Nanoparçacık Neurotoksite Belirleyen Bir Vekil Biosensor olarak mikroglia

Bu protokolün genel amacı, nanopartiküllere mikroglial yanıtı test etmek için in vitro bir vekil biyosensörü tanımlamaktır. Daha sonra, nanopartiküllerle uyarılan mikrogliadan şartlandırılmış ortama maruz kaldıktan sonra nörotoksisiteyi belirleyeceğiz. Bu yöntem, nörobilim alanındaki nanopartiküllerin nörotoksisite için aktif olarak nasıl tarandığı gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, modelimizin mikroglia'yı doğrudan aktive etme ve pahalı uzun süreli kemirgen çalışmaları kullanmadan gizli faktörlerin nörotoksin olup olmadığını belirleme yeteneği sağlamasıdır. Bu yöntem, mikropartikül maruziyetini takiben mikroglial kaynaklı hücre ölümü hakkında bilgi sağlayabilir. Potansiyel nörotoksik çevresel kirleticilerin test edilmesi bağlamında diğer nörodejeneratif hastalık modellerine de uygulanabilir.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, durum ortamı filtreleme adımıyla mücadele edeceklerdir. Çünkü filtrasyon verimliliği, nanopartiküllerin boyutuna, şekline ve konsantrasyonuna bağlı olarak farklılık gösterebilir. Hazırlık olarak, %10 FBS ve %1 PSN ile takviye edilmiş DMEM'i 37 santigrat dereceye ısıtın.

Daha sonra 18 25 pasajlarından elde edilen donmuş BV2 mikroglial hücrelerini alın ve bunları 37 santigrat derecede hızla çözün. Daha sonra, çözülmüş hücreleri yavaşça 10 mililitre ortam içeren 75 santimetre kare havalandırmalı bir şişeye aktarın ve şişeyi inkübe edin. 24 saat sonra, ortamı değiştirin ve% 70-80'lik bir birleşime ulaşana kadar hücreleri büyütmeye devam edin. Bu noktada, ortamı aspire edin ve 500 mikrolitre ılık 1 ex tripsin EDTA çözeltisi ekleyin.

Şişenin birkaç dakika daha inkübe etmesine izin verdikten sonra, hücreleri 5 mililitre ılık DMEM'e toplamak için bir kazıyıcı kullanın. Daha sonra 70 mikronluk bir süzgeç kullanarak hücreleri şişeden süzün. Aynı süzgeci kullanarak bu filtrelemeyi üç kez tekrarlayın ve hücreleri 50 mililitrelik bir tüpte toplayın.

Filtrelendikten sonra, hücreleri sayın ve ardından 200 mikrolitre takviye DMEM'de oyuk başına 8000 hücre içeren siyah duvarlı şeffaf bir alt plakayı tohumlayın. 24 saatlik inkübasyondan sonra, mikroglia'yı aç bırakmak için kuyucuklardaki ortamı serumsuz DMEM ile değiştirin. 24 saat daha inkübasyondan sonra, mikroglia'yı aktive etmeye devam edin.

Bunu yapmak için, önce gümüş nanopartikülleri serum içermeyen DMEM'de istenen çalışma konsantrasyonuna seyreltin. Daha sonra 100 mikrolitre ortamı tedavi bileşiği ile değiştirin. Nanopartiküller olmadan seyreltilmiş araç çözeltisinin negatif kontrolünü dahil ettiğinizden emin olun.

Şimdi inkübasyona 24 saat devam edin ve analize devam edin. Başlamak için, her bir plaka kuyusundan 200 mikrolitre süpernatan ortam toplayın ve bir mikro santrifüj tüpü üzerine yerleştirilen nanopartikülleri çıkaracak bir filtreye yükleyin. Nanopartikülleri filtrelerken boyutlarının, şekillerinin ve konsantrasyonlarının füzyon verimliliği için bir faktör olduğunu hatırlamak önemlidir.

Bu nedenle, filtrasyonu önceden test etmeniz önerilir. Şimdi tüpleri oda sıcaklığında 14000 g'da 15 dakika döndürün. Daha sonra nanopartikülleri içeren akışı atın ve filtreleri yeni toplama tüplerine baş aşağı yerleştirin.

Sitokin içeren konsantre şartlandırılmış ortamı toplamak için filtreleri iki dakika boyunca 1000 g'da baş aşağı döndürün. Daha sonra, taze yapılmış ek DMEM ile koleksiyonun hacmini 400 mikrolitreye çıkarın ve tüpleri buz üzerinde saklayın. Artık kükürt nanopartiküllerinin filtrelenmiş ortamdan uzaklaştırılmasını sağlamak için, serum içermeyen DMEM'de bir boşluktan mililitre başına 0.2 mikrograma kadar bir konsantrasyon aralığında filtrelenmemiş nanopartikül standartları hazırlayın.

Daha sonra, filtrelenmiş numunelerin ve her standardın 50 mililitresini siyah duvarlı şeffaf bir alt plakaya ayırın ve 390 ila 410 nanometre arasındaki absorbansı ölçün. Numunelerdeki TNF-alfa konsantrasyonunu ölçmek için, kalan hacimlerinin yarısını ticari olarak temin edilebilen bir kitte kullanın. Bu test için donmuş stoklardan hipotalamik hücreler oluşturun.

Mikroglial kültürler oluşturmak için açıklanan yöntemlerin aynısını kullanarak. Sonuç olarak, 200 mikrolitre takviye edilmiş DMEM'de oyuk başına 5000 hücre içeren siyah duvarlı şeffaf alt plakaları tohumlamak için kullanın. 24 saatlik kültürlemeden sonra, 100 mikrolitre ortamı çıkarın ve aktive edilmiş mikroglial hücre kültürlerinden toplanan 100 mikrolitre filtrelenmiş ve konsantre ortam ile değiştirin, ardından plakayı standart koşullar altında 24 saat inkübe edin.

Ertesi gün, her bir oyuğa 22 mikrolitre resazurin reaktifi ekleyin ve inkübasyona 20 dakika devam edin. Daha sonra, çok modlu bir spektrofotometre ile, hücrelerin nispi floresan birimleri cinsinden yaşayabilirliğini tahmin etmek için bir floresan ölçüsü alın. Belirtilen protokol ile mikroglia fonksiyonu, beynin nanopartiküllere tepkisi için vekil bir biyosensör olarak kullanılabilir.

Mikroglia ile TNF-alfa sekresyonu, şerit nanopartikül maruziyetini takiben önemli ölçüde artmıştır. Hipotalamik nöronlar, gümüş nanopartikül ile aktive edilmiş mikrogliadan şartlandırılmış ortama maruz kaldığında, nöronların canlılığı önemli ölçüde azalmıştır. Prensip olarak, gümüş nanopartiküllere maruz kalma, mikroglia'yı bir M1 pro-inflamatuar duruma aktive etti.

Daha sonra salınan pro-inflamatuar sitokinler çevredeki hücre ölümüne katkıda bulunur. Bu videoyu izledikten sonra, nanopartiküllere yanıtı test etmek için mikroglia'nın vekil bir biyosensör olarak nasıl kullanılacağını ve bu yanıtın nörotoksik olup olmadığını iyi anlamış olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa üç veya dört gün içinde yapılabilir.

Bu prosedürü takiben, mikroglial aktivasyon durumlarını fenotiplendirmek için mikroglial aktivasyonu takiben salgılanan diğer sitokinlerin profillenmesi gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.