Floresan Mikroskopi ile Stromule Frekansı görselleştirme

Bu prosedürün genel amacı, yapraklar içerisinde canlı hücre konfokal floresan mikroskobisi kullanarak stromül sıklığını görselleştirmek ve belirlemek, ayrıca yapraklardan ekstrakte edilmiş kloroplastlar kullanılarak stromülleri in vitro ortamda görselleştirmektir. Bu deneysel yöntemler, stromüllerin nasıl çalıştığını ortaya çıkararak bitki hücre biyolojisi ve kloroplast araştırmalarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniklerin temel avantajı, oldukça dinamik olan bu kloroplast yapıları için bile tekrarlanabilir ve sağlam veriler üretmeleridir.

Bazı araştırmaların, stromül oluşumu için hücre iskeleti gibi sitozolik yapıların gerekliliğine işaret etmesi üzerine kloroplast izolasyon çalışmasını gerçekleştirmeye karar verdik. Bu nedenle, hücreyi parçalayarak stromüllerin hala oluşup oluşamadığını görmeyi hedefledik. Yaprak örneklerini hazırlamak için, öncelikle çok keskin bir jilet kullanarak bir Nicotiana benthamiana yaprağından küçük bir kesit alın.

Yaprak kesiti kesilir kesilmez, suyla doldurulmuş beş mililitrelik bir şırınganın içine daldırın. Ardından, şırıngadaki havayı boşaltın ve pistonu geri çekmeden önce şırınga ağzını parmağınızla kapatarak vakum uygulayın. Yaprak kesitine zarar vermemek için pistonu yavaşça serbest bırakın.

Ardından, hava tamamen tahliye edilip yaprak koyu yeşil görünene kadar hava çıkarma işlemini iki veya üç kez tekrarlayın. Bir lama bir damla su ekleyin ve yaprak kesitini damlanın üzerine yerleştirin. Daha sonra yaprağın üzerine bir damla daha su ekleyin ve bir kapatma camı yerleştirin.

Hava kabarcıkları varsa, kabarcıklar gidene kadar lam örtü camına hafifçe vurun. Geçirgen ışık ve 20x objektif kullanarak, aynı anda birden fazla kloroplastı görüntüleyecek şekilde yaprak kesitinin merkezine yakın bir görüş alanına odaklanın. Hücre tiplerinin daha sonra gerekirse ayırt edilebilmesi için geçirgen ışıkla bir görüntü kaydedin.

Ardından, kullanılan florofor için uygun eksitasyon ve emisyon filtreleriyle lazer aydınlatmasına geçin ve bir görüntü daha kaydedin. Mikroskop yazılımını kullanarak GFP kanalını seçin ve iğne deliği açıklığını (pinhole aperture) bir airy birime ayarlamak için tıklayın. Numuneyi görselleştirmeye başlamak için lazer taramayı seçin, ardından lazer gücünü minimize ederken stromüllerin hâlâ net bir şekilde görselleştirilebilmesi için GFP kanalına ve detektör kazancına tıklayın.

Ardından, görüş alanı içindeki yaprak epidermisi boyunca bir dizi görüntü toplayacak bir Z stack deneyi hazırlayın. Z stack'in hızlı bir şekilde toplanmasını sağlamak için tarama hızını ve görüntü çözünürlüğünü gerektiği şekilde ayarlayın. Daha sonra Z stack'i sonraki analizler için kaydedin.

Image J kullanarak, yazılımda maksimum yoğunluk (maximum intensity) seçeneği ile Z yığınını tek bir görüntüye dönüştürün. Ardından, görüntüdeki tüm kloroplastları tanımlayın ve manuel olarak sayın. Her bir kloroplast için, birleştirilmiş Z yığını görüntüsünde kloroplasttan uzanan bir veya daha fazla stromül görülüp görmediğini görsel olarak belirleyin.

Hasarsız kloroplastları ekstrakte etmek için, aşağıdaki reaktifleri kullanarak soğuk ekstraksiyon tamponu hazırlayın. Ardından, NaOH ve HCl ile pH değerini 6,9'a ayarlayın ve kullanmadan önce soğutun. İzolasyon tamponunu hazırlayın ve pH değerini 7,6'ya ayarlayın.

