Name: Nanoparçacık Neurotoksite Belirleyen Bir Vekil Biosensor olarak mikroglia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Öğrenin, mikroglia hücrelerini vekil biyosensör olarak kullanarak nanoparçacıkların nörotoksisitesini nasıl değerlendireceğinizi. Bu yöntem, hayvan çalışmalarına olan ihtiyacı azaltarak çevresel kirleticilerin sinir sistemi üzerindeki etkilerini incelemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, ABD Gazi İşleri Bakanlığı BLR&D IK2 BX001686 (TAB'a) tarafından finanse edildi ve Minnesota Üniversitesi Sağlıklı Gıdalar, Sağlıklı Yaşamlar Enstitüsü (CMD, JPN ve TAB'a) ve Minnesota Veterans Tıbbi Araştırma ve Eğitim Vakfı'ndan (TAB'a) hibeler aldı. Dr. Philippe Marambaud'a (Feinstein Tıbbi Araştırma Enstitüsü, Manhasset, NY) ve Weihua Zhao'ya (Methodist Hastanesi, Houston, TX) BV2 hücre hattını sağladıkları için teşekkür ederiz.

1. Mikroglial Hücre Kültürü Bakım <ol><li> Sıcak hücre kültürü ortamı (Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı DMEM) 37 ° C&#39;de% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin / neomisin (PSN) ile takviye edilmiştir. </li><li> -80 ° C&#39;de depolamadan 25 - geçit 18 BV2 mikroglial hücreler dondurulmuş stok elde edilir. Hızla 37 ° C su banyosu içinde hücreleri eritin. </li><li> Yavaşça 10 ml hücre kültür ortamı içeren 75 cm 2 Bacalı şişeye hücreleri aktarmak. </li><li> 37 ° C&#39;de% 5 CO2 içinde balon inkübe edin. Medya aspire 24 saat sonra ve taze medya ile değiştirin. % 80 confluency - yaklaşık 70 kadar hücreleri büyür. </li></ol> 2. Sayma ve Kaplama Hücreler <ol><li> 37 ° C su banyosu, sıcak DMEM ve 1 x-tripsin-EDTA çözeltisi içinde. </li><li> hücrelerden aspire medya ve tripsin 500 ul ekleyin. 5 dakika - 2 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> kazıyıcı kullanarak şişeye hücreleri çıkarmak ve 5 ml askıyaDMEM. 50 ml&#39;lik bir tüp içine üç kez 70 mikron süzgeç vasıtasıyla hücrelere geçerler. </li><li> Bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın ve% 10 FBS ve% 1 PSN ile desteklenmiş 200 ul DMEM nihai hacimde net bir alt plaka duvarlı / göz, bir siyah 8.000 hücre tohum. 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de% 5 CO2 içinde plaka inkübe edin. </li><li> Eski DMEM çıkarın ve mikroglia açlıktan serum% 1 PSN ile takviye ısıttı DMEM 200 ul ile değiştirin. 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de% 5 CO2 içinde plaka inkübe edin. </li></ol> 3. etkinleştirilmesi Mikroglia <ol><li> Ayrı tüplerde, AGNPS seyreltilmiş (0.01, 0.05 ya da 0.1 ug / ml) ve araç / nötr kontrolü son işleme konsantrasyonları% 1 PSN ile takviye edilmiş serumsuz DMEM (sodyum sitrat, 0.04 mM). </li><li> her bir ortamın 100 ul çıkarın ve uygun tedavi, bileşiğin 100 ul ile değiştirin. </li><li> 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de% 5 CO2 içinde plaka inkübe edin. </li></ol> 4. FiKoşullu ortam edilmiş filtre edilmiş <ol><li> Her ortam süpernatan 200 ul iyi toplama toplama tüpünün (1,5-2 mi kapasite) sahip bir filtre (10 kDa moleküler ağırlık cutoff) aktarmak. </li><li> 15 dakika boyunca, oda sıcaklığında 14,000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> flow-through (parçacıkları ile süpernatant) atın ve yeni bir toplama tüpüne filtre ters yerleştirin. </li><li> 2 dakika boyunca oda sıcaklığında 1000 x g&#39;de santrifüjleyin. Not: Elde edilen filtre ortamı (salgılanmış sitokinler ihtiva eden) altı kat konsantre edilir. </li><li> Buz üzerinde,% 10 FBS ve% 1 PSN ve mağaza ile desteklenmiş taze DMEM ile 400 ul, konsantratın hacimle getirin. NOT: - 420 nm 10 yaklaşık 390 karakteristik tepe dayalı bir AgNP konsantrasyonu, artık AGNPS süzülmüş ortamdan kaldırılır sağlamak oluşturmak için. (Adım 3.1 de tarif edildiği gibi, 0, 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, ve 0.2 ug / ml) ve süzüldü Kısaca, süzülmemiş AGNPS hacimde hazırlanmasıAraç kontrol serumsuz DMEM (sodyum sitrat, 0.04 mM). Kısım Bir siyah süzülür örnekler ve standartlar 50 ul açık alt plaka duvarlı. bir spektrofotometre kullanılarak, 390 absorbans ölçmek - 410 nm ve AgNP konsantrasyon eğrisine okumaları karşılaştırın. süzüldü örnekler araç kontrol numunesi ile aynı emilme değeri varsa, kalıntı AGNPS kaldırılır varsayılabilir. </li><li> Bir ticari olarak temin edilebilir kit TNF-α salgılanmasını talimatlarını belirlemek için, filtre ortamının yarısı kullanın. </li></ol> 5. Hipotalamik hücre kültürü Bakım <ol><li> Sıcak DMEM hücre kültür aracı 37 ° C,% 10 FBS ve% 1 PSN ile takviye edilmiştir. </li><li> 80 ° C de muhafaza 25 - hipotalo dondurulmuş stok (mHypo-A1 / 2) geçit 18 hücreleri elde etmek. Hızla 37 ° C su banyosu içinde hücreleri eritin. </li><li> Yavaşça 10 ml hücre kültür ortamı içeren 75 cm 2 Bacalı şişeye hücreleri aktarmak. </li><li> CO2% 5 balon inkübe </s37 ° C&#39;de UB&gt;. Medya aspire 24 saat sonra ve taze medya ile değiştirin. % 80 confluency - Yaklaşık 70 kadar hücreleri büyür. </li></ol> 6. belirlenmesi Hipotalamus Hücre zehirlilik <ol><li> Sıcak DMEM ve 37 ° C su banyosu içinde 1x-tripsin-EDTA çözeltisi. </li><li> hipotalamik hücrelerden aspire medya ve tripsin 500 ul ekleyin. 5 dakika - 2 37 ° C&#39;de inkübe edin. 2. adımda, yukarıda tarif edildiği gibi, bir kazıyıcı kullanılarak şişeden hücreler çıkarın. </li><li> Bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın ve% 10 FBS ve% 1 PSN ile desteklenmiş 200 ul DMEM nihai hacimde net bir alt plaka duvarlı / göz, bir siyah 5000 hücre olacak şekilde hipotalamus hücreleri plaka ve 37 ° C&#39;de% 5 CO2 içinde gece boyunca inkübe . </li><li> Çok kanallı bir pipet kullanılarak, eski ortamın 100 ul çıkarın ve 1x bir son konsantrasyon elde etmek üzere filtre konsantre hale koşullu ortamın 100 ul, ilave edin. </li><li> 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de% 5 CO2 içinde plaka inkübe edin. </li><li> 22 ekle1 &#39;dir; resazurin ayıracı ve 37 ° C&#39;de% 5 CO2 içinde 20 dakika süreyle plaka inkübe edin. </li><li> Bir modlu spektrofotometre, kayıt floresan (560 nm EX / 590 nm EM) kullanarak hücre canlılığını ölçmek için. bağıl floresan üniteleri (RFU) olarak sonuçları rapor. </li></ol>

