Canlı Hücre Görüntüleme Bacillus subtilis Ve Streptococcus pneumoniae Otomatik Zaman atlamalı Mikroskopi
July 28th, 2011
Bu protokol, otomatik floresan zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak zaman farklı bakteriler tek hücre davranışlarını izlemek için bir adım-adım yordam sağlar. Ayrıca, biz nasıl mikroskobu görüntüleri analiz etmek için yönergeler sağlar.
Bu prosedürün genel amacı, floresan mikroskobu kullanarak canlı hücreleri büyüme ve bölünme yoluyla görüntülemektir, böylece hücre tarihinin ve atalarının bakterilerin hücresel gelişimi üzerindeki etkisi incelenebilir. Bu, önce hücrelerin nispeten yüksek besin konsantrasyonlarına sahip sıvı ortamdan sıvı açlık ortamına aktarılmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, bakteri hücrelerinin bir mikro koloni halinde büyüyeceği mikroskobik bir slayt.
Tek tabaka hazırlanır. Daha sonra hızlandırılmış bir floresan mikroskobu filmi kaydedilir. Son olarak, film işlenir ve veriler analiz edilir.
Sonuç olarak, hızlandırılmış floresan mikroskobu ile tek bir bakteri hücresinin gelişimini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin akış sitometrisi ve standart mikroskopi gibi mevcut tekniklere göre en büyük avantajı, protein dinamiklerinin, hücresel davranışın ve zaman içinde tek hücrelerin gelişiminin izlenmesine izin vermesidir, bu da prosedürün koni içinde olacağını gösterir, laboratuvarımdan bir doktora öğrencisi Eksi 80 santigrat dereceden b tuus hücreleri hazırlamak için, Gerekirse antibiyotiklerle desteklenmiş steril çalkalama şişelerinde 10 mililitre hızlandırılmış mikroskopi veya TLM ortamında stoklar, hücreleri gece boyunca 30 santigrat derece ve ertesi sabah steril bir çalkalama şişesinde 225 RPM'de büyütün ve hücreleri bir ila 10 arasında yağmalayın Ön ısıtma, kimyasal olarak tanımlanmış ortam veya antibiyotiksiz CDM, arı en ince hücrelerini orta üstel faza kadar büyütün, bu da yaklaşık dört saat sürer. Kültürün absorbansını 600 nanometrede ölçün ve hücreleri yaklaşık 600 ° 0.035'e seyreltin.
CDM'yi kullanma. Bu OD, hücreler arasında uygun boşluğa sahip tek hücrelerin, hızlandırılmış mikroskopi için mikroskop Slaytında tespit edilmesini sağlar. Hücreler orta üstel büyümeye ulaşmadan bir saat önce.
İki cam lamı %70 etanol ve su ile temizleyerek mikroskop lamını hazırlayın. Çerçevenin diğer tarafındaki plastik kapağın sökülmesine neden olmamaya dikkat ederek plastik kapaklardan birini gen çerçevesinden çıkarın. Gen çerçevesini cam slaytlardan birinin ortasına önce bir tarafa yapıştırarak, ardından geri kalanını tırnağınızla yönlendirerek takın.
150 miligram yüksek çözünürlüklü düşük erime noktalı aroları çözmek için bir mikrodalga kullanın. 10 mililitre CDM'de, arka plan floresansını önlemek için aroların tamamen çözüldüğünden emin olun. 500 mikrolitre ılık agro CDM'yi gen çerçevesinin ortasına pipetleyin ve sınırlar da dahil olmak üzere tüm alanın tamamen kaplandığından emin olun.
Aros'un aşırı kurumasını önlemek için hızlı çalışmak. İkinci cam slaytı, hava kabarcıklarını önlemeye çalışarak Aros CDM dolgulu gen çerçevesine yerleştirin. Agrosların yeterince katılaşmasını sağlamak için sandviçi 45 dakika boyunca dört santigrat derecede yatay konuma getirin.
Aros dikkatlice katılaştıktan sonra üst camı kaydırın. Bakterilerin büyüyeceği yaklaşık beş milimetre genişliğinde agro şeritleri kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın. Slayt başına, her iki tarafta yaklaşık dört milimetre boşlukla ayrılmış en fazla üç şerit kullanılabilir.
