Proteinler Peptid immunoaffiniti Zenginleştirme kullanarak Niceleme Kütle Spektrometresi ile birleştiğinde

Aşağıdaki prosedürün genel amacı, ilgili proteinleri için vekil görevi gören karmaşık bir karışımdaki peptitleri izole etmek ve ölçmektir. İlk olarak, karışım içindeki büyük proteinler, tripsin gibi bir enzim kullanılarak bileşen peptitlerine sindirilir. Daha sonra hedeflenen peptit analitleri ve çivili kararlı izotop etiketli iç standart, izolasyonu takiben protein G kodlu manyetik parçacıklar üzerinde hareketsiz hale getirilen antip peptit antikorları kullanılarak zenginleştirilir.

Hedeflenen peptitler, manyetik parçacıklardan ima edilir ve dahili standarda göre kantitasyon için kütle spektrometresi ile analiz edilir. Bu tekniğin geleneksel immünolojik testler gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajları, çok sayıda tahlil oluşturmada daha hızlı ve daha uygun maliyetli olmasıdır. Yüksek bir başarı oranına sahiptir ve prosedürün ortaya konacağını gösteren kolayca çoğullanır.

Laboratuvardaki bir teknisyen, ıslak buz üzerinde 10 mikrolitrelik bir plazma Eloqua kullanıyor. Numuneyi 1000 mikrolitre derinliğinde bir kuyu plakasına aktarın ve proteinleri her numuneye 20 mikrolitre taze dokuz molar üre 30 milimolar DTT'de denatüre etmek için parable film ile örtün ve 30 dakika inkübe edin 37 santigrat derecede, her numuneye üç mikrolitre taze 500 milimolar I oto asetamid ekleyin ve oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika inkübe edin. Şimdi üreyi 100 milimolar tris pH sekiz ile 0.6 molar'a seyreltin ve mikrolitre gezileri başına 10 mikrolitre bir mikrogram ekleyin ve bir ila 50 enzim / substrat oranı için stok çözeltisi ekleyin.

Reaksiyonu gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe ettikten sonra, üç mikrolitre saf formik asitte% 1'lik bir nihai konsantrasyona kadar kararlı izotop standardını veya çoklu standartları eklemeye devam edin. Multipleks bir test yapıyorsanız, Oasis kartuş plakasını %80 ACE nitril içinde 500 mikrolitre %0.1 formik asit ile iyice yıkayın ve akışı boşaltın. Daha sonra suya 500 mikrolitre %0.1 formik asit ekleyerek kartuş plakasını dengeleyin ve akışı atın.

Sindirim örneklerini kartuş plakasına yükleyin ve vakumu akış çok yavaş olacak şekilde ayarlayın. Suda 500 mikrolitre% 0.1 formik asit ile üç kez yıkayın ve elüte yoluyla akışı atın, peptitleri% 80 aseto denemesinde 500 mikrolitre% 0.1 formik asit ile iki kez atın, daha sonra liyofilize edin veya kurumaya geri döndürün ve kurutulmuş peptitleri 50 mikrolitre PBS artı% 0.03 Chaps'ta sulandırın, numuneleri standart bir Kingfisher 96 oyuklu plakaya aktarın, bir mikrogram antikor ve 1.5 mikrolitre protein G ekleyin hedef başına kodlanmış manyetik boncuklar. Eklemeden önce boncukları girdaplayın.

Boncukların iyi bir şekilde asıldığından emin olmak için. Plakayı folyo ile örtün ve gece boyunca hafif yuvarlanan santrifüj ile inkübe edin. Folyo yüzeyindeki herhangi bir sıvıyı çıkarmak için plakayı 10 saniye boyunca 400 RPM'de tutun.

Folyo kapağını çıkarın. Numune manipülasyonu, Kingfisher platformundaki otomatik bir yalıçapkını platformunda gerçekleşir. Boncukları iki kez 200 mikrolitre PBS artı% 0.03 chaps ile yıkayın ve bir kez 200 mikrolitre bir ila 10 seyreltme PBS ve% 0.03 Chaps ile yıkayın, şimdi 25 mikrolitre% 5 asetik asit ve% 0.03 chaps ile peptitlerden kaçınır.

Elüsyon plakasını bir mıknatıs üzerine yerleştirin ve kalan boncukları aktarmamaya dikkat ederek elüatı 96 oyuklu bir plakaya aktarın. Plakayı tavan paspası ile örtün, elüatı içeren bu plakayı analiz için üçlü, dörtlü kütle spektrometresine teslim edin. MRM yöntemi, en iyi geçiş fragmanı iyonlarının seçilmesi ve optimize edilmesinden ziyade, ilgilenilen peptidin tandem kütle spektrumunun elde edilmesiyle oluşturulur.

Tipik olarak, MRM analizi için bir konfigürasyon bir C 18 tuzağı ve iki mobil fazlı analitik sütunlar kullanır. Numuneden 10 mikrolitre yükleyin ve doğrusal bir gradyan ile elüte edin. Hafif ve ağır peptitler için tepe alanlarını entegre edin ve her numunede etiketlenmemiş peptitin etiketli peptitin tepe alan oranını hesaplayın.

Hafif ve ağır peptitler aynı anda elüte olur ve her peptit için çoklu geçişler izlenebilir Kimliği doğrulamak için, endojen peptitin tepe alanı, hedef peptitin kantitatif bir ölçüsünü sağlamak için iç standardın alanına göre ölçülür. Bu videoyu izledikten sonra, bu tekniği laboratuvarınızda nasıl uygulayacağınızı iyi anlamış olmalısınız. İlgilenilen herhangi bir proteini ölçmek için kullanılabilir, bu da onu biyolojik araştırmalarda geniş bir uygulama yelpazesi için uygun hale getirir.