Yapraklar genetik olarak kodlanmış bir stromoflorofor eksprese etmiyorsa, Karboksifloresein diasetat veya CFDA çözeltisi hazırlayın. Kloroplastları izole etmek için, birkaç bitkiden yaklaşık 5 ila 10 gram yaprak koparın ve soğuk suyla kısa süreliğine durulayın. Ardından yaprakları derhal 50 mililitre soğuk ekstraksiyon tamponuna aktarın.

Bir blender yardımıyla birkaç kez kısa süreli çalıştırarak yaprakları öğütün, ardından yaprak kalıntılarını uzaklaştırmak için karışımı iki ila üç kat peynir bezinden süzün. Ekstrakt edilen kloroplastı iki adet 50 milliliter santrifüj tüpüne paylaştırın ve 750 x g hızında bir dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve yeşil kloroplastları yeniden süspande etmek için 10 milliters izolasyon tamponu kullanın.

Ardından 750 x g'de bir dakika boyunca tekrar santrifüjleyin, süpernatantı atın ve kloroplastları beş mililitrelik bir son hacme ulaşana kadar yeniden süspande etmek için izolasyon tamponu kullanın. Eğer kloroplastlar, plastid hedefli floresan proteinler eksprese eden transgenik bitkilerden elde edilmişse, kloroplastların 20 µL'sini bir lama aktarın ve bir lam camı ekleyin. Ardından mikroskopi işlemini gerçekleştirin.

Plastid hedefli floresan proteinler eksprese etmeyen bitkilerden elde edilen kloroplastları boyamak için, izolasyon tamponundaki 5 mL kloroplasta 5 µL 50 mM CFDA stok çözeltisi ekleyin. Kloroplastları beş dakika inkübe ettikten sonra küçük bir alikotu bir lam üzerine aktarın, bir lamellen kapatın ve mikroskopi işlemini gerçekleştirin. Son olarak, birden fazla kloroplastı aynı anda görüntülemek için bir FITC veya GFP filtre seti ve 20x objektif kullanın.

Veya tek bir izole kloroplastı görselleştirmek için daha yüksek büyütmeli bir objektif kullanılabilir. Burada, genç N.Benthamiana fidelerinin kotiledonlarındaki GFP stomul frekansını gösteren birleştirilmiş bir yığın görüntü yer almaktadır. Bu panelde, stromanın siyah görünmesi için görüntü doygunluğu azaltılmış ve renkler tersine çevrilmiştir.

Kloroplastlar ya stromul içermeyenler ya da en az bir stromul içerenler şeklinde etiketlendi. Görüntülenen 87 epidermal kloroplasttan 33'ü stromullara sahipti ve bu yaprakta frekans yüzde 37,9 olarak belirlendi. Bu grafik, 21 farklı bitkiden alınan tek bir yapraktaki 23.000'den fazla kloroplastın ve birkaç yüz hücrenin analizini temsil etmektedir.

Gündüz vakti ortalama stromül frekansı %20,8 ± 1,8 iken, gece vakti ortalama stromül frekansı %12,8 ± 0,9 olarak belirlenmiş olup, Welch's T testi ile tespit edildiği üzere gündüz frekansının anlamlı derecede daha yüksek olduğu görülmüştür. Bu şekilde, plastid hedefli GFP eksprese eden N.benthamiana'dan izole edildikten sonra veya CFDA kullanılarak N.benthamiana veya Spinachia oleracea kloroplastları boyandıktan sonra in vitro ortamda kloroplast stromülleri gözlemlenmiştir. Stromüllerin canlı hücre görüntülemesi yapılırken, hızlı çalışmak ve bitki dokusuna mümkün olduğunca az müdahale etmek önemlidir.

Bu prosedürün ardından, stromül oluşumu ve fonksiyonunda rol oynayan ek moleküler oyuncuları veya yolakları keşfetmek için gen susturma veya kimyasal tedaviler gibi diğer yöntemler kullanılabilir. Bu teknik, bitki hücre biyolojisi ve bitki immünolojisi alanındaki araştırmacılar tarafından, stromüllerin hücresel sinyal yolaklarındaki rolünü ve bitkilerin patojenlere verdiği tepkileri incelemek için kullanılmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, bir yapraktaki stromül frekansının nasıl hesaplanacağı ve ekstrakte edilmiş kloroplastlarda stromüllerin nasıl gözlemleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Ayrıca, bir taramalı elektron konfokal mikroskobuna güç sağlayan lazerlerin ve elektrik voltajının son derece tehlikeli olabileceğini ve bu ekipmanı kullanırken sistem gereksinimlerini anlamanın önemli olduğunu unutmayın.