Erken Doğum Sonrası Fare Beyin Gelişiminde Mikroglia Aktivasyonunu Karakterize Etmek için Akış Sitometrisi ve Tek Hücre Analizi
3 Ekim 2025
Bu protokol, erken doğum sonrası fare beyinlerinin beyinciklerindeki mikroglial hücre durumlarını izole etmek ve karakterize etmek için akış sitometrisi ve tek hücreli RNA dizilimini birleştirir. Mikroglia heterojenliğini ortaya çıkarmak ve serebellar gelişim ve hastalıktaki rollerinin anlaşılmasını geliştirmek için enzimatik ayrışma, Percoll santrifüjleme ve immün boyama kullanır.
Araştırmamız, mikroglia'nın doğum öncesi beyin hasarından sonra beyin onarımını nasıl etkilediğini araştırıyor. Ve mikroglial hücre aktivitesini modüle etmenin uzun vadeli nörolojik sonuçları iyileştirip iyileştiremeyeceğini belirlemeyi amaçlıyoruz. Mikroglial hücre tepkilerinin karmaşıklığı ve bu tepkileri fizyolojik olduğu kadar patolojik tepkileri ve hastalıkları da temsil edecek şekilde en doğru şekilde tanımlamanın zorlukları olduğuna inanıyorum.
Doğum öncesi yaralanmadan sonra gelişmekte olan beyindeki mikroglial durumları ve işlevi karakterize etmek için tek hücreli RNA dizilimi ve akış sitometrisi deneyleri gibi farklı yöntemler kullanıyoruz. En büyük zorluk, izolasyon sırasında, özellikle serebellar hücre sayılarının sınırlı olduğu yenidoğan zaman noktalarında hücre canlılığını ve mikroglial kimliğini korumaktır. Erken yaşamdaki serebellar hakaretlerin mikroglial alt popülasyonda transkripsiyonel değişikliğe nasıl yol açtığı ve hedefe yönelik tedavilerin bu değişiklikleri nasıl modüle edebileceği hakkında soruları gündeme getiriyor.
Başlamak için, farelerin belirli beyin bölgesini gerektiği gibi inceleyin. Forseps kullanarak, hücre canlılığını korumak için dokuyu buz üzerine yerleştirilmiş mikroglial hücre kültürü ortamı içeren küçük bir Petri kabına aktarın. Bir pipet kullanarak mikroglial hücre kültürü ortamını Petri kabından çıkarın.
Daha sonra bir neşter kullanarak beyin dokusunu aynı Petri kabında ince ince kesin. Enzimatik sindirim için homojenize beyin dokusunu beş mililitrelik tüplere aktarın. Her tüpe kollajenaz D ve DNase 1 ile desteklenmiş iki mililitre Hanks' Balanced Salt Solution ekleyin ve kapakları Parafilm ile sıkıca kapatın.
Ardından, tüpleri 37 santigrat derecelik bir su banyosunda 15 dakika inkübe edin ve her beş dakikada bir çalkalayın. Sindirimi durdurmak için tüpleri buzun üzerine yerleştirin. Ardından, büyük kalıntıları gidermek için homojenatı 140 mikrometrelik bir metal ağ filtreden geçirin.
Bir cam havaneli kullanarak, filtre üzerinde kalan hücreleri yavaşça ayırın. Metal ağ filtreyi her yıkamada üç mililitre mikroglial hücre kültürü ortamıyla birden çok kez yıkayın. Şimdi 10 mililitrelik bir pipet kullanarak süzüntüyü toplayın ve 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.
Ardından, tüpü 500 g'da dört santigrat derecede yedi dakika santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı atmak için tüpü dikkatlice ters çevirin. Bir raf kullanarak, peleti yeniden süspanse etmek için tüpü hafifçe kazıyın.
Daha sonra, yeniden süspanse edilmiş hücrelere 10 mililitre %37 silika bazlı kolloidal ortam çözeltisi ekleyin. Çözeltiyi 500 g'da 10 dakika boyunca dört santigrat derecede minimum kopma kuvveti ile santrifüjleyin. 10 mililitrelik bir pipet kullanarak miyelin tabakasını çözeltinin üstünden aspire edin.
Hücreleri yıkamak için 10 mililitre Hanks' Dengeli Tuz Çözeltisi ekleyin ve tüpü 500 g'da dört santigrat derecede yedi dakika santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan ve peleti yeniden süspanse ettikten sonra, tüpe 10 mililitre floresanla aktive olan hücre ayırma tamponu ekleyin. Santrifüjlemeden sonra, sonraki uygulamalar için son peleti kalan tamponda yeniden süspanse edin.
