Floresan Mikroskopi ile Stromule Frekansı görselleştirme

Bu prosedürün genel amacı, yapraklar içinde canlı hücre konfokal floresan mikroskobu kullanarak stromul frekansını görselleştirmek ve belirlemek ve yapraklardan ekstrakte edilen kloroplast kullanarak stromulleri in vitro olarak görselleştirmektir. Bu deneysel yöntemler, stromullerin nasıl çalıştığını keşfederek bitki hücre biyolojisi ve kloroplast araştırmalarındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniklerin temel avantajı, bu son derece dinamik kloroplast yapılarının bile tekrarlanabilir ve sağlam veriler üretmesidir.

Kloroplast izolasyon çalışması fikrimiz vardı çünkü bazı araştırmalar stromule oluşumunun hücre iskeleti gibi sitozolik yapıların oluşmasını gerektirdiğini öne sürdü. Bu yüzden hücreyi karıştırmaya karar verdik ve stromullerin hala oluşup oluşamayacağını görmeye karar verdik. Yaprak örnekleri hazırlamak için, bir Nicotiana benthamiana yaprağının küçük bir bölümünü kesmek için çok keskin bir tıraş bıçağı kullanarak başlayın.

Yaprak bölümünü kestikten hemen sonra, suyla dolu beş mililitrelik bir şırıngaya batırın. Ardından, şırıngadaki havayı çıkarın ve pistonu çekmeden önce şırınga deliğini kapatmak için bir parmağınızı kullanarak bir vakum uygulayın. Yaprak kısmına zarar vermemek için pistonu yavaşça serbest bırakın.

Ardından hava tahliyesini iki veya üç kez veya hava çıkana ve yaprak koyu yeşil görünene kadar tekrarlayın. Bir slayta bir damla su ekleyin ve yaprak kısmını damlanın üzerine yerleştirin. Sonra yaprağın üstüne bir damla daha su ekleyin ve bir kapak fişi ekleyin.

Herhangi bir hava kabarcığı varsa, çıkarılana kadar kapak fişine hafifçe vurun. İletilen ışık ve 20x objektifle, yaprak bölümünün merkezine yakın bir görüş alanına odaklanın ve aynı anda birden fazla kloroplastı görselleştirin. İletilen ışıkla bir görüntü kaydedin, böylece hücre tipleri daha sonra gerekirse ayırt edilebilir.

Ardından, kullanılan florofor için uygun uyarma ve emisyon filtreleriyle lazer aydınlatmaya geçin ve başka bir görüntü kaydedin. Mikroskop yazılımını kullanarak GFP kanalını seçin ve iğne deliği açıklığını havadar bir birime ayarlamak için tıklayın. Numuneyi görselleştirmeye başlamak için lazer taramayı seçin ve ardından stromulleri net bir şekilde görselleştirmeye devam ederken lazer gücünü en aza indirmek için GFP kanalına ve dedektör kazancına tıklayın.

Ardından, görüş alanındaki yaprak epidermisi boyunca bir dizi görüntüyü toplayacak bir Z yığını deneyi hazırlayın. Z yığınının hızlı bir şekilde toplandığından emin olmak için tarama hızını ve görüntü çözünürlüğünü gerektiği gibi ayarlayın. Ardından Z yığınını daha sonra analiz etmek üzere kaydedin.

J görüntüsünü kullanarak, yazılımdaki maksimum yoğunluğu kullanarak Z yığınını tek bir görüntüde birleştirin. Ardından görüntüdeki tüm kloroplastları tanımlayın ve manuel olarak sayın. Her kloroplast için, birleştirilmiş Z yığını görüntüsünde kloroplasttan uzanan bir veya daha fazla stromulun görülüp görülmediğini görsel olarak belirleyin.

Bozulmamış kloroplastları çıkarmak için, aşağıdaki reaktifleri kullanarak soğuk ekstraksiyon tamponu hazırlayın. Ardından, NaOH ve HCl ile pH'ı 6.9'a ayarlayın ve kullanmadan önce soğutun. İzolasyon tamponunu hazırlayın ve pH'ı 7.6'ya ayarlayın.

