Name: Erken Doğum Sonrası Fare Beyin Gelişiminde Mikroglia Aktivasyonunu Karakterize Etmek için Akış Sitometrisi ve Tek Hücre Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-03T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Öğrenin, erken doğum sonrası fare beyninde mikroglia hücre durumlarını izole etmek ve karakterize etmek için akış sitometrisi ve tek hücre RNA dizilemesi yöntemlerini. Bu protokol, serebellum gelişimindeki rollerini anlamak için mikroglia heterojenliğini ortaya çıkarır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Berardi, N., Sale, A., Maffei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+structural+and+functional+development%3A+Genetics+and+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Med+Child+Neurol%22%5BJournal%5D)">Brain structural and functional development: Genetics and experience.</a> Dev Med Child Neurol. 57 (Suppl 2), 4-9 (2015).</li>
<li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+functional+alteration+and+increased+diversity+in+the+challenged+brain%3A+Insights+into+novel+targets+for+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun+Health%22%5BJournal%5D)">Microglial functional alteration and increased diversity in the challenged brain: Insights into novel targets for intervention.</a> Brain Behav Immun Health. 16, 100301(2021).</li>
<li>Salter, M. W., Beggs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublime+microglia%3A+Expanding+roles+for+the+guardians+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sublime microglia: Expanding roles for the guardians of the CNS.</a> Cell. 158 (1), 15-24 (2014).</li>
<li>Michell-Robinson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+microglia+in+brain+development%2C+tissue+maintenance+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair.</a> Brain. 138 (Pt 5), 1138-1159 (2015).</li>
<li>Nayak, D., Roth, T. L., Mcgavern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia development and function.</a> Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).</li>
<li>Mehl, L. C., Manjally, A. V., Bouadi, O., Gibson, E. M., Tay, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+brain+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Microglia in brain development and regeneration.</a> Development. 149 (8), dev200425(2022).</li>
<li>Mastenbroek, L. J. M., Kooistra, S. M., Eggen, B. J. L., Prins, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microglia+in+early+neurodevelopment+and+the+effects+of+maternal+immune+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">The role of microglia in early neurodevelopment and the effects of maternal immune activation.</a> Semin Immunopathol. 46 (1-2), 1(2024).</li>
<li>Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+dynamics+during+human+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglial dynamics during human brain development.</a> Front Immunol. 9, 1014(2018).</li>
<li>Srakocic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+practical+protocol+for+flow+cytometry+analysis+of+microglia+from+the+healthy+adult+mouse+brain%3A+Systematic+review+and+isolation+methods%27+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Proposed practical protocol for flow cytometry analysis of microglia from the healthy adult mouse brain: Systematic review and isolation methods' evaluation.</a> Front Cell Neurosci. 16, 1017976(2022).</li>
<li>Akhmetzyanova, E. R., Rizvanov, A. A., Mukhamedshina, Y. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+methods+for+the+microglia+isolation%3A+Overview+and+comparative+analysis+of+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Current methods for the microglia isolation: Overview and comparative analysis of approaches.</a> Cell Tissue Res. 395 (2), 147-158 (2024).</li>
<li>Walker, D. G., Lue, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+phenotypes+of+microglia+in+human+neurodegenerative+disease%3A+Challenges+to+detecting+microglial+polarization+in+human+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Immune phenotypes of microglia in human neurodegenerative disease: Challenges to detecting microglial polarization in human brains.</a> Alzheimers Res Ther. 7 (1), 56(2015).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+states+and+nomenclature%3A+A+field+at+its+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads.</a> Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).</li>
<li>Hammond, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+of+microglia+throughout+the+mouse+lifespan+and+in+the+injured+brain+reveals+complex+cell-state+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing of microglia throughout the mouse lifespan and in the injured brain reveals complex cell-state changes.</a> Immunity. 50 (1), 253-271.e6 (2019).</li>
