ImageJ Eklentileri Kullanma Hücre Sayım Usul Otomatik Niceleme ve Analizi

Bu protokolün genel amacı, bir süspansiyondaki hücrelerin veya bir istila tahlil zarındaki bir göçteki hücrelerin doğru sayımlarını hızlı bir şekilde yapmak için dijital analiz araçlarını kullanmaktır. Bu protokol, araştırmacıların yaygın teknikler ve in vitro hücre motilite deneyleri için gerekli hücre sayısını ölçmelerine yardımcı olabilir. Bu yöntemin en büyük avantajı, birden fazla filtre ve analiz aracı içerirken hızlı ve doğru hücre sayımları sağlamasıdır.

Başlamak için mikroskop aydınlatmasını maksimuma ayarlayın. 4x objektife geçin ve faz kontrast filtrelerinin kullanımda olduğundan emin olun. Ardından, mikroskop yazılımı içinde görüntü yakalama ayarlarını varsayılan değerlerine ayarlayın.

Şimdi mikroskop tablasına standart bir hemositometre yerleştirin ve görüntü hacmi kalibrasyon adımı için bir görüntü yakalayın. Pozlama süresini gerektiği gibi ayarlayın. ImageJ'de, hücre konsantrasyonu hesaplayıcısı altında görüntüyü açın ve Görüntü Boyutunu Al düğmesine tıklayın.

Bu eylem, görüntü genişliği ve yüksekliği metin kutularını piksel cinsinden görüntü çözünürlüğüyle doldurur. Ardından, düz çizgi aracını seçin ve imleci tıklayıp sürükleyerek hemositometrenin birincil p-karesinin tüm uzunluğu boyunca düz bir çizgi çizin. Ardından, sonuçlar penceresini görüntülemek için M tuşuna basın.

Şimdi, uzunluk sütunundaki değeri hücre konsantrasyonu hesaplayıcısındaki p-kare uzunluk metin kutusuna yazın. Ardından, üzerine tıklayın Görüntü Hacmini Hesapla Görüntü hacmini görüntü hacmi metin kutusuna çıkarmak için düğmesine basın. Son olarak, eklentinin kalibrasyonunu tamamlamak için Kaydet düğmesine tıklayın.

Numune analizi için, bir hemositometre lamının her iki odasına 10 mikrolitre hücre yükleyin ve odağı, hücrelerin iç kısmı hücre zarından daha koyu olacak şekilde ayarlayın, böylece kutuplarda değil, hücrenin merkezi kesitinde odak sağlar. Ardından, hücrelerin aşırı pozlanmaması için pozlamayı daha da ayarlayın. Hafifçe görünür hemositometre çizgileri kabul edilebilir.

Şimdi, hemositometrenin merkezi bölgesinin beş ila on örtüşmeyen görüntüsünü yakalayın. Her görüntünün çözünürlüğü ve büyütmesi, hacim kalibrasyon görüntüsüyle aynı olmalıdır. Ardından, hücre konsantrasyonu hesaplayıcısında Hücre Sayısı'na tıklayın ve açılır pencerede sayılacak bir klasör seçin.

Ardından, örnek numarası giriş kutusuna, oda başına çekilen görüntü sayısını girin ve Tamam'a tıklayın. Eklenti şimdi verileri toplayacaktır. Daha fazla ayrıntı için metne bakın. Başlamak için, mikroskop yazılımı içinde görüntü yakalama ayarlarını varsayılan değerlerine ayarlayın.

Diseksiyon kapsamının aşaması için, düz beyaz bir arka plan kullanın ve sahne üstü bir ışık kaynağı, tercihen iki esnek LED ışık kullanın. Şimdi, tamamlanmış bir migrasyon tahlil membran slaytını sahneye yerleştirin. Yazılım tarafından görüntülenen gerçek zamanlı görüntüye bakarak, büyütmeyi, tek bir zarın kenarları kameranın görüş alanı içinde olacak şekilde manuel olarak ayarlayın.

Ardından, ideal görüntüyü mümkün olduğunca yakın bir şekilde yeniden üretmek için ışık kaynağı konumlarını ve pozlama sürelerini ayarlayın. Minimum arka plan rengine ve eşit şekilde aydınlatılmış bir zara sahiptir. Hücre sayımının doğruluğu, yüksek kaliteli görüntü elde edilmesine bağlıdır.

Bu nedenle, eklentilerin en verimli şekilde kullanılması için kullanıcının kamerası tarafından elde edilebilecek en iyi görüntüyü yakalamak önemlidir. Şimdi, slaydı çıkarın ve kalibrasyonu tamamlamak için mikroskop yazılımındaki görüntüyü beyaz dengesi yapın. Görüntülemeden hemen önce, mümkün olduğunca çok sayıda sıkışmış kabarcığı çıkarmak için kapak kızağına basınç uygulayarak her bir zarı düzleştirin.

Şimdi, yazılımın içinde, yakalama klasörü konumunu ayarlayın. Ardından, her bir görüntünün sayısında artımlı artışlarla örnek 001'in adlandırma kuralını kullanarak görüntü dosyalarını TIF olarak kaydederek zar başına bir görüntü yakalayın. Bu adlandırma kuralı, eklentinin dosyaları bulması için gereklidir.

Düz alan düzeltmesi isteniyorsa, her slayt için boş bir alan bulun ve boş bir görüntü çekin. Dosyayı örnek adı boş olarak kaydedin. Ardından, ImageJ'de TC eklentisini açın.