Yapraklar genetik olarak kodlanmış bir stromoflorofofor ifade etmiyorsa, Karboksifloresein diasetat veya CFDA çözeltisi hazırlayın. Kloroplastları izole etmek için, birkaç bitkiden yaklaşık 5 ila 10 gram yaprak çıkarın ve kısa bir süre soğuk suyla durulayın. Daha sonra yaprakları hemen 50 mililitre soğuk ekstraksiyon tamponuna aktarın.

Birkaç kısa darbeli bir blender kullanarak yaprakları öğütün, ardından yaprak kalıntılarını gidermek için karışımı iki ila üç kat peynir bezinden süzün. Ekstrakte edilen kloroplastı iki adet 50 mililitrelik santrifüj tüpüne bölün ve 750 x g'da bir dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve yeşil kloroplastları yeniden askıya almak için 10 militer izolasyon tamponu kullanın.

Daha sonra 750 x g'da bir dakika boyunca tekrar santrifüjleyin, süpernatanı atın ve kloroplastları beş mililitrelik nihai hacme kadar yeniden süspanse etmek için izolasyon tamponu kullanın. Kloroplastlar, plastid hedefli floresan proteinleri ifade eden transgenik bitkilerden geliyorsa, 20 mikrolitre kloroplastı bir slayta aktarın ve bir kapak fişi ekleyin. Sonra mikroskopi yapın.

Plastid hedefli floresan proteinleri ifade etmeyen bitkilerden kloroplastları boyamak için, izolasyon tamponundaki beş mililitre kloroplasta beş mikrolitre 50 milimolar CFDA stoğu ekleyin. Kloroplastların beş dakika inkübe etmesine izin verdikten sonra, küçük bir alikotu bir slayta aktarın, bir kapak fişi ekleyin ve mikroskopi yapın. Son olarak, aynı anda birden fazla kloroplastı görselleştirmek için bir FITC veya GFP filtre seti ve 20x'lik bir objektif kullanın.

Veya tek bir izole kloroplastı görselleştirmek için daha yüksek bir hedef. Genç N.Benthamiana fidelerinin döllenmesinde GFP stomule frekansını gösteren birleştirilmiş bir yığın burada gösterilmektedir. Bu panelde, görüntü doygunluğu azaltıldı ve stroma siyah görünecek şekilde ters çevrildi.

Kloroplastlar ya stromül yok ya da en az bir stromüle sahip olarak etiketlendi. Görüntülenen 87 epidermal kloroplasttan 33'ü, bu yaprakta yüzde 37.9'luk bir frekansa sahip stromüle sahiptir. Bu grafik, 21 farklı bitkiden tek bir yapraktan 23.000'den fazla kloroplast ve birkaç yüz hücrenin analizini temsil eder.

Gün boyunca ortalama stromule frekansı yüzde 20.8 artı veya eksi yüzde 1.8 idi ve ortalama gece stromule frekansı yüzde 12.8 artı veya eksi yüzde 0.9 idi, bu da Welch'in T testi ile belirlendiği gibi önemli ölçüde daha yüksek bir gündüz sıklığını gösteriyordu. Bu şekilde, kloroplast stromules, plastid hedefli GFP'yi eksprese eden N. benthamiana'dan izolasyondan sonra veya N. benthamiana veya Ispanak oleracea'dan kloroplastları boyamak için CFDA kullandıktan sonra in vitro olarak gözlenmiştir. Stromüllerin canlı hücre görüntülemesi yapılırken, hızlı çalışmak ve bitki dokusunu mümkün olduğunca az manipüle etmek önemlidir.

Bu prosedürü takiben, gen susturma veya kimyasal işlemler gibi diğer yöntemler, stromul oluşumu ve işlevinde yer alan ek moleküler oyuncuları veya yolları keşfetmek için kullanılabilir. Bu teknik, bitki hücre biyolojisi ve bitki bağışıklığı araştırmacıları tarafından, stromullerin hücresel sinyal yollarındaki rolünü ve patojenlere bitki tepkilerini incelemek için kullanılmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, bir yapraktaki stromule frekansının nasıl hesaplanacağını ve ekstrakte edilen kloroplastlardaki stromullerin nasıl gözlemleneceğini iyi anlamış olmalısınız.

Ve bir taramalı elektron konfokal mikroskobu besleyen lazerlerin ve elektrik voltajının son derece tehlikeli olabileceğini ve bu ekipmanı kullanmak için sistem gereksinimlerini anlamanın önemli olduğunu unutmayın.