<li>Bernier, L. P., York, E. M., Macvicar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunometabolism+in+the+brain%3A+How+metabolism+shapes+microglial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Immunometabolism in the brain: How metabolism shapes microglial function.</a> Trends Neurosci. 43 (11), 854-869 (2020).</li>
<li>Butovsky, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+unique+TGF-%CE%B2-dependent+molecular+and+functional+signature+in+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia.</a> Nat Neurosci. 17 (1), 131-143 (2014).</li>
<li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environment+drives+selection+and+function+of+enhancers+controlling+tissue-specific+macrophage+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Environment drives selection and function of enhancers controlling tissue-specific macrophage identities.</a> Cell. 159 (6), 1327-1340 (2014).</li>
<li>Chometon, T. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+rapid+monocyte+isolation+and+generation+of+singular+human+monocyte-derived+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells.</a> PLoS One. 15 (4), e0231132(2020).</li>
<li>Skog, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+enzymatic+digestion+on+cultured+epithelial+autografts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">The effect of enzymatic digestion on cultured epithelial autografts.</a> Cell Transplant. 28 (5), 638-644 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>140 &mikro; m metal örgü filtre&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3895 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tüp</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td></td></tr><tr><td>5 mL tüp</td><td>Sarstedt</td><td>55.526.006</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyucuklu tabak konik tabanlı&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>82.1583.001</td><td></td></tr><tr><td>Arjinaz 1 - Eşlenik Pecy7 - Klon : A1exF5</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>25-3697-82</td><td></td></tr><tr><td>Tezgah üstü stabil floresan reaktifler</td><td>Davetli</td><td>A49905 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>CD11b - Konjuge Fitc - Klon : M1/70</td><td>BD Pharmingen</td><td>553310</td><td></td></tr><tr><td>CD163 - Eşlenik SB600 - Klon : TNKUPJ</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>63-1631-82</td><td></td></tr><tr><td>CD206 - Eşlenik APC - Klon : C068C2</td><td>Biyolojik Efsane</td><td>141708</td><td></td></tr><tr><td>CD45 - Eşlenik A700 - Klon : 30-F11</td><td>BD Pharmingen</td><td>560510</td><td></td></tr><tr><td>CD64 - Konjugat&nbsp; PerCP-eF710 - Klon : X54-5/7.1</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>46-0641-82</td><td></td></tr><tr><td>CD80 - Eşlenik SB436 - Klon : 16-10A1</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>62-0801-82</td><td></td></tr><tr><td>CD86 - Eşlenik Pe - Klon : GL-1</td><td>Biyolojik Efsane</td><td>105008</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz D</td><td>Sigma&ndash; Atalay</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma&ndash; Atalay</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>Sigma&ndash; Aldrich&nbsp;</td><td>F1051 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Hank'in dengeli tuz çözeltisi) 10x</td><td>Wisent Bioproducts&nbsp;</td><td>311506CL</td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>VWR Uluslararası</td><td>82030-470</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Wisent Bioproducts&nbsp;</td><td>330.050.EL</td><td></td></tr><tr><td>iNOS - Eşlenik PE- eF610 - Klon : CXNFT</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>61-5920-82</td><td></td></tr><tr><td>Kartal</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>BP366-500 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>BP362-500 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Canlı/Ölü Amcyan</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>L34957 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Mikroglial hücre kültürü ortamı</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A12475-01 (İngilizce)</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>BP332-500 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma&ndash; Aldrich&nbsp;</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan anti fare CD16 / CD32</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma&ndash; Aldrich&nbsp;</td><td>S7900 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>scRNAseq kitaplıkları</td><td>10X Genomik</td><td>1000121</td><td></td></tr><tr><td>Silika bazlı kolloidal ortam</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>45001747</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum azid</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>BP922I-500 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavisi</td><td>Gibco</td><td>1525006</td><td></td></tr></tbody></table>