Bu alanlar, Blu'nun büyümesi için gerekli olan havayı sağlayacaktır. Yapışkan tarafı ortaya çıkarmak için ikinci ve son plastik kapağı gen çerçevesinden dikkatlice çıkarın. Tek hücreleri, dokunmadan agros pedinin üstünden başlayarak katı ortama yaklaşık 2,5 mikrolitre sıvı içinde yükleyin.
Pipet ucuyla, sürgüyü yukarı ve aşağı eğerek ortamın eşit şekilde yayılmasına izin verin. Kapak kızağını tamamen takmak için gen çerçevesine temiz bir mikroskop kapağı yerleştirin. Baskı uygulamak için tırnağınızı kullanın Yani hücreler yüklendikten sonra.
Sıvının yeterince uzun süre kurumasını beklemek çok önemlidir, böylece yüzücü hücreler elde etmezsiniz ve birden fazla katmanda büyürsünüz. Bununla birlikte, hücreler çok uzun süre kurutulursa, o zaman bir mikro kolon tek tabakasına dönüşme problemleri olacaktır. Bu nedenle, slaytlarınızı kurutmak için gereken süre deneye bağlıdır ve ölçülemez.
Ve sonuç olarak, elbette bunun için bir fikir edinmek gerekir: Hızlandırılmış deneyin ilk saatlerinde otomatik odaklama sorunlarını önlemek için, hızlandırılmış mikroskopiye hazırlanmak için slaytı 30 santigrat derecede bir saat önceden ısıtın. Çevre odasını en az iki saat önceden ısıtın. Deneye başlamadan önce, deney düzeneğinize göre uygun objektif filtrelerini ve dikroik aynayı seçin.
Uzun deneyler için, ışık kaynağı ile numune arasına bir UV filtresi yerleştirildiğinden emin olun. Ek olarak, mümkünse, maruz kalmayı en aza indirmek için nötr yoğunluk filtreleri kullanarak uyarma ışığının bir kısmını engelleyin. Deneyi belirli deney düzeneğine göre programlayın.
Gerçek deneyden önce belirli yapılar için gereken ışık miktarını ve diğer hızlandırılmış mikroskoplar veya bakteriler için otomatik odaklama ayarlarını belirlemek akıllıca olacaktır. Daha kısa pozlama süreleri ve daha düşük uyarma ışığı seviyeleri, ağartmayı ve fototoksisiteyi en aza indirecektir Otomatik odaklama işlevi için skopik ışık kullanın. Son olarak, hazırlanan slaytı mikroskobun ön ısıtmalı çevre odasına yerleştirin ve tek hücrelerin 30 santigrat derecede bir mikro koloni tek tabakasına büyümesini izleyin.
Başarılı bir hızlandırılmış floresan deneyi, tamamen görüş alanı içinde yer alan bir mikro koloni tek tabakası üretecektir. Bu filmdeki deneyin sonunda solda parlak alan var ve floresan görülebiliyor. Sağda.
Burada, bazı hücrelerin birbiri üzerine büyüdüğü ve geçmişlerini doğru bir şekilde takip etmeyi ve floresan seviyelerini doğru bir şekilde ölçmeyi zorlaştıran bir B Subtles mikro kolonisi örneği verilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, hızlandırılmış mikroskopi için mikroskobik bir numunenin nasıl başarılı bir şekilde hazırlanacağını ve hızlandırılmış bir floresan mikroskobunun nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. BACE hücreleri ile deney yapın.
Genel Bakış
Bu protokol, otomatik floresan zaman aralıklı mikroskopi kullanarak tek bakteri hücrelerinin zaman içindeki davranışını izlemek için bir yöntem sunar. Numunelerin hazırlanması ve elde edilen görüntülerin analiz edilmesi için ayrıntılı kılavuzlar içerir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Hücre Biyolojisi
- Floresan Mikroskopi
Arka Plan
- Bakteryal hücre davranışının anlaşılması çeşitli biyolojik çalışmalar için kritik öneme sahiptir.
- Zaman aralıklı mikroskopi, canlı hücre dinamiklerinin gözlemlenmesini sağlar.
- Bu yöntem, hücre geçmişinin gelişim üzerindeki etkileri hakkında bilgiler sunar.