<ol><li>Block, M. L., Calderon-Garciduenas, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air+pollution%3A+mechanisms+of+neuroinflammation+and+CNS+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Air pollution: mechanisms of neuroinflammation and CNS disease.</a> Trends Neurosci. 32, 506-516 (2009).</li>
<li>Brochu, P., Bouchard, M., Haddad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+daily+inhalation+rates+for+health+risk+assessment+in+overweight%2Fobese+children%2C+adults%2C+and+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22Risk+Anal%22%5BJournal%5D)">Physiological daily inhalation rates for health risk assessment in overweight/obese children, adults, and elderly.</a> Risk Anal. 34, 567-582 (2014).</li>
<li>Jerrett, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic-related+air+pollution+and+obesity+formation+in+children%3A+a+longitudinal%2C+multilevel+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health%22%5BJournal%5D)">Traffic-related air pollution and obesity formation in children: a longitudinal, multilevel analysis.</a> Environ Health. 13, 49(2014).</li>
<li>Kraft, A. D., Harry, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+microglia+and+neuroinflammation+relevant+to+environmental+exposure+and+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Environ+Res+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity.</a> Int J Environ Res Public Health. 8, 2980-3018 (2011).</li>
<li>Duffy, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+orexin+A+signaling+in+dietary+palmitic+acid-activated+microglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Role of orexin A signaling in dietary palmitic acid-activated microglial cells.</a> Neurosci Lett. 606, 140-144 (2015).</li>
<li>Butterick, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+caspase+multiplexing+assay+to+determine+apoptosis+in+a+hypothalamic+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Use of a caspase multiplexing assay to determine apoptosis in a hypothalamic cell model.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+cell+viability+and+proliferation+in+hydrogel-encapsulated+system+by+resazurin+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Biochem+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay.</a> Appl Biochem Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).</li>
<li>Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+of+murine+microglial+cells+by+a+v-raf%2Fv-myc+carrying+retrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Immortalization of murine microglial cells by a v-raf/v-myc carrying retrovirus.</a> J Neuroimmunol. 27, 229-237 (1990).</li>
<li>Belsham, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+neurotrophic+factor+recruitment+of+glucagon-like+peptide-1+mediates+neurogenesis%2C+allowing+immortalization+of+adult+murine+hypothalamic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Ciliary neurotrophic factor recruitment of glucagon-like peptide-1 mediates neurogenesis, allowing immortalization of adult murine hypothalamic neurons.</a> FASEB J. 23, 4256-4265 (2009).</li>
<li>Paramelle, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+to+estimate+the+concentration+of+citrate+capped+silver+nanoparticles+from+UV-visible+light+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">A rapid method to estimate the concentration of citrate capped silver nanoparticles from UV-visible light spectra.</a> Analyst. 139, 4855-4861 (2014).</li>
<li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+exposure+to+air+pollution+particles+increases+the+risk+of+obesity+and+metabolic+syndrome%3A+findings+from+a+natural+experiment+in+Beijing%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Chronic exposure to air pollution particles increases the risk of obesity and metabolic syndrome: findings from a natural experiment in Beijing.</a> FASEB J. , (2016).</li>
<li>Levesque, S., Surace, M. J., McDonald, J., Block, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air+pollution+%26+the+brain%3A+Subchronic+diesel+exhaust+exposure+causes+neuroinflammation+and+elevates+early+markers+of+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Air pollution & the brain: Subchronic diesel exhaust exposure causes neuroinflammation and elevates early markers of neurodegenerative disease.</a> J Neuroinflammation. 8, 105(2011).</li>
<li>Block, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+outdoor+air+pollution+and+brain+health+workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">The outdoor air pollution and brain health workshop.</a> Neurotoxicology. 33, 972-984 (2012).</li>
<li>Carson, M. J., Crane, J., Xie, A. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+CNS+microglia%3A+the+quest+to+identify+predictive+models%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today+Dis+Models%22%5BJournal%5D)">Modeling CNS microglia: the quest to identify predictive models.</a> Drug Discov Today Dis Models. 5, 19-25 (2008).</li>
<li>Valdearcos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+dictate+the+impact+of+saturated+fat+consumption+on+hypothalamic+inflammation+and+neuronal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Microglia dictate the impact of saturated fat consumption on hypothalamic inflammation and neuronal function.</a> Cell Rep. 9, 2124-2138 (2014).</li>
<li>Perry, V. H., Holmes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+priming+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Microglial priming in neurodegenerative disease.</a> Nat Rev Neurol. 10, 217-224 (2014).</li>
<li>Block, M. L., Hong, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+microglial+activation+and+progressive+dopaminergic+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity.</a> Biochem Soc Trans. 35, 1127-1132 (2007).</li>
<li>Vincenti, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+Microglia+Response+during+the+Time+Course+of+Chronic+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Defining the Microglia Response during the Time Course of Chronic Neurodegeneration.</a> J Virol. 90, 3003-3017 (2015).</li>
<li>Grabert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+brain+region-dependent+diversity+and+selective+regional+sensitivities+to+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglial brain region-dependent diversity and selective regional sensitivities to aging.</a> Nat Neurosci. 19, 504-516 (2016).</li>
<li>Lull, M. E., Block, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+activation+and+chronic+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Microglial activation and chronic neurodegeneration.</a> Neurotherapeutics. 7, 354-365 (2010).</li>
<li>Oeckinghaus, A., Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+in+NF-kappaB+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Crosstalk in NF-kappaB signaling pathways.</a> Nat Immunol. 12, 695-708 (2011).</li>
<li>Gifford, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-modified+gold+nanoparticles+for+the+inhibition+of+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Thiol-modified gold nanoparticles for the inhibition of Mycobacterium smegmatis.</a> Chem Commun (Camb). 50, 15860-15863 (2014).</li>
<li>Colella, M., Lobasso, S., Babudri, F., Corcelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitic+acid+is+associated+with+halorhodopsin+as+a+free+fatty+acid.+Radiolabeling+of+halorhodopsin+with+3H-palmitic+acid+and+chemical+analysis+of+the+reaction+products+of+purified+halorhodopsin+with+thiols+and+NaBH4%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Palmitic acid is associated with halorhodopsin as a free fatty acid. Radiolabeling of halorhodopsin with 3H-palmitic acid and chemical analysis of the reaction products of purified halorhodopsin with thiols and NaBH4.</a> Biochim Biophys Acta. 1370, 273-279 (1998).</li>
<li>Sherry, B., Jue, D. M., Zentella, A., Cerami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+high+molecular+weight+glycosylated+forms+of+murine+tumor+necrosis+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Characterization of high molecular weight glycosylated forms of murine tumor necrosis factor.</a> Biochem Biophys Res Commun. 173, 1072-1078 (1990).</li>
<li>PubChem Compound Database. , National Center for Biotechnology Information. 
 <a target="_blank" href="https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/104755">https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/104755</a> (2004).</li>
<li>Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+phagocytosis+induced+by+fibrillar+beta-amyloid+and+IgGs+are+differentially+regulated+by+proinflammatory+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines.</a> J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).</li>
<li>McCarthy, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+adult+murine+immortalized+microglial+cell+line+and+its+activation+by+amyloid-beta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel adult murine immortalized microglial cell line and its activation by amyloid-beta.</a> J Neuroinflammation. 13, (2016).</li>
<li>Schauer, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Source+apportionment+of+airborne+particulate+matter+using+organic+compounds+as+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Atmos+Environ%22%5BJournal%5D)">Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers.</a> Atmos Environ. 30, 3837-3855 (1996).</li>
<li>Kleeman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Source+apportionment+of+fine+%28PM1.8%29+and+ultrafine+%28PM0.1%29+airborne+particulate+matter+during+a+severe+winter+pollution+episode%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Source apportionment of fine (PM1.8) and ultrafine (PM0.1) airborne particulate matter during a severe winter pollution episode.</a> Environ Sci Technol. 43, 272-279 (2009).</li>
<li>Borm, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+risks+of+nanomaterials%3A+a+review+carried+out+for+ECETOC%5BTitle%5D)+AND+%22Part+Fibre+Toxicol%22%5BJournal%5D)">The potential risks of nanomaterials: a review carried out for ECETOC.</a> Part Fibre Toxicol. 3, (2006).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak herhangi bir çelişkisi yoktur.

