bir mililitre yüzde bir formik asit ekleyerek kartuşu dengeleyin. Numuneyi yerçekimi altında kartuşa yükleyin. Şimdi yüzde bir formik asit içeren bir mililitre yüzde beş metanol ile yıkayın.

Peptitleri bir mililitre asetonitril su ile beş mikrolitre DMSO ile önceden doldurulmuş iki mililitre mikrosantrifüj tüpüne boşaltın. Daha sonra, 120 dakika boyunca santrifüjlü bir buharlaştırıcı kullanarak çözücüyü 50 santigrat derecede vakum altında çıkarın. Daha sonra kalıntıyı 250 mikrolitre asetonitril su içinde yeniden çözün.

Çözeltiyi düşük hacimli bir otomatik numune alma cihazı şişesine aktarın. UniProt veritabanındaki farklı buluşmalar için miyoglobin dizilerini bulun. Miyoglobin dizilerini peptit ve geçiş tahmin yazılımının hedef kutusuna girin.

Gerekirse, parça listesini ortaya çıkarmak için bir peptidin üzerine gelin. Metin protokolünde açıklandığı gibi tercihleri girdikten sonra, oluşturulan MRM geçişlerini ve parametrelerini içeren bir elektronik tablo oluşturmak için Dışa Aktar'a tıklayın ve Geçiş Listesi'ni seçin. MRM algılamalı pozitif elektrosprey modunda çalıştırılan üçlü dört kutuplu kütle spektrometresine bağlı bir otomatik örnekleyici ve bir C18 çekirdek kabuk HPLC sütunu ile ikili gradyanlı yüksek performanslı bir sıvı kromotografisi veya HPLC sistemi kurun.

Sıvı kromotografi kütle spektometrisi veri toplama yazılımının parametreleri düzenle bölümünde, tarama türünü MRM ve polariteyi pozitif olarak seçin. Elektronik tabloda oluşturulan geçişler için Q1, Q3, zaman, ID, DP ve CE değerlerini girin ve edinme yöntemini kaydedin. Yöntem parametrelerini metin protokolünde açıklandığı gibi ayarladıktan sonra, veri toplama yazılımına gidin, Al'a tıklayın ve Dengele'yi seçin.

Açılan kutuda, cihaz dengelemesini başlatmak için gerekli alım yöntemini seçin. Daha sonra numune şişelerini otomatik numune alma cihazındaki bir rafa koyun. Dosya'ya tıklayın ve Yeni'yi ve ardından Alım Toplu İşlemi'ni seçin.

Numune adına, analiz edilecek numunelerin her birinin kimliğini girin. Elde edilen verilerin nasıl görselleştirileceğine ilişkin ayrıntılar için metin protokolüne bakın. Daha önce dondurulmuş ve daha sonra toz haline getirilmiş bir et kullanın.

İlgili miktarlarda eti 15 mililitrelik plastik santrifüj tüplerine tartarak bir dizi et karışımı hazırlayın. Et tozuna dört mililitre ekstraksiyon tamponu ekleyin. 30 saniye girdapladıktan sonra, oda sıcaklığında dakikada 250 döngüde iki saat boyunca bir laboratuvar çalkalayıcıda ekstrakte edin.

Ekstraktın iki mililitresini iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve dört santigrat derece ve 17.000 G'de beş dakika santrifüjleyin. Metin protokolünde açıklandığı gibi numunelerin protein konsantrasyonunu belirlemeden önce numuneleri santrifüjlü bir buharlaştırıcı kullanarak kurutun. Et karışımlarının proteolizini gerçekleştirmek için, kurutulmuş kalıntıyı bir mililitre 25 milimolar amonyum bikarbonat çözeltisi içinde yeniden çözün

Girdap yaparak iyice karıştırın ve daha önce olduğu gibi proteoloiz yapın. Ardından, zamanlanmış MRM'yi kullanarak LCMS'yi benzer şekilde ayarlayın ve çalıştırın. Veri görüntüleme yazılımında tam kromatogramı görüntüleyin.

Sırayla ayarlanan her geçiş seti için çıkarılan iyonları görüntüleyin. Her kümenin, beklenen bekletme süresinde gerekli sayıda çan şeklindeki tepe noktasını içerdiğini görsel olarak onaylayın. Böylece seçilen peptidin varlığını doğrular.

Ardından, gezinti çubuğunda Quantiation Wizard'a çift tıklayın. Örnekleri Seç penceresinde, tek bir veri dosyası seçerek nicelik kümesi oluşturun. Ardından bir veya daha fazla kullanılabilir örnek seçin.

Seçme ayarlarını ve sorgu kutusunu görüntülemek için İleri'yi seçin. Varsayılan ayarları bırakın ve Yöntem Seç'i görüntülemek için İleri'yi seçin. Açılan Yöntem kutusundan tümleştirme yöntemi dosyasını seçin ve son olarak Son'u seçin.

Sonuç tablosunu kaydedin, metin dosyası olarak dışa aktarın ve metin protokolünde açıklandığı gibi verileri gözden geçirmek için bir elektronik tabloda açın. Bu şekil, sığır eti ile ağırlık karışımı için yüzde bir ağırlıktan elde edilen at için en yoğun MRM geçişlerini göstermektedir. Buna karşılık, kırmızı çizgi, at olmadığında sığır etinden geçişi gösterir.

Bu, oranlar olarak ifade edilen sığır etinde ölçülen ve hazırlanan at miktarının bir grafiğidir. Grafik, yöntemin kantitatif ölçümler yapmak için nasıl kullanılabileceğini açıkça göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra ve toplu işleme kullanılırken, bu yöntemle verim 24 saatte 20 örneğe kadar ulaşabilir.

Bu prosedürü denerken, ekstraksiyon analizi için uygun bir protein seçmeyi unutmamak önemlidir. Miyoglobin, kırmızı et türlerini incelemek için iyi bir adaydır çünkü bol, suda çözünür ve ısıya dayanıklıdır. Bu prosedür, aynı anda tanımlanacak ve ölçülecek başka türleri de içerecek şekilde genişletilebilir.

Maksimum sayı yalnızca kütle spektometrisi tarama hızı ile sınırlıdır. Bu teknik, araştırmacıların tüketici ve marka koruması gibi alanlarda pepto parmak izini kullanmalarının önünü açıyor.