ImageJ Eklentileri Kullanma Hücre Sayım Usul Otomatik Niceleme ve Analizi

Bu protokolün genel amacı, süspansiyondaki hücrelerin veya bir invazyon deneyi membranındaki migrasyonun hızlı ve doğru sayımlarını yapmak için dijital analiz araçlarını kullanmaktır. Bu protokol, araştırmacıların yaygın teknikler ve in vitro hücre hareketliliği deneyleri için gerekli olan hücre sayısını belirlemesine yardımcı olabilir. Bu yöntemin temel avantajı, birden fazla filtre ve analiz aracı sunarken hızlı ve doğru hücre sayımları sağlamasıdır.

Başlamak için mikroskop aydınlatmasını maksimuma ayarlayın. 4x objektife geçin ve faz kontrast filtrelerinin kullanımda olduğundan emin olun. Ardından, mikroskop yazılımı üzerinden görüntü yakalama ayarlarını varsayılan değerlerine getirin.

Şimdi standart bir hemositometreyi mikroskop tablasına yerleştirin ve görüntü hacim kalibrasyonu adımı için bir görüntü yakalayın. Pozlama süresini gerektiği gibi ayarlayın. ImageJ'de, hücre konsantrasyonu hesaplayıcı altında görüntüyü açın ve Get Image Dimension düğmesine tıklayın.

Bu işlem, görüntü genişliği ve yüksekliği metin kutularını pikseller cinsinden görüntü çözünürlüğü ile doldurur. Ardından, düz çizgi aracını seçin ve imleci tıklayıp sürükleyerek hemositometrenin birincil p-karesinin tüm uzunluğu boyunca düz bir çizgi çizin. Daha sonra, sonuçlar penceresini görüntülemek için M tuşuna basın.

Şimdi, uzunluk sütunundaki değeri hücre konsantrasyonu hesaplayıcısındaki p-kare uzunluğu metin kutusuna yazın. Ardından, görüntü hacmini görüntü hacmi metin kutusuna aktarmak için Görüntü Hacmini Hesapla düğmesine tıklayın. Son olarak, eklentinin kalibrasyonunu tamamlamak için Kaydet düğmesine tıklayın.

Numune analizi için, bir hemositometre lamının her iki haznesine de 10 µL hücre yükleyin ve hücrenin kutupları yerine merkezi kesitine odaklanmak için hücre içini hücre membranından daha koyu görünecek şekilde odaklayın. Ardından, hücrelerin aşırı pozlanmadığından emin olmak için pozlama süresini yeniden ayarlayın. Hemositometre çizgilerinin hafifçe görünür olması kabul edilebilir.

Şimdi, hemositometrenin merkezi bölgesinin birbirinin üzerine binmeyen beş ila on görüntüsünü yakalayın. Her bir görüntünün çözünürlüğü ve büyütmesi, hacim kalibrasyon görüntüsü ile aynı olmalıdır. Ardından, hücre konsantrasyonu hesaplayıcısında, Hücreleri Say'a tıklayın ve açılan pencerede sayılacak klasörü seçin.

Ardından, örnek sayısı giriş kutusuna her bölme için alınan görüntü sayısını girin ve Tamam'a tıklayın. Eklenti şimdi verileri toplayacaktır. Daha fazla ayrıntı için metne bakın. Başlamak için, mikroskop yazılımı içinde görüntü yakalama ayarlarını varsayılan değerlerine getirin.

Diseksiyon mikroskobunun tablası için düz beyaz bir arka plan ve tabla üstü bir ışık kaynağı, tercihen iki adet esnek LED ışık kullanın. Şimdi, tamamlanmış bir migrasyon deneyi membran lamını tablanın üzerine yerleştirin. Yazılım tarafından görüntülenen gerçek zamanlı görüntüye bakarak, tek bir membranın kenarları kamera görüş alanının hemen içinde kalacak şekilde büyütmeyi manuel olarak ayarlayın.

Ardından, arka plan renginin minimum olduğu ve membranın homojen şekilde aydınlatıldığı ideal görüntüyü mümkün olduğunca yakından yeniden oluşturmak için ışık kaynağı konumlarını ve pozlama sürelerini ayarlayın. Hücre sayımının doğruluğu, yüksek kaliteli görüntü elde edilmesine bağlıdır.

Bu nedenle, eklentilerin en verimli şekilde kullanılabilmesi için kullanıcının kamerasının elde edebileceği en iyi görüntünün yakalanması önemlidir. Şimdi, kalibrasyonu tamamlamak için lamı çıkarın ve mikroskop yazılımında görüntünün beyaz dengesini ayarlayın. Görüntüleme işleminden hemen önce, hapsolmuş baloncukların mümkün olduğunca fazlasını gidermek için lamel üzerine basınç uygulayarak her bir membranı düzleştirin.

Şimdi, yazılım içerisinde görüntü yakalama klasörünün konumunu ayarlayın. Ardından, her membran için bir görüntü yakalayın ve görüntü dosyalarını, her görüntü için sayıların artımlı olarak ilerlediği "örnek 001" isimlendirme kuralını kullanarak TIF formatında kaydedin. Eklentinin dosyaları bulabilmesi için bu isimlendirme kuralı gereklidir.

Düz alan düzeltmesi (flatfield correction) isteniyorsa, her lam için boş bir alan bulun ve boş bir görüntü alın. Dosyayı "örnek adı blank" şeklinde kaydedin. Ardından, ImageJ'de TC eklentisini açın.