Son çalışmalar, çevresel maruziyetin obezite ve diğer nörodejeneratif hastalıklara katkıda bulunduğunu desteklemektedir 11,12. Ancak önceki çalışmalarda kullanılan teknikler zaman alıcı ve pahalıdır. Ekonomik hususlar, fizyolojik olarak ilgili dağıtım sistemleri, in vivo hayvan modellerinin yaygın kullanımıyla ilgili etik sorunlar ve bulguları anlamlı sağlık tavsiyelerine dönüştürmenin zorluğu, NP kaynaklı nörotoksisitenin incelenmesindeki ilerlemeleri engelleyen başlıca zorluklardan birkaçıdır 1...

Çevre kirliliği, özellikle nanopartikül (NP) aralığı olan (1-20 nm çapında), obezite ve kan-beyin bariyerinden 1-3 geçebilmekte bağlı başka nörodejeneratif hastalıklar ile bağlantılı olmuştur. Kirliliğine yükseltilmiş maruz hipotalamus 1 de dahil olmak üzere, merkezi sinir sisteminde enflamasyonun neden olabilir. Bu mikroglia nanoparçacık kaynaklı aktivasyonu (beyin bağışıklık hücreleri) 4 kanalıyla olabilir meydana geldiği bir potansiyel mekanizma. Önceki çalışmalar zaman alıcı, pahalı beyin sağlığı üzerinde NPS etkilerini incelemek için in vivo modellerinde kullanmış ve doğrudan NPS mikroglia nasıl etkilediği sorusuna cevap yok. Mikroglia beyin mikro bakım dahil olmak üzere ve salgılanan faktörler ve sitokinlerin açığa ile nöronları çevreleyen iletişim merkezi sinir sisteminde, çok yönlü bir rol oynamaktadır. uyaranlara bağlı olarak, mikroglia bir M1 pr aktif hale getirilebiliro-inflamatuar veya M2 anti-inflamatuar durum. M2, interlökin-4 (IL-4) dahil olmak üzere, mikroglia salma anti-enflamatuar sitokinler aktive Örneğin, M1, mikroglia tümör nekroz faktörü alfa (TNF-α) gibi pro-enflamatuar sitokinleri serbest aktif. Hava kirleticilerin nörotoksik belirlenmesi için in vitro biyosensörle bizim vekil doğrulamak için, biz 20 nm gümüş nanopartikülleri (AGNPS) için mikroglial tepki ölçülür. Bu makalenin amacı bir in vitro mikroglial hücre hattı NP için fare mikroglial tepki test ve nasıl mikroglial aktivasyon hipotalamus hücrelerini etkiler için bir vekil biyosensör belirteci olarak nasıl kullanılabileceğini açıklamaktır. Uzun vadeli bu valide modelin uygulama, beyin sağlığı ve nörodejeneratif hastalık üzerinde gerçek dünya kirleticilerin etkilerini test etmek amaçlanmıştır. Bu mikrofon maruz kaldıktan sonra mikroglial aktivasyonu ve hipotalamik hücre yaşamını ölçmek için bir in vitro 96 oyuklu bir format ayrıntılı bir açıklama temin<html> koşullu ortam roglial. Mikroglia aktivasyonu testi (ELISA) bağlı immünosorban bir TNF-α enzim kullanılarak AgNP maruz kalındıktan sonra belirlendi. hipotalamik hücrelerde aktif mikroglia etkisini belirlemek için, AGNPS bir süzme cihazı kullanılarak mikroglial süpernatan (koşullu ortam) çıkarıldı. boyutuna göre AGNPS hariç ise filtrasyon cihazı sitokinler korur. Kısaca, AGNPS ile veya tedavi mikroglia alınan üst faz, toplanmış, filtrelere eklenmiş ve 15 dakika için 14,000 x g&#39;de santrifüjlenmiştir. Daha sonra hipotalamik hücre canlılığı üzerine mikroglial salgılanan sitokinlerin etkisini belirlemek başardık. Daha önce tarif edildiği gibi 5,6 koşullu ortam (ihtiva eden sitokinler) maruz kaldıktan sonra hücre toksisitesi resazurin tabanlı tahlil ile belirlenmiştir. Metabolik olarak aktif hücrelerin resazurin azaltmak ve canlı hücreler 7 sayısı ile orantılı bir flüoresan sinyal üretir. nt &quot;&gt; (örneğin, ya da in vivo deneyler ko-kültür, trans-kuyu kurulumları gibi) diğerleri üzerinde bu tekniği kullanarak birçok avantajı vardır. Bizim modeli doğrudan mikroglia etkinleştirmek ve salgılanan faktörler nöronlar 8 için toksik olup olmadığını belirlemek için yeteneği sağlar . geçerli protokol ölümsüzleştirilmiş BV2 mikroglia sıçangil hipotalamik hücreleri bu protokol bu spesifik koşullar için optimize edilmiş olsa da (belirlenmiş mHypo-A1 / 2) daha sonra karşılık belirlenmesi için 9., yöntemler olabilir 20 nm çapında nano ile uyarılmış ve ölümsüzleştirilmiş kullanır değiştirilmiş mikroglial kaynaklı hücre ölümünün diğer modellerde kullanılan veya birincil mikroglia ve nöronlar gibi diğer hücre tipleri ile edilmesi.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Hücreler / Reaktifler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Fare mikroglial hücre hattı (BV2)</td> <td>Interlab Hücre Hattı Koleksiyonu (Cenova, İtalya)</td> <td>ATL03001</td><td></td></tr><tr><td>Yetişkin Fare Hipotalamus Hücre Hattı mHypoA-1 / 2 & nbsp;</td><td>Cellutions Biyosistemler A.Ş.</td><td>CLU172</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta</td><td>Invitrogen</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu&nbsp;</td><td>PAA Labs</td><td>A15-751</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin / Neomisin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15640-055</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Gümüş nanopartiküller (20 nm)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>730793</td><td></td></tr><tr><td> PrestoBlue Hücre Canlılık Reaktifi</td><td>Invitrogen</td><td>A13262</td><td></td></tr><tr><td>Fare TNF- &alfa; ELISA Max Delux</td><td>Biolegend</td><td>430904</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisakkarit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4391</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Sitrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</td></tr><tr><td>Equipment</ güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 W Optik Alt Plaka, Siyah Polistiren, Hücre Kültürü İşlemli, kapaklı, Steril</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultracel-0.5 Ultracel-10 membranlı Santrifüj Filtre Ünitesi</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC501008</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M5 Çok Modlu Mikroplaka</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>M5</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml Konik Santrifüj Tüpler</td><td>Corning, Inc</td><td> 14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Hücre Süzgeçleri 70 & mu; m</td><td>Corning, Inc</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Masaüstü santrifüj 5430</td><td>Eppendorf</td><td>22620560</td><td></td></tr></tbody></table>