erken doğum sonrası fare beyin gelişiminde mikroglia aktivasyonunu karakterize etmek için akış sitometrisi ve tek hücre analizi

Flow Cytometry and Single-Cell Analysis for Characterizing Microglia Activation in Early Postnatal Mouse Brain Development

Bu protokol, seçilen yüzey ve hücre içi belirteçlerin ekspresyonuna dayalı olarak fare beyin örneklerindeki mikroglial hücre popülasyonlarını karakterize etmek için akış sitometrisini etkili bir şekilde kullanır. Aşağıdaki bölümler, deneysel koşullara yanıt olarak mikroglia alt kümelerinin dağılımını ve heterojenliğini vurgulayarak iş akışının temel adımlarından elde edilen sonuçları detaylandırmaktadır.
Ücretlendirme ve geçit stratejisi doğrulaması Floresan sinyallerini kalibre etmek ve florokromlar arasındaki spektral örtüşmeyi düzeltmek için dengeleme boncukları kullanıldı. Her florokrom için pozitif ve negatif popülasyonlar açıkça ayrıldı ve doğru kompanzasyon matrisi üretimine izin verdi. Geçit eşikleri, özellikle zayıf veya örtüşen işaretleyiciler için gerçek sinyali arka plandan ayırt etmek için panel optimizasyonu sırasında başlangıçta Floresan Eksi Bir (FMO) kontrolü kullanılarak doğrulandı. Bu eşikler daha sonra tutarlılığı sağlamak için aynı boyama paneli ve sitometre ayarları kullanılarak deneylerde yeniden kullanıldı. İzotip kontrolleri, özellikle hücre içi belirteçler için potansiyel spesifik olmayan bağlanmayı izlemek için dahil edildi, ancak geçit kararları için kullanılmadı.
Mikroglial hücre tanımlama Canlı/ölü (Amcyan) hücre geçitleme stratejisi, ölü hücreleri başarıyla dışladı. Geçit stratejisi, CD45 (AF700) ve CD11b (FITC) ekspresyonuna dayalı olarak mikroglial hücre popülasyonlarını etkili bir şekilde izole etti. İleri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) parametreleri, mikroglia popülasyonunu nokta grafiği içinde ortalamak için optimize edildi (FSC = 300, SSC = 200) (Şekil 5).
Mikroglial hücre fenotiplemesi Nokta grafiği analizi, yüzey ve hücre içi belirteçlerin diferansiyel ekspresyonuna dayalı olarak mikroglia alt popülasyonlarının tanımlanmasını sağladı. FlowJo yazılımında spesifik geçit stratejileri kullanılarak, CD80 (Super Bright 436), CD86 (PE) ve iNOS (PE-eFluor 610) eksprese eden bir mikroglial hücre alt kümesi tanımlandı (Şekil 6A). CD206 (APC) ve Arg1 (PE-Cy7) eksprese eden alt kümeleri tanımlamak için çift geçit de kullanıldı (Bkz. Şekil 6B). Ek popülasyonlar, CD86 (PE) ve CD64'ün (PerCP-eFluor 710) yanı sıra CD163 (Süper Parlak 600) ve CD206'nın (APC) birlikte ekspresyonu ile karakterize edildi (Şekil 6C,D). Bu fenotipik profiller, mikroglia popülasyonu içindeki işaretleyici tanımlı heterojenliği yansıtır ve bu protokolün, sabit fonksiyonel durumları çıkarmadan çoklu transkripsiyonel ve immünolojik olarak farklı alt kümeleri ayırt etme kapasitesini gösterir.
Microglia tek hücre analizi Hücresel heterojenliği görselleştirmek ve diğer beyin hücresi tipleri arasındaki mikroglial hücre kümelerini tanımlamak için Tekdüze Manifold Yaklaşımı ve Projeksiyonu (UMAP) kullanıldı. Her nokta tek bir hücreyi temsil eder ve küme, transkripsiyonel benzerliğe dayalı olarak renk kodludur (Şekil 2).
Deneysel koşullar altında modüle edilen genleri tanımlamak için mikroglia kümesi içinde diferansiyel ekspresyon analizi yapıldı. Düzeltilmiş P değeri 0.05 ≤ olan genlerin diferansiyel olarak eksprese edildiği kabul edildi.
Mikroglial hücrelerin bu diferansiyel olarak eksprese edilen genlerini görselleştirmek için bir volkan grafiği oluşturuldu ve hem yüksek kat değişimi hem de istatistiksel anlamlılığa sahip olanları vurguladı (Şekil 4).
