Araştırma yöntemleri B. subtilis Biyofilmler

Bakteriyel biyofilmler insan sağlığı için önemlidir, bakteri sakinlerini çevresel hakaretlerden ve anti-mikrobiyal ajanlardan korur. Bu prosedürün amacı, küçük moleküllü inhibitörlerin biyofilm oluşumu üzerindeki etkilerini değerlendirmek için bir model sistem geliştirmekti. Bu yöntemler, özellikle biyofilm oluşumunu hedefleyen küçük molekül inhibitörlerini seçmek için biyofilm alanı için gerekli olan bir araç setinin oluşturulmasına yardımcı olabilir.

Bu metodolojilerin temel avantajı, tutarlı, sağlam bir deneysel çerçeveden başlamaları ve biyofilme özgü inhibitörlerin etki mekanizması hakkında nicel ve nitel bilgiler vermesidir. Bu yöntemler Bacillus subtilis biyofilmleri hakkında bilgi sağlayabilse de, Pseudomonas aeruginosa veya bitki patojeni Xanthomonas citri gibi diğer biyofilm oluşturan bakterilere de uygulanabilir. Taramalı elektron mikroskobu, küçük moleküllerin biyofilm oluşumu üzerindeki etkisini analiz etmek için gerekli olabilir, çünkü hücre dışı matrisin gözlemlenmesine izin verir ve tek hücreli çözünürlük verir.

Başlamak için önce uygun bir tek koloni seçin ve onu üç mililitre LB suyuna aktarın. Bu başlangıç kültürünü, 37 santigrat derecede dört saat boyunca çalkalanan bir inkübatöre yerleştirin. İnkübasyondan sonra, 1.5 mililitre başlangıç kültürü alın ve dört dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve ardından peleti 1,5 mililitre MSgg ortamında yeniden askıya alın. Pelikülleri büyütmek için, her oyuğa üç mililitre MSgg ekleyerek 12 oyuklu bir hücre kültürü plakası hazırlayın. Bu kuyucukların bazılarına, kenar etkilerini önlemek için farklı konsantrasyonların konumunu yemeğin etrafına dağıtarak bir konsantrasyon aralığında küçük bir molekül inhibitörü ile MSgg ekleyin.

Yeniden askıya alınmış starter kültürünün 600 nanometresindeki optik yoğunluğu ölçün. Kültür 0,6 ile bir arasında olmalıdır. Bu, sistemin sağlamlığı için kritik öneme sahiptir.

Kültür plakasının her bir oyuğunu, yeniden askıya alınmış başlangıç kültüründen 3 mikrolitre ile innoküle edin. Ardından, plakayı statik koşullar altında üç gün boyunca 23 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, plakayı inkübatörden çıkarın ve pelikülleri gözlemleyin.

Biyofilmleri büyütmek için bir şablon kullanın ve simetrik olarak 1,5 mikrolitre yıkanmamış başlangıç kültüründen dört ayrı damlayı 8,5 santimetre kurutulmuş% 1,5 Agar MSgg plakasına yerleştirin. Plakayı hareket ettirmeden önce damlaların ortama emilmesine izin verin. Plakaları üç gün boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin.

Homojen aydınlatmaya maruz kalan bir dürbün kullanarak, biyofilm kolonilerinin geliştiğini ve üç boyutlu buruşuk bir yapı oluşturduğunu kontrol edin. Öncelikle temiz bir tıraş bıçağı alın ve şablon yardımıyla biyofilm kolonilerini iki eşit parçaya kesin. Koloninin yarısını temiz bir spatula ile dikkatlice kaldırın ve 500 mikrolitre PBS içeren 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Koloninin ikinci yarısını alın ve 500 mikrolitre% 50 etanol içeren bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Bunlar, sterilizasyon ajanlarına karşı direnci değerlendirmek için kullanılacaktır. Daha sonra, benzer şekilde D-lizin ile muamele edilmiş koloninin ilk yarısını alın ve PBS'ye yerleştirin.

Daha sonra, bu koloninin ikinci yarısını alın ve etanole aktarın. Biyofilm yarımlarını içeren tüm tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Ve sonra, onları 18.000 kez g'de beş dakika santrifüjleyin.

Bir pipet kullanarak, süpernatanı dikkatlice çıkarın. 300 mikrolitre PBS ekleyin ve ardından hücreleri bir mikrotip sonikatör ile düşük bir ayarda sonikleştirin. Bir mililitrelik son hacim için 700 mikrolitre daha PBS ekleyin.

Daha sonra, PBS'de 10'dan negatif yediye kadar bir seri seyreltme gerçekleştirin. Seyreltmelerden birinden 100 mikrolitre alın ve% 1.5'lik bir Agar LB plakasını innoküle edin. Numune başına diğer iki seyreltme için bu adımı tekrarlayın.

Masumiyeti cam boncuklar kullanarak yayın ve ardından plakaları gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Plakaları inceleyin ve koloni oluşturan birimleri veya CFU'yu sayın. Mililitre başına CFU değerini hesapladıktan sonra, PBS'de etanol tedavilerine karşı hayatta kalanların yüzdesini hesaplayın.