nanoparçacık neurotoksite belirleyen bir vekil biosensor olarak mikroglia

Microglia as a Surrogate Biosensor to Determine Nanoparticle Neurotoxicity

Hava kirleticilerinde bulunan nanopartiküller nörotransmitter profillerini değiştirebilir, nöroinflamasyonu artırabilir ve beyin fonksiyonlarını değiştirebilir. Bu nedenle, burada açıklanan tahlil, mikroglia'nın nöroinflamasyon ve nörodejeneratif hastalıklardaki rolünün aydınlatılmasına yardımcı olacaktır. Beynin yerleşik bağışıklık hücreleri olan mikroglia'nın vekil bir biyosensör olarak kullanılması, enflamatuar yanıtların nöronal hakaretlere nasıl aracılık ettiğine dair yeni bir bakış açısı sağlar. Burada, BV2 olarak adlandırılan ölümsüzleştirilmiş bir murin mikroglial hücre hattı kullanıyoruz ve standart olarak gümüş nanopartiküller (AgNP'ler) kullanarak nanopartikül maruziyeti için bir yöntem açıklıyoruz. Mikroglia'nın nanopartiküllere nasıl maruz bırakılacağını, nanopartiküllerin süpernatanttan nasıl çıkarılacağını ve toksisiteyi belirlemek için süpernatanın aktive edilmiş mikrogliadan nasıl kullanılacağını, hipotalamik hücre sağkalımını bir ölçü olarak kullanarak açıklıyoruz. AgNP maruziyetini takiben, BV2 mikroglial aktivasyonu, bir tümör nekroz faktörü alfa (TNF-α) enzimine bağlı immünosorbent testi (ELISA) kullanılarak doğrulandı. Süpernatant, AgNP'yi uzaklaştırmak ve sitokinlerin ve diğer salgılanan faktörlerin şartlandırılmış ortamda kalmasına izin vermek için filtrelendi. Hipotalamik hücreler daha sonra AgNP ile aktive edilmiş mikrogliadan süpernatana maruz bırakıldı ve nöronların sağkalımı, resazurin bazlı bir floresan testi kullanılarak belirlendi. Bu teknik, mikroglia'yı nöroinflamasyonun vekil bir biyobelirteci olarak kullanmak ve nöroinflamasyonun diğer hücre tipleri üzerindeki etkisini belirlemek için yararlıdır.