Bu tek hücre sonuçlarını akış sitometri verileriyle karşılaştırmak için mikroglia belirteçleri CD45 ve CD11b'nin (Ptprc ve Itgam) ekspresyonu incelendi. Bir UMAP, farklı hücre popülasyonları içindeki ekspresyonlarını gösterir (Şekil 7).
Son olarak, mikroglial hücreler arasındaki transkripsiyonel heterojenliği karakterize etmek için seçilen bağışıklıkla ilgili belirteçlerin ekspresyonu değerlendirildi. Bir Keman grafiği, CD80 ve NOS- gibi genlerin yanı sıra Mrc1, Arg1, Fcgr1 ve CD163'ün tek hücre düzeyinde ekspresyonunu gösterir (Şekil 8). Bu işaretleyici ekspresyon modelleri, akış sitometrisine dayalı profilleme ile karşılaştırmaya izin verir ve deneysel koşullar boyunca mikroglial alt kümelerin moleküler çeşitliliğini vurgular.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig1.jpg"> 
Şekil 1: Tek hücreli transkriptomik verilerin kalite kontrolü. (A) Mitokondriyal RNA içeriğinin hücreler arasında dağılımı. %&gt;30 mitokondriyal RNA'ya sahip hücreler, potansiyel olarak stresli veya ölmekte olan hücreleri çıkarmak için hariç tutuldu. (B) Tutarlı bir gen-UMI oranı sağlamak ve düşük karmaşıklık kitaplıklarından gelen gürültüyü azaltmak için log10GenesPerUMI &gt; 0.75 olan hücreler filtrelendi. (C) 500'den az tespit edilen transkripte (nUMI) veya 300'den fazla tespit edilen gene (nGENE) sahip hücreler de düşük kaliteli veya çoklu hücreleri ortadan kaldırmak için hariç tutuldu. (D) Filtreleme eşiklerinin etkisini gösteren NUMI ile nGene'nin korelasyon grafiği. Tespit edilen çiftler kaldırıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig2.jpg"> 
Şekil 2: Tek hücreli transkriptomların UMAP görselleştirmesi. İki ayrı hayvandan elde edilen transkriptomik profillere dayalı olarak tek hücrelerin dağılımını gösteren UMAP grafiği. Her nokta, küme kimliğine göre renk kodlu bir hücreyi temsil eder. Mikroglial hücre kümesi, diğer hücre popülasyonları arasında tanımlanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig3.jpg"> 
Şekil 3: Çapraz doğrulama ile değerlendirilen Rastgele Orman sınıflandırıcısının ROC eğrisi. Gen ekspresyon profillerine dayalı olarak mikrogliayı diğer beyin hücresi tiplerinden ayırt etmek için kullanılan Rastgele Orman modelinin performansını gösteren Alıcı Çalışma Karakteristiği (ROC) eğrisi. Model, bilinen etiketlere sahip ~1000 hücreden oluşan bir set üzerinde eğitildi ve 10 kat çapraz doğrulama kullanılarak değerlendirildi. Test edilen beş istatistiksel model (Rastgele Orman, lojistik regresyon, saf Bayes, destek vektör makinesi ve karar ağacı) arasında Rastgele Orman modeli en yüksek sınıflandırma performansını elde etti. Eğrinin altındaki alan (AUC), modelin doğruluğunu yansıtır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig4.jpg"> 
Şekil 4: Mikroglial hücrelerde diferansiyel gen ekspresyon analizi. Log2 kat değişikliğini temsil eden volkan grafiği ayarlanmış P-Değeri iki deney grubu arasında mikrogliada diferansiyel olarak ifade edilen genler için (kontrol ve serebellar beyin hasarı). Yukarı regüle edilmiş gen, ilgilenilen grupta (özd.1) daha yüksek oranda eksprese edilir ve aşağı regüle edilmiş genler, referans grubuna (özd.2) kıyasla daha düşük ekspresyon gösterir. Önemli ölçüde diferansiyel olarak eksprese edilen anahtar genler etiketlenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig5.jpg"> 