Numune fiksasyonuna başlamak için, önce istenen sayıda biyofilm kolonisi için yeterli miktarda taze fiksatif solüsyon hazırlayın. Her petri kabına dikkatlice beş mililitre sabitleyici ekleyin ve doğrudan kolonilere pipetlemekten kaçının. Koloniler Agar'dan ayrılmaya ve yüzmeye başlayacak.

Plakaları dikkatlice parafilm ile kapatın ve oda sıcaklığında iki saat boyunca döner bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Plakaları gece boyunca dört santigrat dereceye aktarın. Sabitleyici sıvıyı, bir vakuma bağlı bir Pasteur pipeti ile nazikçe çıkarın.

Biyofilmi yıkamak için 10 mililitre 100 nanomolar sodyum kakodilat, beş milimolar kalsiyum klorür tamponu ekleyin ve beş dakika inkübe edin. Biyofilm kolonisinin merkezini bir Pasteur pipeti ile Agar plakasından dikkatlice ayırın. Kolonileri havayla kurutmak için selüloz filtre kağıdını dörde bölün ve ardından bir bölümü %100 etanole batırın.

Yüzen bir biyofilm kolonisini dikkatlice kağıda aktarın. Kağıdı kuru filtre kağıdı ile kaplı bir Petri kabına yerleştirin. Ardından, tabağın üzerini örtün ve gece boyunca kuruması için kimyasal bir kapüşonda bırakın.

Biyofilm kolonisinin morfolojisini korumak için, yüzen biyofilmin altını tamamen selüloz kağıdı ile kaplamak önemlidir. Kağıda döküldükten sonra, biyofilm yeniden ayarlanamaz. Bir elektron mikroskobu saplamasını karbon bantla kaplayın ve ardından biyofilm kolonilerini saplama üzerine dikkatlice aktarmak için cımbız kullanın.

Her koloniyi saplamaya bağladıktan sonra, ince bir karbon bant köprüsü ekleyerek, saplamaları 24 saat veya ihtiyaç duyulana kadar bir kurutucuda saklayın. Bu adım sabit ve hassas bir el gerektirir, çünkü bu aşamada biyofilmler çok kırılgandır ve kolayca kırılır. Buradaki zorluk, biyofilmin önemli bir bölümünü çatlak olmadan monte etmektir.

Muayene günü, kolonileri altın paladyum püskürtme kaplayıcısına yerleştirin. Numuneleri 60 derecelik bir açıyla iki dakika boyunca kaplayın. Bu adımı iki kez tekrarlayın ve numuneleri aralarında 120 derece döndürün.

Son olarak, numuneleri üstten üç dakika boyunca bir kez kaplayın. Numuneler artık SEM'de görüntülenmeye hazırdır. Bu görüntüler, biyofilm indükleyici MSgg ortamında yetiştirilen B.subtilis'in pelikal oluşumunu göstermektedir.

Küçük molekül inhibitörü D-lizin ilavesiyle pelikül gelişimi azalır. Ve inhibitörün konsantrasyonu arttıkça, pelikül oluşumu buna bağlı bir azalma gösterir. Bu grafik, etanole maruz kalmanın, bir D-lizin inhibitörü ile muamele edilen veya tedavi edilmeden bırakılan biyofilm kolonileri içindeki hücrelerin hayatta kalması üzerindeki etkisini göstermektedir.

D-lizin ile muamele edilen ve 10 dakika boyunca% 50 etanole maruz bırakılan koloniler, tedavi edilmemiş fraksiyona kıyasla sağkalımda dramatik bir azalma gösterdi. Yukarıdan aşağıya binoküler görüntüler, D-lizin varlığında büyüyen kolonilerin genel olarak daha küçük olduğunu ve tedavi edilmeyenlere göre daha az belirgin kırışıklıklar oluşturduğunu göstermektedir. Kritik nokta kurumuş biyofilm kolonilerinin taramalı elektron mikroskobu görüntüleri, değişmiş biyofilm gelişimini daha da ortaya koymaktadır.

Hücre dışı polimerik maddeler matrisi veya EPS, işlenmemiş numunelerde daha çok bir örümcek ağı gibi göründü ve muamele edilmiş numuneler daha az organizasyon gösterdi. Son olarak, tek tek bakteri hücrelerinin çözünürlüğünde yapılan inceleme, tedavi edilen hücrelerin görünüşte uzadığını, EPS ile daha az kaplı olduğunu ve komşularına tedavi edilmeyen hücreler kadar sıkı bir şekilde bağlı olmadığını gösterir. Bu prosedürü denerken, biyofilm inhibitörlerini incelemek için tutarlı bir çerçeve belirlemenin tekrarlanabilir sonuçlar için gerekli olduğunu hatırlamak önemlidir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, biyofilm inhibisyonu için küçük bir molekül taraması, uygun şekilde yapılırsa bir haftadan daha kısa sürede yapılabilir. Bu prosedürü takiben, küçük molekül inhibitörünün hedefi hakkında ek bilgiler elde etmek için tek biyofilm hücrelerinde gen ekspresyonunun araştırılması gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, belirli biyofilm inhibitörlerinin biyofilm gelişimi ve antibiyotik direnci üzerindeki genel etkisini nasıl analiz edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.