Yukarıdaki protokolünü kullanarak nanopartiküller beyin yanıtı için bir vekil biyosensör olarak bu mikroglia işlevini göstermektedir. Bizim sonuçlarımız aşağı nöronal hücre ölümü üzerindeki mikroglial aktivasyon toksik etkileri ölçülmesini içerir. 1 mikroglia etkinleştirmek ve salgılanan sitokinler hipotalamik nöronların canlılığını azaltır olmadığını belirlemek için protokol iş akışı gösterir Şekil. TNF-α salgısı belirgin AgNP maruz (Şekil 2),</...

Microglia (beynin bağışıklık hücreleri), nanopartiküllerin nörotoksisiteyi nasıl etkilediğini belirlemek için vekil bir biyosensör olarak kullanılır. Nörotoksisiteyi belirlemek için nanopartiküllere mikroglial yanıtı ve hipotalamik nöronların aktive edilmiş mikrogliadan süpernatana maruz kalmasını test etmek için tasarlanmış bir dizi deneyi tarif ediyoruz.

Nanoparçacık Neurotoksite Belirleyen Bir Vekil Biosensor olarak mikroglia

Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay ...

Bu protokolün genel amacı, mikroglial yanıtın nanopartiküllere karşı test edilmesi için in vitro bir sürögat biyosensörü tanımlamaktır. Ardından, nanopartiküllerle stimüle edilmiş mikroglialardan elde edilen kondisyonlu ortama maruz kalma sonrası nörotoksisiteyi belirleyeceğiz. Bu yöntem, nörotoksisite açısından aktif olarak taranan nanopartiküllerin nasıl belirleneceği gibi nörobilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu tekniğin temel avantajı, modelimizin pahalı ve uzun süreli kemirgen çalışmalarına gerek kalmadan mikrogliaları doğrudan aktive etme ve salgılanan faktörlerin nörotoksin olup olmadığını belirleme imkanı sunmasıdır. Bu yöntem, mikropartikül maruziyeti sonrası mikrogliaların tetiklediği hücre ölümü hakkında içgörü sağlayabildiği gibi, potansiyel nörotoksik çevresel kirleticilerin test edilmesi kapsamında diğer nörodejeneratif hastalık modellerine de uygulanabilir.Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler kondisyonlu besiyeri filtrasyon adımında zorluk yaşayacaklardır. Çünkü filtrasyon verimliliği, nanoparçacıkların boyutuna, şekline ve konsantrasyonuna bağlı olarak farklılık gösterebilir. Hazırlık aşamasında, %10 FBS ve %1 PSN ile desteklenmiş DMEM'i 37 °C'ye ısıtın.Ardından, 18-25 pasajlarından elde edilmiş dondurulmuş BV2 mikroglial hücrelerini alın ve 37 °C'de hızlıca çözdürün. Daha sonra, çözülen hücreleri nazikçe 10 mL besiyeri içeren 75 cm²'lik havalandırmalı bir flaska aktarın ve flaskı inkübe edin. 24 saat sonra besiyerini değiştirin ve hücreler %70-80 konfluens düzeyine ulaşana kadar büyütmeye devam edin. Bu noktada besiyerini aspire edin ve 500 µL sıcak 1x tripsin EDTA çözeltisi ekleyin.Balonun birkaç dakika daha inkübe edilmesine izin verdikten sonra, hücreleri 5 mililitre ılık DMEM içerisine toplamak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Ardından, hücreleri 70 mikronluk bir süzgeç kullanarak balondan süzün. Bu filtrasyon işlemini aynı süzgeci kullanarak üç kez tekrarlayın ve hücreleri 50 mililitrelik bir tüpe toplayın.Süzme işlemi tamamlandıktan sonra hücreleri sayın ve ardından siyah duvarlı şeffaf tabanlı bir plakaya, her kuyucuğa 200 microliters takviyeli DMEM içerisinde 8000 hücre gelecek şekilde ekim yapın. 24 saatlik inkübasyonun ardından, mikrogliaları aç bırakmak için kuyucuklardaki besiyerini serumsuz DMEM ile değiştirin. 24 saatlik daha inkübasyonun ardından, mikrogliaları aktive etme aşamasına geçin.Bunu yapmak için, önce gümüş nanoparçacıkları serumsuz DMEM içinde istenen çalışma konsantrasyonuna kadar seyreltin. Ardından, besiyerinin 100 µL'sini tedavi bileşiği ile değiştirin. Nanoparçacıkları içermeyen seyreltilmiş taşıyıcı çözeltiden oluşan bir negatif kontrol eklediğinizden emin olun.