Şekil 5: Akış sitometrisi ile mikroglia tanımlaması için geçit stratejisi. (A) Doğum sonrası 3. gün (P3) faresinden alınan serebellar hücrelere uygulanan geçit stratejisi. (B) Çiftler hariç tutulacak şekilde tekliler seçildi. (C) Canlı hücreler, bir canlılık boyası kullanılarak tanımlandı; düşük FSC-A'ya sahip olaylar, kalıntıları gidermek ve sağlam hücrelerin analizini sağlamak için hariç tutuldu. (D) Mikroglia, iki farklı popülasyonla CD45+ ve CD11b+ olarak tanımlandı: hareketsiz mikroglia için CD45 düşük-CD11bint ve aktive mikroglia için CD45int -CD11byüksek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig6.jpg"> 
Şekil 6. Akış sitometrisi ile mikroglia marker ekspresyon profillerinin karakterizasyonu. (A) CD80, CD86 ve iNOS ekspresyonuna dayalı CD45+ CD11b+ hücrelerinin sıralı geçitlenmesi. (B) CD206'yı eksprese eden bir alt kümenin tanımlanması ve ardından Arg1 ekspresyonuna dayalı geçitleme. (C) CD86'yı eksprese eden bir alt kümenin tanımlanması ve ardından CD64 ekspresyonuna dayalı geçitleme. (D) CD163'ü eksprese eden bir alt kümenin tanımlanması ve ardından CD206 ekspresyonuna dayalı geçitleme. Bu geçit stratejileri, yüzey ve hücre içi işaretleyici ekspresyonuna dayalı olarak mikroglia popülasyonlarının fenotipik heterojenliğini göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig7.jpg"> 
Şekil 7: Tek hücreli RNA dizileme verilerinde Itgam ve Ptprc ekspresyonu kullanılarak mikroglia kimliğinin doğrulanması. UMAP, kümeler arasında yer alan Itgam ve Ptprc'nin gen ekspresyonu ile P15'teki serebellar hücrelerin transkripsiyonel manzarasını görüntüler. Bu kanonik miyeloid belirteçlerin birlikte ekspresyonu, mikroglia popülasyonlarının tanımlanmasını destekler ve akış sitometrisinde kullanılan belirteçlerle hizalanarak transkriptomik ve protein düzeyindeki analizler arasında çapraz doğrulama sağlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig8.jpg"> 
Şekil 8: Tek hücreli RNA dizilimi ile tanımlanan mikroglial hücrelerde seçilmiş bağışıklıkla ilgili genlerin ekspresyon profilleri. Keman grafikleri, CD80, NOS2, Mrc1, Arg1, Fcgr1 ve CD163 için gen ekspresyonunun bireysel mikroglial hücreler arasındaki dağılımını gösterir. Bu belirteçler genellikle bağışıklıkla ilgili süreçlerle ilişkilidir ve mikroglial popülasyonda gözlenen transkripsiyonel heterojenliği gösterir. Veriler hem kontrol hem de serebellar beyin hasarı (CBI) koşulları için gösterilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1: Nöral hücre izolasyonu ve boyama için kullanılan çözeltilerin bileşimi. Bu tablo, ilgili konsantrasyonları ve bileşenleri de dahil olmak üzere, hücre izolasyonu ve boyama için gerekli çözeltilerin ayrıntılı bir bileşimini sağlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/Table%201.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 2: Hücre dışı boyama için antikor karışımı konsantrasyonları. Bu tablo, hücre dışı boyama için kullanılan antikorların ve canlı/ölü çözeltinin konsantrasyonlarını detaylandırır ve bir numune için boyama karışımındaki her antikor için gerekli hacimleri ve seyreltmeleri belirtir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/Table%202.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 3: Hücre içi boyama için antikor karışımı konsantrasyonları. Bu tablo, hücre içi boyama için kullanılan antikor konsantrasyonlarını detaylandırır ve bir numune için boyama karışımındaki her antikor için gerekli hacimleri ve seyreltmeleri belirtir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/Table%203.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Erken Doğum Sonrası Fare Beyin Gelişiminde Mikroglia Aktivasyonunu Karakterize Etmek için Akış Sitometrisi ve Tek Hücre Analizi