İzole edilmiş tüm hücreleri konik tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın. Plakayı 500 g'da dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atmak için plakayı tek bir hareketle hızla ters çevirin.
Daha sonra hücre peletini 25 mikrolitre bloke edici solüsyon içinde yeniden süspanse edin ve plakayı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Hücre dışı antikor boyama karışımını hazırlamak için, agregaları çıkarmak için antikor stok tüplerini 10.000 g'da santrifüjleyin. Peleti bozmadan, süpernatanttan gerekli hacmi aspire edin.
Floresanla aktive olan hücre sıralama tamponunu kullanarak toplam hacmi 25 mikrolitreye ayarlayın. Şimdi, her bir oyuğa 25 mikrolitre hücre dışı antikor boyama karışımı ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Karıştırmadan, her bir oyuğa 150 mikrolitre floresanla aktive olan hücre ayırma tamponu ekleyin.
Plakayı 500 g'da dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı tek bir hareketle çıkarmak için plakayı hızlı bir şekilde ters çevirin. Hücre peletini 200 mikrolitre floresanla aktive olan hücre ayırma tamponunda yeniden süspanse edin ve daha önce gösterildiği gibi santrifüjleyin.
Hücreleri sabitlemek ve geçirgen hale getirmek için hücreleri 100 mikrolitre saponin-paraformaldehit tamponunda yeniden süspanse edin. Ardından, plakayı ışıktan koruyarak oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Karıştırmadan, her kuyucuğa 100 mikrolitre saponin tamponu ekleyin.
Plakayı 500 g'da dört santigrat derecede altı dakika santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı tek bir hareketle çıkarmak için plakayı ters çevirin ve hücre peletini 200 mikrolitre saponin tamponunda yeniden süspanse edin. Daha sonra 20 boş kuyuya 11 mikrolitre boncuk ekleyerek kompanzasyon kontrollerini hazırlayın.
Hücre içi antikor boyama karışımını hazırlamak için, potansiyel agregaları çıkarmak için antikor stok tüplerini 10.000 g'da santrifüjleyin. Peleti bozmadan, süpernatanttan gerekli hacmi aspire edin. Saponin tamponu kullanarak hacmi 50 mikrolitreye ayarlayın.
Daha sonra hücre peletini 50 mikrolitre hücre içi antikor karışımında yeniden süspanse edin. İlgili boncuk kuyucuklarına her antikordan bir mikrolitre ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Karıştırmadan, hücre örnekleri içeren her bir oyuğa 150 mikrolitre saponin tamponu ekleyin.
Boncukları yıkamak için her bir kompanzasyon kontrol kuyusuna 100 mikrolitre floresanla aktive olan hücre ayırma tamponu ekleyin. Plaka santrifüjlendikten sonra, hücre peletini yeniden süspanse edin ve sırasıyla 200 mikrolitre saponin tamponu ve floresanla aktive olan hücre ayırma tamponunda kontrol edin. Plakayı 500 g'da dört santigrat derecede altı dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
Hem hücre örneklerini hem de kompanzasyon kontrollerini 200 mikrolitre floresanla aktive olan hücre ayırma tamponunda yeniden süspanse edin. Süspansiyonları etiketli floresanla aktive olan hücre ayırma tüplerine aktarın. Tek hücreli RNA dizilimi, transkripsiyonel profillere dayalı olarak diğer beyin hücresi tiplerinden ayrı ayrı ayrı bir mikroglial küme tanımladı.
Diferansiyel ekspresyon analizi, Csf1r, Fcrls, Fyb, Adap2 ve P2ry12 dahil olmak üzere mikroglia'da önemli ölçüde yukarı regüle edilmiş genleri ortaya çıkardı. Mikroglial hücreler, CD45 ve CD11b belirteçlerinin farklı ekspresyonlarına dayalı olarak canlı beyin örneklerinden başarıyla izole edildi. CD80, CD86, iNOS, CD206 ve Arg1, CD86 ve CD64 ve CD163 ile CD206 dahil olmak üzere aktivasyon belirteçlerinin kombinasyonlarına dayalı olarak farklı mikroglial alt popülasyonlar tanımlandı.
Ptprc ve Itgam'ın işaretleyici gen ekspresyonu, umap projeksiyonunda spesifik olarak mikroglial kümeye lokalize edildi ve bu hücrelerin kimliği doğrulandı. Keman grafiği analizi, tedavi edilen mikrogliada araç kontrolüne kıyasla Fcgr1 ve Cd86 gibi anti-inflamatuar belirteçlerin daha düşük ekspresyonunu gösterdi.