Şimdi inkübasyona 24 saat boyunca devam edin ve analize geçin. Başlamak için her plak kuyucuğundan 200 µL süpernatan besiyeri toplayın ve bunu bir mikro santrifüj tüpü üzerine yerleştirilmiş, nanopartikülleri uzaklaştıracak bir filtreye yükleyin. Nanopartiküller filtrelenirken boyutlarının, şekillerinin ve konsantrasyonlarının füzyon verimliliği için belirleyici bir faktör olduğunu unutmamak önemlidir.Bu nedenle, filtrasyonu önceden test etmek tavsiye edilir. Şimdi tüpleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 14000g'de santrifüjleyin. Ardından, nanoparçacıkları içeren süzüntüyü atın ve filtreleri yeni toplama tüplerine ters şekilde yerleştirin.Sitokinler içeren konsantre kondisyonlu medyumu toplamak için filtreleri 1000g hızında iki dakika boyunca baş aşağı santrifüjleyin. Ardından, toplama hacmini taze hazırlanmış ek DMEM ile 400 microliters seviyesine çıkarın ve tüpleri buz üzerinde saklayın. Filtre edilmiş medyumdan kalıntı kükürt nanoparçacıklarının uzaklaştırıldığından emin olmak için, serumsuz DMEM içinde boş örnekten 0,2 micrograms per milliliter'a kadar farklı konsantrasyonlarda filtrelenmemiş nanoparçacık standartları hazırlayın.Ardından, filtrelenmiş örneklerin ve her bir standardın 50 mililitresini siyah duvarlı şeffaf tabanlı bir plakaya paylaştırın ve 390 ila 410 nanometre arasından absorbansı ölçün. Örneklerdeki TNF-alpha konsantrasyonunu ölçmek için, kalan hacimlerinin yarısını ticari olarak temin edilebilen bir kit ile kullanın. Bu analiz için dondurulmuş stoklardan hipotalamik hücreler hazırlayın.Mikroglial kültürlerin oluşturulması için açıklanan yöntemlerin aynısını kullanın. Son aşamada, bunları siyah duvarlı şeffaf tabanlı plakaları, kuyu başına 200 µL takviyeli DMEM içerisinde 5000 hücre olacak şekilde ekmek için kullanın. 24 saatlik kültürlemeden sonra, 100 µL medyumu çıkarın ve yerine aktive edilmiş mikroglial hücre kültürlerinden toplanan, filtrelenmiş ve konsantre edilmiş 100 µL medyum ekleyin; ardından plağı standart koşullar altında 24 saat boyunca inkübe edin.Ertesi gün her kuyuya 22 µL resazurin reaktifi ekleyin ve inkübasyonu 20 dakika boyunca sürdürün. Ardından, çok modlu bir spektrofotometre kullanarak hücre canlılığını göreli floresan birimleri cinsinden tahmin etmek için floresans ölçümü yapın. Belirtilen bu protokol ile mikroglia fonksiyonu, beynin nanopartiküllere verdiği yanıt için bir yedek biyosensör olarak kullanılabilir.Gümüş nanopartikül maruziyeti sonrası mikroglial TNF-alfa sekresyonu önemli ölçüde artmıştır. Hipotalamik nöronlar, gümüş nanopartiküllerle aktive edilmiş mikroglialardan elde edilen kondisyonlu medyuma maruz bırakıldığında, nöronların canlılığı önemli ölçüde azalmıştır. Prensip olarak, gümüş nanopartiküllere maruz kalma, mikrogliaları M1 pro-inflamatuar durumuna aktive etmiştir.Ardından, salınan pro-inflamatuar sitokinler çevre hücrelerin ölümüne katkıda bulunur. Bu videoyu izledikten sonra, nanopartiküllere verilen yanıtı test etmek ve bu yanıtın nörotoksik olup olmadığını belirlemek için mikrogliaların bir sürgat biyosensör olarak nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde uygulandığı takdirde üç veya dört gün içinde tamamlanabilir.Bu prosedürün ardından, mikroglial aktivasyon durumlarını fenotiplendirmek amacıyla, mikroglial aktivasyonu takiben salgılanan diğer sitokinlerin profillenmesi gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

