Name: ImageJ Eklentileri Kullanma Hücre Sayım Usul Otomatik Niceleme ve Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Öğrenin, ImageJ eklentileriyle hücre sayımı ve migrasyon analizi yapmayı. Hızlı ve doğru sonuçlar elde ederek in vitro hücre hareketliliği çalışmalarınızı kolaylaştırın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüsü tarafından CP'ye (OR 142730 ve OR 89931) desteklenmiştir. Jelena Brkic'e ImageJ'deki ikili parçacık analizi hakkındaki ilk fikri için teşekkür ederiz.

<ol><li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+and+Determining+the+Viability+of+Cultured+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Counting and Determining the Viability of Cultured Cells.</a> J. Vis. Exp. (16), e752(2008).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells</a> (2016).</li>
<li>Graham, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coulter+principle%3A+foundation+of+an+industry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Autom%22%5BJournal%5D)">The coulter principle: foundation of an industry.</a> J. Lab. Autom. 8 (6), 72-81 (2003).</li>
<li>Ormerod, M. G., Imrie, P. R. Flow cytometry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOrmerod%2C+MG+%22Animal+Cell+Culture%22">Animal Cell Culture</a>. Walker, J. M., Pollard, J. W. , Humana Press. 543-558 (1990).</li>
<li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Imaging+Software+Tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Biological Imaging Software Tools.</a> Nat. Methods. 9 (7), 697-710 (2013).</li>
<li>Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using Trypan blue: manual and automated methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLouis%2C+KS+%22Mammalian+Cell+Viability%3A+Methods+and+Protocols%22">Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols</a>. Stoddart, J. M. , Humana Press. 7-12 (2011).</li>
<li>Scott, W. N. Invasion and motility assays. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aScott%2C+WN+%22Cancer+Cell+Culture%3A+Methods+and+Protocols%22">Cancer Cell Culture: Methods and Protocols</a>. Langdon, S. P. , Humana Press. 225-229 (2004).</li>
<li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Cell+Migration+and+Invasion+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro Cell Migration and Invasion Assays.</a> J. Vis. Exp. (88), e51046(2014).</li>
<li>Luo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-378a-5p+promotes+trophoblast+cell+survival%2C+migration+and+invasion+by+targeting+Nodal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-378a-5p promotes trophoblast cell survival, migration and invasion by targeting Nodal.</a> J. Cell Sci. 125, 3124-3132 (2012).</li>
<li>Adorno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mutant-p53%2FSmad+Complex+Opposes+p63+to+Empower+TGFbeta-Induced+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Mutant-p53/Smad Complex Opposes p63 to Empower TGFbeta-Induced Metastasis.</a> Cell. 137, 87-98 (2009).</li>
<li>Chung, T. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+microRNA-204+mediates+migration+and+invasion+of+endometrial+cancer+by+regulating+FOXC1%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of microRNA-204 mediates migration and invasion of endometrial cancer by regulating FOXC1.</a> Int. J. Cancer. 130, 1036-1045 (2012).</li>
<li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.%2FRev.+Mutat%22%5BJournal%5D)">et al. In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutat. Res./Rev. Mutat. 752, 10-24 (2013).</li>
<li>Al-Khazraji, B. K., Medeiros, P. J., Novielli, N. M., Jackson, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+cell-counting+algorithm+for+fluorescently-stained+cells+in+migration+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Proced.+Online%22%5BJournal%5D)">An automated cell-counting algorithm for fluorescently-stained cells in migration assays.</a> Biol. Proced. Online. 13, 1-6 (2011).</li>
<li>Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> (2007).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+Intern%22%5BJournal%5D)">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics Intern. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Grishagin, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+cell+counting+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Automatic cell counting with ImageJ.</a> Anal. Biochem. 473, 63-65 (2015).</li>
<li>Thomas, C. R., Paul, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+image+analysis+in+cell+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Applications of image analysis in cell technology.</a> Curr. Opin. Biotech. 7 (1), 35-45 (1996).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appreciating+data%3A+warts%2C+wrinkles+and+all%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Appreciating data: warts, wrinkles and all.</a> Nat. Cell Biol. 8, 203(2006).</li>
<li>Rossner, M., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What%27s+in+a+picture%3F+The+temptation+of+image+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">What's in a picture? The temptation of image manipulation.</a> J. Cell Biol. 166, 11-15 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Count+objects+in+an+image+in+Adobe+Photoshop%5BTitle%5D)+AND+%22Helpx.adobe.com%22%5BJournal%5D)">Count objects in an image in Adobe Photoshop.</a> Helpx.adobe.com. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://helpx.adobe.com/photoshop/using/counting-objects-image.html">https://helpx.adobe.com/photoshop/using/counting-objects-image.html</a> (2016).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Kritik Adımlar, sorun giderme ve Sınırlamalar Otomatik hesaplama yöntemleri doğası, parçacık analizi, özellikle bu, bu parçacıkları tanımlamak için matematiksel yetenek gerektirir. Sonuç olarak, Hücre Konsantrasyon Hesaplama ve göç tahlil sayacı hem doğruluğu yakalanan görüntü hücresi örnek veya göç tahlil zarı benzer ne kadar yakından, yani resim netliği üzerinde majorly bağlıdır. Bu nedenle mümkün olduğunca en iyi olarak mikroskop ve ilgili yazılım kalibrasyon protokollerini takip etmek geliş...