TC içerisinde Flatfield düğmesine tıklayın ve Dizin Seçme iletişim kutusundan membran görüntülerinin kaydedildiği klasörü seçin. Şimdi, bir migrasyon deneyi membran görüntüsü açın ve Color Threshold seçeneğini belirleyin. Pencerede, yöntemi Shanbhag olarak ayarlayın.

Eşik rengini beyaz olarak ayarlayın. Renk uzayını RGB olarak belirleyin ve koyu arka plan seçeneğinin işaretini kaldırın. Ardından, görüntünün tamamen beyaz olması için üst sürgüleri sıfıra, alt sürgüleri ise 255'e ayarlayın.

Beyazlaştıktan sonra, yalnızca çekirdekler görünene kadar yeşil ve kırmızı sürgüleri ayarlayın. TC eklentisinde, RGB sürgü değerlerini ilgili konfigürasyon ayarlarındaki RGB eşik metin kutularına kopyalayın. Ardından, Ekle/Değiştir düğmesine tıklayın ve konfigürasyonun üzerine yazın.

Yapılandırma ayarları panelinde, ayarları sabit sürücüye kaydetmek için Kaydet'e tıklayın. Şimdi, görüntüleri TC eklentisi ile saymak için Klasörü Say'a tıklayın ve sayılacak klasörü seçin. Program daha sonra görüntüleri işleyecek ve verileri otomatik olarak ana tabloya ekleyecektir.

Şimdi, ana tabloda, görüntü ideal metriklere olan benzerliğine göre kalibrasyon için işaretlenmişse Calibrate? sütununda bir onay işareti yer alacaktır. Kalibrasyon için işaretlenmiş tüm örnekleri seçin.

Ardından, sağ tıklayın ve Recount and Suggested Size seçeneğini belirleyin. Bu işlem, görüntüleri önerilen minimum partikül alanı ile yeniden sayacaktır. Daha sonra, tekrar sağ tıklayın ve Show Plot seçeneğini belirleyin.

İdeal bir görüntü, uzun bir sağ kuyruklu normal dağılıma benzeyen bir grafiğe sahip olacaktır. Gerektiğinde, örneği seçip sağ tıklayarak "Recount and Manual Settings" seçeneğini belirleyin ve alt boyut aralığını veya RGB eşik ayarlarını düzenleyin. Ardından, istenen ayarları girin ve görüntüyü yeniden saydırmak için "Count" düğmesine tıklayın.

Sayımları manuel olarak ayarlamak için örnekleri seçin, tabloya sağ tıklayın ve Sayımlarla birlikte görüntüyü aç seçeneğini belirleyin. Eklenti tarafından sayılan her bir parçacığı temsil eden kırmızı işaretlerle birlikte orijinal görüntü açılacaktır. Ayrıca, bireysel hücrelerin renk eşikleme ile ne kadar iyi çözümlendiğini kontrol etmek için Sayılan ikili görüntüyü göster seçeneği kullanılabilir.

Manuel olarak bir sayım eklemek için kontrol tuşuna basılı tutun ve sol tıklayın. Bu işlem, imleç konumuna toplam sayıma eklenecek bir işaretleyici ekleyecektir. Manuel olarak bir işaretleyiciyi kaldırmak için görüntüye sağ tıklayın; eklenti imlece en yakın olan işaretleyiciyi kaldıracaktır.

Bir grup belirteci kaldırmak için, kontrol tuşuna basılı tutarken bir ilgi alanı seçin ve bu bölgeye sağ tıklayın. Hücre konsantrasyon hesaplayıcısının işleyişi, p-kare kalibrasyon görüntüsüne ve p-kare uzunluğu ile piksellerin hesaplanmasına bağlıdır. Bir hemositometrenin p-karesi 100 nanolitrelik bir hacme sahiptir ve bu sabit değerle, pikseller milimetreye dönüştürüldükten sonra toplam görüntü hacmi hesaplanabilir.

Çeşitli deneylerden ve hücre tiplerinden alınan 57 görüntü üzerinden yapılan manuel ve otomatik sayımların karşılaştırması, her iki yöntem arasında oldukça güçlü bir korelasyon olduğunu göstermektedir. Mililitrede beş milyon ile 2.000 hücre arasındaki konsantrasyonlar, otomatik işlem kullanılarak doğru bir şekilde sayılmıştır. Q metriği, belirgin partikül boyutlarının dağılımına dayalı olarak görüntülerin genel netliğini temsil eder.

Yeterli bir Q değeri 0,5'ten büyüktür. Bu nitelikler; parlaklık ve arka plan gürültüsü açısından orta düzeyden mükemmele kadar değişen bir dizi görüntüye uygulandığında, kalibre edilmiş görüntü sayımlarının manuel sayımlara, kalibre edilmemiş görüntü sayımlarına kıyasla anlamlı derecede daha yakın olduğu görülmüştür. Bu videoyu izledikten sonra, CCC ve TC ImageJ eklentilerini kullanarak süspansiyondaki hücreleri ve hücre hareketliliği analizlerindeki hücreleri nasıl doğru ve verimli bir şekilde sayacağınız konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

TC eklentisine hakim olunduğunda; hücre sayımlarının elde edilmesi, nicellenmesi ve ayarlanması bir saatten kısa sürede gerçekleştirilebilir. Her iki eklenti de ImageJ'in parçacık sayma özelliğine dayanır ve ImageJ tarafından kullanılan makrolar düzenlenerek modifiye edilebilir. Bu durum, kullanıcının eklentilerin kapsamını diğer parçacıklara genişletmesi için daha fazla esneklik sunar.