microglia-as-surrogate-biosensor-to-determine-nanoparticle

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Nanoparçacıkların hücre biodistribution değerlendirmek için kullanılan bio-görüntüleme yöntemleri, nanoformulated bileşikler tedavi ve teşhis izleme için geçerlidir. Burada açıklanan yöntemler, histolojik coregistration tarafından değerlendirilir, hassas ve özeldir. Metodolojileri kemirgen insan uygulamaları bir translasyonel yol sağlar.

Teşhis ve Tedavi İzleme Nanomalzemelerin Kayıtlı bio

Mikroglia merkezi sinir sisteminin savunma ve bağışıklık gözetim ilk satırı sağlamak makrofajlar ikamet ediyorsanız. MicroRNA aktivasyonu ve makrofaj farklılaşma da dahil olmak üzere bir çok fizyolojik süreçlerin önemli bir rol oynar düzenleyici moleküllerdir. Bu yazıda, mikroglia yılında microRNA ölçümü için bir yöntem sunduk.

Normal MSS Real-time PCR ve Nöro sırasında mikroglia içinde microRNA tespiti

Bu video, mikroglia kullanarak nanopartiküllerin nörotoksik etkilerini değerlendirmek için bir yöntem göstermektedir. Mikroglia'yı nanopartiküllerle aktive etme, mikroglia'dan türetilmiş proinflamatuar sitokinleri izole etmek için şartlandırılmış medyayı filtreleme ve şartlandırılmış besiyeri ile hipotalamik nöron toksisitesini test etme adımlarını ana hatlarıyla belirtir.