Genel Bakış
Bu protokol, akış sitometrisi ve tek hücreli RNA sekanslamasını kombine ederek, erken doğum sonrası fare beyinlerinin serebelumlarında mikroglial hücre durumlarını izole etmek ve karakterize etmek için kullanılır. Enzimatik disosiasyon ve Percoll santrifüjlemesi ile birlikte immünosüsleme kullanarak, mikroglial heterojenliği ortaya çıkarır ve serebellar gelişim ve hastalıklardaki rollerinin anlaşılmasına katkı sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Gelişimsel Biyoloji
Arka Plan
- Mikroglia, beyin gelişimi ve fonksiyonu için kritik öneme sahiptir.
- Mikroglial dinamikleri anlamak, çeşitli hastalıklardaki rollerini aydınlatabilir.
- Mikroglial durumların karakterizasyonu, hedefe yönelik tedavilerin geliştirilmesi için esastır.
- Tek hücreli analizler, hücresel heterojenlik hakkında içgörüler sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Serebellumdaki mikroglial durumları izole etmek ve karakterize etmek.
- Beyin gelişiminde mikroglia'nın rolü hakkındaki anlamayı geliştirmek.
- Hastalık süreçlerinde mikroglial katılımı hakkındaki bilgilere katkıda bulunmak.
Kullanılan Yöntemler
- Kullanılan ana platform, akış sitometrisi ile birleştirilmiş tek hücreli RNA sekanslamasıdır.
- Biyolojik model, serebellar mikroglia üzerine odaklanarak erken doğum sonrası fare beyinlerini içerir.
- Önemli adımlar arasında hücreleri izole etmek için enzimatik disosiasyon ve Percoll santrifüjlemesi bulunur.
- Mikroglial özellikleri daha fazla analiz etmek için immünosüsleme teknikleri kullanılır.
Ana Sonuçlar
- Çalışma, mikroglial hücre durumlarını başarıyla izole etti ve heterojenliklerini ortaya çıkardı.
- Serebellerde gelişim sırasındaki mikroglial roller hakkında içgörüler elde edildi.
- Hastalık mekanizmalarındaki mikroglial etkiler hakkındaki anlama geliştirildi.
Sonuçlar
- Bu çalışma, mikroglial durumları analiz etmek için sağlam bir metodoloji gösterir.
- Nöronal mekanizmaların ve potansiyel hastalık modellerinin anlaşılmasına önemli katkıda bulunur.
- Bulgular, mikroglial fonksiyonları hedef alan gelecekteki tedavi stratejilerinin yolunu açabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
High-resolution characterization of microglial activation states in early postnatal mouse brain development is critical for de-risking neuroinflammation targets and understanding developmental mechanisms. Integrating flow cytometry and single-cell RNA sequencing enables robust, quantitative profiling of microglial heterogeneity, supporting predictive confidence in target validation and translational research. These methods provide a reproducible framework for advancing neuroimmune discovery programs and informing portfolio decisions in neurodevelopmental and neurodegenerative disease pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of microglial activation states and population diversity.
- Supports functional target validation by linking surface marker expression to transcriptomic profiles.
- Facilitates mechanistic de-risking of neuroimmune pathways in early development.
- Provides quantitative data for triaging neuroinflammation targets.
Screening & Assay Development
- Delivers validated cell isolation and gating strategies for reproducible microglia assays.
- Standardizes live/dead discrimination and marker profiling for downstream screening workflows.
- Enables scalable preparation of high-quality neural cell suspensions for compound evaluation.
- Supports platform reuse across multiple experimental conditions and perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns microglial phenotyping with disease-relevant transcriptomic signatures.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of neuroimmune mechanisms.
- Supports risk-adjusted advancement of neurodevelopmental and neurodegenerative models.
- Provides a foundation for translational biomarker identification in microglia-driven pathologies.
Pipeline & Workflow Integration
This dual-method workflow bridges early discovery and preclinical research by enabling robust microglial profiling from cell isolation to transcriptomic analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on microglial activation and diversity during brain development.
- Screening: Provides standardized, quantitative outputs for microglial marker expression and viability.
- Analytics: Delivers high-dimensional single-cell data and differential gene expression outputs for condition comparison.
- Translational Research: Connects microglial phenotypes to disease-relevant states and experimental perturbations.
- Enterprise Reuse: Offers adaptable protocols for diverse brain regions and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in neuroimmune target validation and mechanistic understanding.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and scalability of microglial profiling workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in neuroinflammation portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neuroimmune targets and models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, single-cell RNA sequencing, and neural tissue handling.
- Demands access to advanced instrumentation and bioinformatics infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of cell isolation and gating protocols.
- Adaptable to other brain regions with protocol optimization for tissue-specific characteristics.
- Dependent on validated antibodies and careful control of cell viability and state during processing.