TC içinde, Düz Alan düğmesine tıklayın ve Dizin Seç iletişim kutusundan membran görüntülerinin kaydedildiği klasörü seçin. Şimdi, bir migrasyon tahlili membran görüntüsü açın ve Renk Eşiği'ni seçin. Pencerede, yöntemi Shanbhag olarak ayarlayın.

Eşik rengini beyaz olarak ayarlayın. Renk uzayını RGB olarak ayarlayın ve koyu arka plan seçeneğinin işaretini kaldırın. Ardından, görüntüyü tamamen beyaz yapmak için üst kaydırıcıları sıfıra ve alt kaydırıcıları 255'e ayarlayın.

Beyaz olduktan sonra, yeşil ve kırmızı kaydırıcıları yalnızca çekirdekler görünene kadar ayarlayın. TC eklentisinde, RGB kaydırıcılarının değerlerini ilgili yapılandırma ayarları RGB eşiği metin kutularına kopyalayın. Ardından, Ekle/Değiştir düğmesine tıklayın ve yapılandırmanın üzerine yazın.

Yapılandırma ayarları panelinde, ayarları sabit sürücüye yazmak için Kaydet'e tıklayın. Şimdi, TC eklentisi ile görüntüleri saymak için Klasörü Say'a tıklayın ve sayılacak klasörü seçin. Program daha sonra görüntüleri işleyecek ve verileri otomatik olarak ana tabloya ekleyecektir.

Şimdi, ana tabloda, Kalibrasyonda bir onay işareti olacak mı? Görüntüdeki sütun, ideal metriklere benzerliğine bağlı olarak kalibrasyon için işaretlenir. Kalibrasyon için işaretlenen tüm örnekleri seçin.

Ardından, sağ tıklayın ve Yeniden Sayım ve Önerilen Boyut'u seçin. Bu, önerilen minimum parçacık alanına sahip görüntüleri anlatacaktır. Ardından, tekrar sağ tıklayın ve Grafiği Göster'i seçin.

İdeal bir görüntü, uzun sağ kuyruklu normal dağılıma benzeyen bir grafiğe sahip olacaktır. Gerekirse, örneği seçip sağ tıklayıp Yeniden Sayım ve Manuel Ayarlar'ı seçerek daha düşük boyut aralığını veya RGB eşiği ayarlarını ayarlayın. Ardından, istediğiniz ayarları girin ve görüntüyü yeniden anlatmak için Sayı'ya tıklayın.

Sayıları manuel olarak ayarlamak için örnekleri seçin, tabloya sağ tıklayın ve Sayımlarla görüntüyü aç'ı seçin. Orijinal görüntü, eklenti tarafından sayılan her parçacığı temsil eden kırmızı işaretlerle açılacaktır. Ek olarak, Sayılan ikili görüntüyü göster seçeneği, tek tek hücrelerin renk eşiği tarafından ne kadar iyi çözümlendiğini kontrol etmek için kullanılabilir.

Manuel olarak bir sayı eklemek için kontrol tuşunu basılı tutun ve sol tıklayın. Bu, imleç konumuna toplam sayıya eklenen bir işaretçi ekleyecektir. Bir işaretçiyi manuel olarak kaldırmak için, görüntüye sağ tıklayın ve eklenti, imlece en yakın işaretçiyi kaldıracaktır.

Bir işaretçi grubunu kaldırmak için, ilgilendiğiniz bir bölge seçin ve kontrol tuşunu basılı tutarken bölgeye sağ tıklayın. Hücre konsantrasyonu hesaplayıcısının işlemi, p-kare kalibrasyon görüntüsüne ve p-kare uzunluğu ve piksellerinin hesaplanmasına bağlıdır. Bir hemositometrenin p-karesi 100 nanolitre hacme sahiptir ve bu sabit verildiğinde, pikselleri milimetreye dönüştürdükten sonra toplam görüntü hacmi hesaplanabilir.

Çeşitli deneylerden ve hücre tiplerinden elde edilen 57 görüntü üzerinden manuel ve otomatik sayımların karşılaştırılması, her iki yöntem arasında çok sıkı bir korelasyon olduğunu göstermektedir. Mililitre başına beş milyon ila 2.000 hücre arasındaki konsantrasyonlar, otomatik işlem kullanılarak doğru bir şekilde sayıldı. Metrik Q, farklı parçacık boyutlarının dağılımına dayalı olarak genel görüntü netliğini temsil eder.

Yeterli bir Q 0,5'ten büyüktür. Bu niteleyicileri parlaklık ve arka plan gürültüsü açısından mütevazı ila mükemmel görüntülerden oluşan bir seçkiye uyguladığımızda, kalibre edilmiş görüntü sayımları, kalibre edilmemiş görüntü sayımlarına göre manuel sayımlara önemli ölçüde daha yakındı. Bu videoyu izledikten sonra, CCC ve TC ImageJ eklentilerini kullanarak süspansiyondaki hücrelerin ve hücre motilite testlerinden hücrelerin nasıl doğru ve verimli bir şekilde sayılacağını iyi anlamış olmalısınız.

TC eklentisine hakim olduktan sonra, hücre sayımlarının elde edilmesi, ölçülmesi ve ayarlanması bir saatten kısa sürede yapılabilir. Her iki eklenti de ImageJ'nin parçacık sayma özelliğine dayanır ve ImageJ tarafından kullanılan makrolar düzenlenerek değiştirilebilir. Bu, kullanıcının eklentilerin kapsamını diğer parçacıklara genişletmesi için daha fazla esneklik sunar.