Canlı Hücre Görüntüleme Bacillus subtilis Ve Streptococcus pneumoniae Otomatik Zaman atlamalı Mikroskopi

Bu prosedürün genel amacı, bakteri hücrelerinin hücresel gelişimi üzerindeki hücre geçmişi ve soy ağacı etkisini inceleyebilmek için, canlı hücrelerin büyüme ve bölünme süreçlerini floresan mikroskobu ile görüntülemektir. Bu işlem, öncelikle hücrelerin nispeten yüksek besin konsantrasyonlarına sahip sıvı ortamdan sıvı açlık ortamına aktarılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, bakteriyel hücrelerin bir mikro koloniye dönüşerek büyüyeceği bir mikroskop lamı hazırlanır.

Monolayer hazırlanır. Ardından, zaman atlamalı floresan mikroskopi videosu kaydedilir. Son olarak, video işlenir ve veriler analiz edilir.

Nihayetinde, zaman ayarlı floresan mikroskobu aracılığıyla tek bir bakteriyel hücrenin gelişimi gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin, akış sitometrisi ve standart mikroskopi gibi mevcut tekniklere göre temel avantajı; protein dinamiklerinin, hücresel davranışın ve tek hücrelerin zaman içindeki gelişiminin izlenmesine olanak tanımasıdır. Prosedür, laboratuvarımdan doktora öğrencisi Cone tarafından gösterilecektir. B. subtilis hazırlamak için, -80 °C'deki stoklardan hücreleri, gerekiyorsa antibiyotiklerle desteklenmiş 10 mL zaman ayarlı mikroskopi veya TLM besiyerine, steril çalkalamalı erlenlere inoküle edin; hücreleri steril bir çalkalamalı erlen içinde 30 °C'de ve 225 RPM'de gece boyunca büyütün. Ertesi sabah hücreleri, antibiyotiksiz, önceden ısıtılmış kimyasal olarak tanımlanmış besiyerine (CDM) 1:10 oranında aktarın; B. subtilis hücrelerini, yaklaşık dört saat süren orta eksponansiyel faza kadar büyütün. Kültürün absorbansını 600 nanometre'de ölçün ve hücreleri yaklaşık 0,035 a$_{600}$ değerine seyreltin.

CDM kullanılarak. Bu OD, hücreler arasında uygun boşluklar olan tek hücrelerin, zaman ayarlı mikroskopi için mikroskop lamı üzerine damlatılmasını sağlar. Hücrelerin orta eksponansiyel büyüme evresine ulaşmasından bir saat önce.

İki lamı %70 ethanol ve su ile temizleyerek mikroskop lamını hazırlayın. Gen çerçevesinin plastik kapaklarından birini, çerçevenin diğer tarafındaki plastik kapağın yerinden çıkmamasına dikkat ederek çıkarın. Gen çerçevesini, önce bir tarafını yapıştırıp ardından kalan kısmını bir tırnak yardımıyla yönlendirerek lamlardan birinin ortasına sabitleyin.

150 mg yüksek çözünürlüklü düşük erime noktalı agarozun çözünmesi için mikrodalga fırın kullanın. Arka plan floresansını önlemek için agarozun 10 mL CDM içinde tamamen çözündüğünden emin olun. Isıtılmış agaroz CDM'den 500 µL'yi, kenarlar da dahil olmak üzere tüm alanın tamamen kaplandığından emin olarak gen çerçevesinin ortasına pipetleyin.

Agarozun aşırı kurumasını önlemek için hızlı çalışın. Hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek, ikinci lamı agaroz CDM ile doldurulmuş gen çerçevesinin üzerine yerleştirin. Agarozun yeterince katılaşması için sandviç yapısını 4 °C'de, yatay pozisyonda 45 dakika bekletin.

Agar katılaştıktan sonra, üst camı dikkatlice kaydırarak çıkarın. Bakterilerin büyüyeceği, yaklaşık beş milimetre genişliğinde agar şeritleri kesmek için bir jilet kullanın. Her lam için, her iki yanından yaklaşık dört milimetrelik boşluklarla ayrılmış en fazla üç şerit kullanılabilir.

Bu boşluklar, Blu büyümesi için gerekli olan havayı sağlayacaktır. Yapışkan tarafı açığa çıkarmak için gen çerçevesindeki ikinci ve son plastik kapağı dikkatlice çıkarın. Agros pedine değdirmeden, pedin üst kısmından başlayarak katı besiyeri üzerine yaklaşık 2.5 µL sıvı içindeki tek hücreleri yükleyin.

Pipet ucuyla, lamı yukarı ve aşağı eğerek besiyerinin eşit şekilde yayılmasını sağlayın. Lamelini tamamen yapıştırmak için gen çerçevesinin üzerine temiz bir mikroskop kapatıcısı yerleştirin. Hücreler yüklendikten sonra basınç uygulamak için bir tırnak kullanın.

Hücrelerin yüzeyde kaymasını ve çok katmanlı büyümesini önlemek için sıvının yeterince kurumasını beklemek kritik öneme sahiptir. Ancak, hücreler çok uzun süre kurumaya bırakılırsa, mikro kolon tek tabakası oluşturarak büyüme konusunda sorunlar yaşayacaklardır. Bu nedenle, lamların kuruması için gereken süre deneye bağlıdır ve kesin olarak ölçülemez.

Ve sonuç olarak, elbette bununla ilgili bir deneyim kazanmak gerekir. Time-lapse deneyinin ilk saatlerinde otomatik odaklama sorunlarını önlemek için, time-lapse mikroskobisine hazırlık amacıyla lamı 30 °C'de bir saat boyunca ön ısıtmaya tabi tutun. Çevre odasını en az iki saat ön ısıtmaya tabi tutun. Deneye başlamadan önce, deneysel kurulumunuza uygun objektif filtrelerini ve dikroik aynayı seçin.

Uzun süreli deneyler için, ışık kaynağı ile numune arasına bir UV filtresi yerleştirildiğinden emin olun. Ayrıca, maruziyeti minimize etmek için mümkünse nötr yoğunluk filtreleri kullanarak eksitasyon ışığının bir kısmını engelleyin. Deneyi, spesifik deneysel kuruluma göre programlayın.

Asıl deneyden önce, belirli konstrüktler için gereken ışık miktarının yanı sıra diğer time-lapse mikroskoplar veya bakteriler için otomatik odaklama ayarlarının belirlenmesi yerinde olacaktır. Daha kısa pozlama süreleri ve daha düşük eksitasyon ışığı seviyeleri, ağarma ve fototoksisiteyi minimize edecektir. Otomatik odaklama fonksiyonu için mikroskobik ışık kullanın. Son olarak, hazırlanan lamı mikroskobun önceden ısıtılmış çevresel haznesine yerleştirin ve tek hücrelerin 30 °C'de bir mikro koloni monolayer tabakasına gelişimini izleyin.

Başarılı bir zaman ayarlı floresan deneyi, görüş alanı içerisinde tamamen yer alan bir mikro koloni monolayer tabakası oluşturacaktır. Bu videodaki deneyin sonunda, sol tarafta bright field görüntüsü, sağ tarafta ise floresan görüntüsü görülebilir.

Burada, bazı hücrelerin birbirinin üzerine büyümesi nedeniyle hem geçmişlerinin doğru şekilde izlenmesini hem de floresan düzeylerinin doğru ölçülmesini zorlaştıran bir B Subtles mikro kolonisi örneği görülmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, zaman ayarlı mikroskopi için mikroskobik bir örneğin nasıl başarıyla hazırlanacağı ve zaman ayarlı floresan mikroskopinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. BACE hücreleri ile deney yapınız.