Mikroglia'yı Vekil Biyosensör Olarak Kullanarak Nöronlarda Nanopartikül Kaynaklı Toksisitenin Belirlenmesi

Mikrogliyal biyoloji başarılı bir soruşturma için bir anahtar CNS dokudan izolasyonu sırasında ex vivo mikroglialardan immunofunction korunmasıdır. Flüoresan görüntüleme, bağışıklık kimyası ve proenflamatuar stimuli lipopolisakarit (LPS) ile Pam 3 CSK 4 (PAM) ile ELISA aşağıda mikroglia aktivasyonu ile değerlendirilen gibi son derece saf ve immunofunctional hücre kültürlerinde döner çalkalama sonuçları ile mikroglia izole edilmesi.

Kemirgen Yenidoğan itibaren Korunan immunfenotipine ve İşlevselliği ile Kortikal mikrogliya İzolasyonu

Mikroglia hücre dışı bir ortamda malzemenin fagosite veya yutmak için yüksek bir kapasitesi olan merkezi sinir sistemi (CNS) içinde yerleşik bağışıklık hücreleri bulunmaktadır. Burada, sinaptik bileşenlerin mikroglia aracılı yutulmasına görselleştirme ve ölçmek için, genel olarak, uygun ve güvenilir olup, kantitatif analiz tarif edilmektedir.

Bir yutulma Deneyi: CNS Fagositler ve nöronlar arasındaki etkileşimi değerlendirmek için bir protokol

Mikroglia aktivasyonu ve mikroglioz kronik nörodejenerasyona önemli tepkilerdir. Burada, in vivo, konfokal oftalmoskopi retinal CX3CR1-GFP + mikroglial hücreleri uzun süreli görselleştirme için yöntemler sunmak ve eşik ve morfometrik için belirlemek ve aktivasyonunu ölçmek için analiz eder. Biz yaşa bağlı glokomun erken evrelerinde mikrogliyal değişiklikleri takip.

Fare Glokomda Konfokal Oftalmoskopik Görüntüleme ve Hücre morfometrisi: Nörodejenerasyonda sırasında Retina Mikroglial Aktivasyonu Vivo Dynamics

doku homeostazında ve yetersiz fagositik fonksiyonunun korunması patolojisinde dahil olmuştur için mikrogliyal fagositoz kritiktir. Ancak, in vivo mikroglia fonksiyonunu değerlendirmede teknik olarak zordur. Biz tam izleme ve fizyolojik bir ortamda mikroglia fagositik potansiyelini ölçülmesi için basit ama güçlü bir teknik geliştirdiler.

Retina Mikroglial Fagositik Fonksiyonu değerlendirilmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt; A Akış Sitometri bazlı analiz kullamlarak

Burada, in vitro deneyler için doğum sonrası fare yavrularından mikroglia izole etmek için bir protokol (gün 1) sunulmuştur. izolasyon Bu doğaçlama yöntem hem de yüksek verim ve saflıkta, mikroglial biyoloji açıklık amacıyla geniş bir aralık deney sağlar alternatif yöntemler üzerinde önemli bir avantaj oluşturur.

Geliştirilmiş Saflık ve Çok Yönlü İlköğretim mikroglia hızlı ve Rafine CD11 Manyetik İzolasyon

Bir iletişim kuralı üzerinden fare beyni birincil microglia yalıtım için sunulmaktadır. Bu teknik nörolojik koşullar geçerli anlayışı sürdürmek yardımcı olur. Yoğunluk gradient Santrifüjü ve manyetik ayırma son derece saf bir örnek yeterli verim üretmek için birleştirilmiştir. Ayrıca, biz microglia karakterizasyonu için adımlar verilmiştir.

Karakterizasyonu ve yoğunluk Gradient Santrifüjü tarafından fare birincil Microglia izolasyonu

Bu makale, retinadaki postsinaptik nokta ve mikroglia hareketliliğini görselleştirme ve nicelleştirme yöntemini spinning disk konfokal mikroskopisi kullanarak göstermektedir.

Hasta Sare Retinasında Mikroglia Dinamikleri ve Sinapslarla Etkileşimlerin Canlı Görüntülemesi ve Karakterizasyonu

Mapping Microglial Parameters Software (MMPS), kodlama uzmanlığı gerektirmeyen ve immünoflüoresans görüntülerden tek hücreli mikrogliyal morfoloji analizini yarı otomatikleştiren kullanıcı dostu bir analiz hattıdır. Kemirgenlerin lipopolisakkaridi indükleyen nöroinflamasyon modelinde doğrulanan MMPS, aktivasyonla ilişkili morfolojik değişiklikleri tekrarlanabilir şekilde tespit eder ve standart, ölçeklenebilir mikroglial fenotiplemeyi mümkün kılar.

Mikroglial Parametreleri Haritalama Yazılımı (MMPS): Nicel Mikroglia Morfoloji Analizi için Açık Kaynaklı, Kullanıcı Dostu Bir Araç

Öğrenin, mikroglia hücrelerini vekil biyosensör olarak kullanarak nanoparçacıkların nörotoksisitesini nasıl değerlendireceğinizi. Bu yöntem, hayvan çalışmalarına olan ihtiyacı azaltarak çevresel kirleticilerin sinir sistemi üzerindeki etkilerini incelemenizi sağlar.

Nanoparçacık Neurotoksite Belirleyen Bir Vekil Biosensor olarak mikroglia

Daha fazla video keşfet