Microglia, the brain's resident immune cells, exhibit region and context-specific transcriptional profiles during development and disease. This protocol ...

Araştırmamız, mikroglia'nın doğum öncesi beyin hasarından sonra beyin onarımını nasıl etkilediğini araştırıyor. Ve mikroglial hücre aktivitesini modüle etmenin uzun vadeli nörolojik sonuçları iyileştirip iyileştiremeyeceğini belirlemeyi amaçlıyoruz. Mikroglial hücre tepkilerinin karmaşıklığı ve bu tepkileri fizyolojik olduğu kadar patolojik tepkileri ve hastalıkları da temsil edecek şekilde en doğru şekilde tanımlamanın zorlukları olduğuna inanıyorum.Doğum öncesi yaralanmadan sonra gelişmekte olan beyindeki mikroglial durumları ve işlevi karakterize etmek için tek hücreli RNA dizilimi ve akış sitometrisi deneyleri gibi farklı yöntemler kullanıyoruz. En büyük zorluk, izolasyon sırasında, özellikle serebellar hücre sayılarının sınırlı olduğu yenidoğan zaman noktalarında hücre canlılığını ve mikroglial kimliğini korumaktır. Erken yaşamdaki serebellar hakaretlerin mikroglial alt popülasyonda transkripsiyonel değişikliğe nasıl yol açtığı ve hedefe yönelik tedavilerin bu değişiklikleri nasıl modüle edebileceği hakkında soruları gündeme getiriyor.Başlamak için, farelerin belirli beyin bölgesini gerektiği gibi inceleyin. Forseps kullanarak, hücre canlılığını korumak için dokuyu buz üzerine yerleştirilmiş mikroglial hücre kültürü ortamı içeren küçük bir Petri kabına aktarın. Bir pipet kullanarak mikroglial hücre kültürü ortamını Petri kabından çıkarın.Daha sonra bir neşter kullanarak beyin dokusunu aynı Petri kabında ince ince kesin. Enzimatik sindirim için homojenize beyin dokusunu beş mililitrelik tüplere aktarın. Her tüpe kollajenaz D ve DNase 1 ile desteklenmiş iki mililitre Hanks' Balanced Salt Solution ekleyin ve kapakları Parafilm ile sıkıca kapatın.Ardından, tüpleri 37 santigrat derecelik bir su banyosunda 15 dakika inkübe edin ve her beş dakikada bir çalkalayın. Sindirimi durdurmak için tüpleri buzun üzerine yerleştirin. Ardından, büyük kalıntıları gidermek için homojenatı 140 mikrometrelik bir metal ağ filtreden geçirin.Bir cam havaneli kullanarak, filtre üzerinde kalan hücreleri yavaşça ayırın. Metal ağ filtreyi her yıkamada üç mililitre mikroglial hücre kültürü ortamıyla birden çok kez yıkayın. Şimdi 10 mililitrelik bir pipet kullanarak süzüntüyü toplayın ve 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.Ardından, tüpü 500 g'da dört santigrat derecede yedi dakika santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı atmak için tüpü dikkatlice ters çevirin. Bir raf kullanarak, peleti yeniden süspanse etmek için tüpü hafifçe kazıyın.Daha sonra, yeniden süspanse edilmiş hücrelere 10 mililitre %37 silika bazlı kolloidal ortam çözeltisi ekleyin. Çözeltiyi 500 g'da 10 dakika boyunca dört santigrat derecede minimum kopma kuvveti ile santrifüjleyin. 10 mililitrelik bir pipet kullanarak miyelin tabakasını çözeltinin üstünden aspire edin.Hücreleri yıkamak için 10 mililitre Hanks' Dengeli Tuz Çözeltisi ekleyin ve tüpü 500 g'da dört santigrat derecede yedi dakika santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan ve peleti yeniden süspanse ettikten sonra, tüpe 10 mililitre floresanla aktive olan hücre ayırma tamponu ekleyin. Santrifüjlemeden sonra, sonraki uygulamalar için son peleti kalan tamponda yeniden süspanse edin.