Canlı Hücre Görüntüleme Bacillus subtilis Ve Streptococcus pneumoniae Otomatik Zaman atlamalı Mikroskopi

Bu prosedürün genel amacı, floresan mikroskobu kullanarak canlı hücreleri büyüme ve bölünme yoluyla görüntülemektir, böylece hücre tarihinin ve atalarının bakterilerin hücresel gelişimi üzerindeki etkisi incelenebilir. Bu, önce hücrelerin nispeten yüksek besin konsantrasyonlarına sahip sıvı ortamdan sıvı açlık ortamına aktarılmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, bakteri hücrelerinin bir mikro koloni halinde büyüyeceği mikroskobik bir slayt.

Tek tabaka hazırlanır. Daha sonra hızlandırılmış bir floresan mikroskobu filmi kaydedilir. Son olarak, film işlenir ve veriler analiz edilir.

Sonuç olarak, hızlandırılmış floresan mikroskobu ile tek bir bakteri hücresinin gelişimini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin akış sitometrisi ve standart mikroskopi gibi mevcut tekniklere göre en büyük avantajı, protein dinamiklerinin, hücresel davranışın ve zaman içinde tek hücrelerin gelişiminin izlenmesine izin vermesidir, bu da prosedürün koni içinde olacağını gösterir, laboratuvarımdan bir doktora öğrencisi Eksi 80 santigrat dereceden b tuus hücreleri hazırlamak için, Gerekirse antibiyotiklerle desteklenmiş steril çalkalama şişelerinde 10 mililitre hızlandırılmış mikroskopi veya TLM ortamında stoklar, hücreleri gece boyunca 30 santigrat derece ve ertesi sabah steril bir çalkalama şişesinde 225 RPM'de büyütün ve hücreleri bir ila 10 arasında yağmalayın Ön ısıtma, kimyasal olarak tanımlanmış ortam veya antibiyotiksiz CDM, arı en ince hücrelerini orta üstel faza kadar büyütün, bu da yaklaşık dört saat sürer. Kültürün absorbansını 600 nanometrede ölçün ve hücreleri yaklaşık 600 ° 0.035'e seyreltin.

CDM'yi kullanma. Bu OD, hücreler arasında uygun boşluğa sahip tek hücrelerin, hızlandırılmış mikroskopi için mikroskop Slaytında tespit edilmesini sağlar. Hücreler orta üstel büyümeye ulaşmadan bir saat önce.

İki cam lamı %70 etanol ve su ile temizleyerek mikroskop lamını hazırlayın. Çerçevenin diğer tarafındaki plastik kapağın sökülmesine neden olmamaya dikkat ederek plastik kapaklardan birini gen çerçevesinden çıkarın. Gen çerçevesini cam slaytlardan birinin ortasına önce bir tarafa yapıştırarak, ardından geri kalanını tırnağınızla yönlendirerek takın.

150 miligram yüksek çözünürlüklü düşük erime noktalı aroları çözmek için bir mikrodalga kullanın. 10 mililitre CDM'de, arka plan floresansını önlemek için aroların tamamen çözüldüğünden emin olun. 500 mikrolitre ılık agro CDM'yi gen çerçevesinin ortasına pipetleyin ve sınırlar da dahil olmak üzere tüm alanın tamamen kaplandığından emin olun.

Aros'un aşırı kurumasını önlemek için hızlı çalışmak. İkinci cam slaytı, hava kabarcıklarını önlemeye çalışarak Aros CDM dolgulu gen çerçevesine yerleştirin. Agrosların yeterince katılaşmasını sağlamak için sandviçi 45 dakika boyunca dört santigrat derecede yatay konuma getirin.

Aros dikkatlice katılaştıktan sonra üst camı kaydırın. Bakterilerin büyüyeceği yaklaşık beş milimetre genişliğinde agro şeritleri kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın. Slayt başına, her iki tarafta yaklaşık dört milimetre boşlukla ayrılmış en fazla üç şerit kullanılabilir.

Bu alanlar, Blu'nun büyümesi için gerekli olan havayı sağlayacaktır. Yapışkan tarafı ortaya çıkarmak için ikinci ve son plastik kapağı gen çerçevesinden dikkatlice çıkarın. Tek hücreleri, dokunmadan agros pedinin üstünden başlayarak katı ortama yaklaşık 2,5 mikrolitre sıvı içinde yükleyin.

Pipet ucuyla, sürgüyü yukarı ve aşağı eğerek ortamın eşit şekilde yayılmasına izin verin. Kapak kızağını tamamen takmak için gen çerçevesine temiz bir mikroskop kapağı yerleştirin. Baskı uygulamak için tırnağınızı kullanın Yani hücreler yüklendikten sonra.

Sıvının yeterince uzun süre kurumasını beklemek çok önemlidir, böylece yüzücü hücreler elde etmezsiniz ve birden fazla katmanda büyürsünüz. Bununla birlikte, hücreler çok uzun süre kurutulursa, o zaman bir mikro kolon tek tabakasına dönüşme problemleri olacaktır. Bu nedenle, slaytlarınızı kurutmak için gereken süre deneye bağlıdır ve ölçülemez.

Ve sonuç olarak, elbette bunun için bir fikir edinmek gerekir: Hızlandırılmış deneyin ilk saatlerinde otomatik odaklama sorunlarını önlemek için, hızlandırılmış mikroskopiye hazırlanmak için slaytı 30 santigrat derecede bir saat önceden ısıtın. Çevre odasını en az iki saat önceden ısıtın. Deneye başlamadan önce, deney düzeneğinize göre uygun objektif filtrelerini ve dikroik aynayı seçin.

Uzun deneyler için, ışık kaynağı ile numune arasına bir UV filtresi yerleştirildiğinden emin olun. Ek olarak, mümkünse, maruz kalmayı en aza indirmek için nötr yoğunluk filtreleri kullanarak uyarma ışığının bir kısmını engelleyin. Deneyi belirli deney düzeneğine göre programlayın.

Gerçek deneyden önce belirli yapılar için gereken ışık miktarını ve diğer hızlandırılmış mikroskoplar veya bakteriler için otomatik odaklama ayarlarını belirlemek akıllıca olacaktır. Daha kısa pozlama süreleri ve daha düşük uyarma ışığı seviyeleri, ağartmayı ve fototoksisiteyi en aza indirecektir Otomatik odaklama işlevi için skopik ışık kullanın. Son olarak, hazırlanan slaytı mikroskobun ön ısıtmalı çevre odasına yerleştirin ve tek hücrelerin 30 santigrat derecede bir mikro koloni tek tabakasına büyümesini izleyin.

Başarılı bir hızlandırılmış floresan deneyi, tamamen görüş alanı içinde yer alan bir mikro koloni tek tabakası üretecektir. Bu filmdeki deneyin sonunda solda parlak alan var ve floresan görülebiliyor. Sağda.

Burada, bazı hücrelerin birbiri üzerine büyüdüğü ve geçmişlerini doğru bir şekilde takip etmeyi ve floresan seviyelerini doğru bir şekilde ölçmeyi zorlaştıran bir B Subtles mikro kolonisi örneği verilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, hızlandırılmış mikroskopi için mikroskobik bir numunenin nasıl başarılı bir şekilde hazırlanacağını ve hızlandırılmış bir floresan mikroskobunun nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. BACE hücreleri ile deney yapın.