- Geleneksel yöntemler, tek hücreli davranışın nüanslarını yakalayamayabilir.
Çalışmanın Amacı
- Büyüme ve bölünme sırasında canlı bakteri hücrelerini görselleştirmek.
- Besin koşullarının hücresel gelişim üzerindeki etkisini analiz etmek.
- Protein dinamikleri ve hücresel davranış hakkındaki anlamayı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Büyümeyi başlatmak için hücreleri açlık ortamına aktarmak.
- Bakteryal büyüme için bir mikroskopik slayt hazırlamak.
- Zaman aralıklı floresan mikroskopi filmleri kaydetmek.
- Kayıtlı verileri analiz ederek hücre gelişimini gözlemlemek.
Ana Sonuçlar
- Zaman içinde tek bakteri hücrelerinin başarılı görüntülemesini sağlamak.
- Mikro koloni oluşumu ve gelişiminin gözlemlenmesi.
- Tek hücrelerde protein ekspresyonunun dinamikleri hakkında bilgiler elde etmek.
- Zaman aralıklı mikroskopinin geleneksel yöntemlere göre avantajlarının gösterilmesi.
Sonuçlar
- Protokol, bakterilerde tek hücreli davranışın çalışılmasını etkili bir şekilde sağlar.
- Zaman aralıklı mikroskopi, hücresel analiz için güçlü bir araçtır.
- Gelecekteki çalışmalar, diğer bakteri dinamiklerini keşfetmek için bu yöntem üzerine inşa edebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Monitoring single-cell behavior in bacteria enables mechanistic de-risking of antimicrobial target validation by revealing heterogeneity in growth, division, and protein expression. This approach supports predictive confidence in early discovery by linking cellular history to phenotypic outcomes, informing portfolio triage for antibiotic development. Time-lapse microscopy provides translational continuity from mechanistic screening to preclinical model evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by tracking individual cell responses to nutrient shifts and genetic perturbations over time.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct observation of protein dynamics and cellular behavior in single cells.
- Predictive Value: Supports lead identification by correlating cellular ancestry with phenotypic stability across generations.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing reproducible microcolony formation on agarose pads.
- Quantitative Outputs: Generates time-resolved fluorescence and brightfield data enabling measurement of growth rates, division timing, and protein localization.
- Scalability: Supports platform reuse across bacterial species (B. subtilis, S. pneumoniae) for standardized antimicrobial target assessment.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models pathogen behavior in clinically relevant species like S. pneumoniae to inform antimicrobial mechanism of action studies.
- Translational Biomarker Alignment: Links single-cell protein dynamics to population-level phenotypes, supporting biomarker-driven go/no-go decisions.
- Risk-Adjusted Advancement: Reduces mechanistic ambiguity in preclinical models by validating target effects at single-cell resolution.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions single-cell time-lapse imaging between target validation and lead optimization, enabling hypothesis testing and mechanistic de-risking before compound screening.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by visualizing how gene expression dynamics influence cellular behavior during growth and division.
- Screening: Delivers assay-ready microcolonies with standardized spacing and monolayer formation for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative dependent variables including fluorescence intensity, division timing, and lineage tracking for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects single-cell observations to preclinical continuity through ancestry-dependent behavior modeling in pathogen systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable microscopy capability for cross-project antimicrobial target assessment across Gram-positive models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct observation of single-cell protein dynamics and behavioral heterogeneity.
- Operational Value: Standardized slide preparation and environmental controls ensure reproducibility across laboratories and experimental runs.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by de-risking targets based on single-cell response consistency rather than population averages.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of antimicrobial candidates using lineage-resolved phenotypic data to avoid false positives from population masking.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbial culture techniques, fluorescence microscopy, and image analysis software like ImageJ.
- Dependent on temperature-controlled environmental chambers, neutral density filters, and UV protection for long-term imaging.
- Necessitates cross-team standardization of slide preparation, agarose concentration, and cell loading protocols for inter-laboratory consistency.
- Adaptation considerations include optimizing agarose thickness and nutrient composition for different bacterial species and growth rates.
- Practical limitations include phototoxicity risks during extended imaging and challenges in tracking cells that grow in multilayer formations.