İzole edilmiş tüm hücreleri konik tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın. Plakayı 500 g'da dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atmak için plakayı tek bir hareketle hızla ters çevirin.Daha sonra hücre peletini 25 mikrolitre bloke edici solüsyon içinde yeniden süspanse edin ve plakayı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Hücre dışı antikor boyama karışımını hazırlamak için, agregaları çıkarmak için antikor stok tüplerini 10.000 g'da santrifüjleyin. Peleti bozmadan, süpernatanttan gerekli hacmi aspire edin.Floresanla aktive olan hücre sıralama tamponunu kullanarak toplam hacmi 25 mikrolitreye ayarlayın. Şimdi, her bir oyuğa 25 mikrolitre hücre dışı antikor boyama karışımı ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Karıştırmadan, her bir oyuğa 150 mikrolitre floresanla aktive olan hücre ayırma tamponu ekleyin.Plakayı 500 g'da dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı tek bir hareketle çıkarmak için plakayı hızlı bir şekilde ters çevirin. Hücre peletini 200 mikrolitre floresanla aktive olan hücre ayırma tamponunda yeniden süspanse edin ve daha önce gösterildiği gibi santrifüjleyin.Hücreleri sabitlemek ve geçirgen hale getirmek için hücreleri 100 mikrolitre saponin-paraformaldehit tamponunda yeniden süspanse edin. Ardından, plakayı ışıktan koruyarak oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Karıştırmadan, her kuyucuğa 100 mikrolitre saponin tamponu ekleyin.Plakayı 500 g'da dört santigrat derecede altı dakika santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı tek bir hareketle çıkarmak için plakayı ters çevirin ve hücre peletini 200 mikrolitre saponin tamponunda yeniden süspanse edin. Daha sonra 20 boş kuyuya 11 mikrolitre boncuk ekleyerek kompanzasyon kontrollerini hazırlayın.Hücre içi antikor boyama karışımını hazırlamak için, potansiyel agregaları çıkarmak için antikor stok tüplerini 10.000 g'da santrifüjleyin. Peleti bozmadan, süpernatanttan gerekli hacmi aspire edin. Saponin tamponu kullanarak hacmi 50 mikrolitreye ayarlayın.Daha sonra hücre peletini 50 mikrolitre hücre içi antikor karışımında yeniden süspanse edin. İlgili boncuk kuyucuklarına her antikordan bir mikrolitre ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Karıştırmadan, hücre örnekleri içeren her bir oyuğa 150 mikrolitre saponin tamponu ekleyin.Boncukları yıkamak için her bir kompanzasyon kontrol kuyusuna 100 mikrolitre floresanla aktive olan hücre ayırma tamponu ekleyin. Plaka santrifüjlendikten sonra, hücre peletini yeniden süspanse edin ve sırasıyla 200 mikrolitre saponin tamponu ve floresanla aktive olan hücre ayırma tamponunda kontrol edin. Plakayı 500 g'da dört santigrat derecede altı dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.Hem hücre örneklerini hem de kompanzasyon kontrollerini 200 mikrolitre floresanla aktive olan hücre ayırma tamponunda yeniden süspanse edin. Süspansiyonları etiketli floresanla aktive olan hücre ayırma tüplerine aktarın. Tek hücreli RNA dizilimi, transkripsiyonel profillere dayalı olarak diğer beyin hücresi tiplerinden ayrı ayrı ayrı bir mikroglial küme tanımladı.Diferansiyel ekspresyon analizi, Csf1r, Fcrls, Fyb, Adap2 ve P2ry12 dahil olmak üzere mikroglia'da önemli ölçüde yukarı regüle edilmiş genleri ortaya çıkardı. Mikroglial hücreler, CD45 ve CD11b belirteçlerinin farklı ekspresyonlarına dayalı olarak canlı beyin örneklerinden başarıyla izole edildi. CD80, CD86, iNOS, CD206 ve Arg1, CD86 ve CD64 ve CD163 ile CD206 dahil olmak üzere aktivasyon belirteçlerinin kombinasyonlarına dayalı olarak farklı mikroglial alt popülasyonlar tanımlandı.Ptprc ve Itgam'ın işaretleyici gen ekspresyonu, umap projeksiyonunda spesifik olarak mikroglial kümeye lokalize edildi ve bu hücrelerin kimliği doğrulandı. Keman grafiği analizi, tedavi edilen mikrogliada araç kontrolüne kıyasla Fcgr1 ve Cd86 gibi anti-inflamatuar belirteçlerin daha düşük ekspresyonunu gösterdi.

flow-cytometry-single-cell-analysis-for-characterizing-microglia

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Mikroglia merkezi sinir sisteminin savunma ve bağışıklık gözetim ilk satırı sağlamak makrofajlar ikamet ediyorsanız. MicroRNA aktivasyonu ve makrofaj farklılaşma da dahil olmak üzere bir çok fizyolojik süreçlerin önemli bir rol oynar düzenleyici moleküllerdir. Bu yazıda, mikroglia yılında microRNA ölçümü için bir yöntem sunduk.

Normal MSS Real-time PCR ve Nöro sırasında mikroglia içinde microRNA tespiti

Mikrogliyal biyoloji başarılı bir soruşturma için bir anahtar CNS dokudan izolasyonu sırasında ex vivo mikroglialardan immunofunction korunmasıdır. Flüoresan görüntüleme, bağışıklık kimyası ve proenflamatuar stimuli lipopolisakarit (LPS) ile Pam 3 CSK 4 (PAM) ile ELISA aşağıda mikroglia aktivasyonu ile değerlendirilen gibi son derece saf ve immunofunctional hücre kültürlerinde döner çalkalama sonuçları ile mikroglia izole edilmesi.

Kemirgen Yenidoğan itibaren Korunan immunfenotipine ve İşlevselliği ile Kortikal mikrogliya İzolasyonu

Mikroglia aktivasyonu ve mikroglioz kronik nörodejenerasyona önemli tepkilerdir. Burada, in vivo, konfokal oftalmoskopi retinal CX3CR1-GFP + mikroglial hücreleri uzun süreli görselleştirme için yöntemler sunmak ve eşik ve morfometrik için belirlemek ve aktivasyonunu ölçmek için analiz eder. Biz yaşa bağlı glokomun erken evrelerinde mikrogliyal değişiklikleri takip.

Fare Glokomda Konfokal Oftalmoskopik Görüntüleme ve Hücre morfometrisi: Nörodejenerasyonda sırasında Retina Mikroglial Aktivasyonu Vivo Dynamics

Bu protokol, akış sitometrisi ile yetişkin fare merkezi sinir sisteminde makrofaj alt popülasyonlarının bir analizini sağlar ve bu hücrelerin eksprese ettiği çoklu belirteçlerin çalışması için yararlıdır.

Akış Sitometresi ile Merkezi Sinir Sisteminden Mikroglia ve Monosit Türevi Makrofajların Analizi

Bir iletişim kuralı üzerinden fare beyni birincil microglia yalıtım için sunulmaktadır. Bu teknik nörolojik koşullar geçerli anlayışı sürdürmek yardımcı olur. Yoğunluk gradient Santrifüjü ve manyetik ayırma son derece saf bir örnek yeterli verim üretmek için birleştirilmiştir. Ayrıca, biz microglia karakterizasyonu için adımlar verilmiştir.

Karakterizasyonu ve yoğunluk Gradient Santrifüjü tarafından fare birincil Microglia izolasyonu

Primer mikroglia kültürleri, yeni anti-enflamatuar molekülleri değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır. Mevcut protokol, mikroglia'yı yenidoğan yavrulardan manyetik olarak izole etmek için tekrarlanabilir ve ilgili bir yöntemi tanımlamaktadır.

Birincil Hücre Kültürleri için Yenidoğan Fareden Mikroglial Hücrelerin Manyetik İzolasyonu

Burada, kolumnar manyetik aktive hücre sıralamayı kullanarak, demiyelinizan hastalıkların hayvan modellerinde birincil mikrogliayı izole etmek ve saflaştırmak için bir protokol sunuyoruz.

Fare Primer Mikroglia'sının Hayvan Demiyelinasyon Modellerinde Manyetik-Aktif Hücre Sıralama ile İzolasyonu

Bu çalışma, izole beyin mikrogliasında intranükleer akış sitometrisi kullanılarak küresel histon modifikasyonlarının ölçülmesi için bir protokolü açıklamaktadır. Çalışma ayrıca veri toplama için kullanılan mikroglia izolasyon protokolünü de içermektedir.

İzole Fare Beyni Mikrogliasında İntranükleer Akış Sitometrisi Kullanılarak Global Histon Post Translasyonel Modifikasyonların Miktar Tayini

Burada, akış sitometrisi kullanarak vGLUT1 pozitif sinapsların ve pHRodo Red etiketli ham sinaptozomların mikroglial yutulmasını ölçmek için iki protokol sunuyoruz.

Akış Sitometrisi Kullanılarak Sinaptik Materyalin Mikroglial Yutulmasının Miktar Tayini

Mevcut protokol, yetişkin farelerden primer hipokampal mikroglianın nasıl izole edileceğini ve saflaştırılacağını, ardından bu akut olarak izole edilmiş hücreler üzerinde tam hücre yama kelepçesi kayıtlarının yürütülmesi için talimatları açıklar.

Yetişkin Farelerden Hipokampal Mikroglia'nın İzolasyonu ve Tam Hücre Yama-Kelepçe Kaydı

Öğrenin, erken doğum sonrası fare beyninde mikroglia hücre durumlarını izole etmek ve karakterize etmek için akış sitometrisi ve tek hücre RNA dizilemesi yöntemlerini. Bu protokol, serebellum gelişimindeki rollerini anlamak için mikroglia heterojenliğini ortaya çıkarır.

Erken Doğum Sonrası Fare Beyin Gelişiminde Mikroglia Aktivasyonunu Karakterize Etmek için Akış Sitometrisi ve Tek Hücre Analizi

Daha fazla video keşfet