In vitro hücre sayımı olarak doku kültürü deneyleri, geniş bir aralık içinde bir önemli temel bir tekniktir. Doğru bir kültürde hücre sayısının belirlenmesi deney tekrarlanabilirlik ve standardizasyon 1,2 için gereklidir. Hücre sayımı bir hemasitometre kullanarak yanı sıra otomatik çeşitli yöntemler, kendi avantajları ve dezavantajları 3,4,5 her kullanılarak elle yapılabilir. hücre sayımı için otomatik yöntemlerin çoğu iki sınıfa Coulter prensibini kullanın veya akım sitometri olanların birine ait. Coulter sayaçlar hücre sayısını ve boyutunu belirlemek için hücreler elektriksel direnç yararlanmak. Onlar akış sitometrelerinde daha hızlı, doğru ve ucuzdur. Ancak, nadiren manuel sayım 3 ile karşılaştırıldığında nedeniyle önemli ölçüde eksiksiz tek hücre sayımı için kullanılır. Öte yandan, sitometre akış pahalıdır fakat, hücre sayımı, hücreler şekil, st analizi maddesi olarakkezlerinin ve ölçüm dahili hücre 4,5 işaretleme kalemler. Bu iki ilke birini kullanın makineler birçok üretici edinilebilir. Otomatik yöntemler elle sayım için gerekli zamanın bir kısmı ile geliyor ama pahalı makineler 6 kullanırken manuel sayım uygun fiyatlı ama zaman alıcı ve önyargı tabidir. Diğer yaygın hücre kültür işlemleri in vitro hücre motilite deneyleri, yani, hücre göçü ve yayılması 7 bulunmaktadır. Yer değiştirmesine ve istilasma deneyler genellikle bir kemotaktik yanıtı yanıt olarak, hücre motilitesinin ve invazyon araştırmak için kullanılır. Buna ek olarak, yaygın olarak birden fazla hücre tipleri 7-11 embriyonik gelişimi, farklılaşma, enflamatuvar yanıtı ve metastazı çalışma için kullanılır. Bir göç testinin gözenekli zarından göç veya işgal Hücreler iki farklı şekilde belirlenebilir. İlk olarak, bir floresan boya ile boyanması, ayrışma ile sağa solaBir floresan okuyucu 12 kullanılarak membran ve miktarının m. Miktar, bu yöntemin bir sınırlaması bir kayıt membran muhafaza edilebilir ve daha fazla analiz 13 imkanı olmasıdır. Taşınan ikinci ölçümü yöntemi / sabit ve kristal viyole, toluidin mavisi veya hematoksilen olarak sitolojik boyalar ile daha sık floresan boya veya, ile boyanmış hücrelerin işgal edildi; Daha sonra hücreler elle çok zaman alan bir görev 12,13 olan bu membranların ters mikroskopik görüntüleri kullanılarak ölçülür. kılavuzu hücre sayımı dezavantajlarını aşmak için, hücre konsantrasyonu ve göç deneyi için iki güvenilir ve doğru otomatik hücre sayaçları geliştirilmiştir. Bunlar otomatik hücre sayıcı algoritmaları Oracle&#39;ın Java bilgisayar dili kullanarak bir eklenti olarak ImageJ için geliştirilmiştir. ImageJ Hea Ulusal Enstitüsü tarafından geliştirilen bir kamu ve yaygın kullanılan görüntü işleme aracıdırinci (NIH) 14,15; böylece, ImageJ için bu eklentileri yazma biyolojik topluluk içine kolay entegrasyon kolaylaştırır. hücre sayımı otomasyonu elle sayım kıyasla yüksek üretim ve tekrarlanabilirlik sağlar. Diğer uygun yazılım ve eklentiler görüntü analizi 5,16,17, hücre konsantrasyonu Hesap eklenti aracılığıyla hücre konsantrasyonunu hesaplamak için kullanılabilir, ancak hızlı ve aynı zamanda hücre ve tedavi dilüsyonları işleyebilir. Ayrıca, bu iki sayaçları tüm sonuçlar ve hesaplamalar kaydedilir ve ihraç edilebilir. Bu yazıda anlatılan iki eklentileri diseksiyon kapsamı kullanımı yoluyla canlı hücre görüntüleme ve göç tahlil membranların için büyük görüş alanı (tüm membran yakalama) görüntüleme için bir faz kontrast mikroskop kullanımı için optimize edilmiştir. http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins: eklentileri yükleme talimatları indirmek için serbestçe kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>HyClone Klasik Sıvı Ortam: RPMI 1640 - L-Glutamin</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002702</td><td>Hücre kültürü ortamı ile&nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal bovian serum (FBS)</td><td>GIBCO BRL</td><td>P00015</td><td>Medya beslemesi</td></tr><tr><td>HTR8/SVneo trofoblast hücre hattı</td><td>Hücreler Dr. Charles Graham'dan (Kraliçe' s Üniversitesi, Kingston, Kanada)</td><td></td> <td>Yazılım, herhangi bir hücre hattıyla çalışacak şekilde tasarlanmıştır.</td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>GIBCO BRL</td><td>27250-018</td><td>10 &'da %0,20 (a/h) olarak hazırlanmış; M EDTA 1x PBS</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Yenilikçi Hücre Teknolojileri</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>10 cm hücre kültürü plakaları</td><td>SARSTEDT</td><td>833902</td><td>Doku kültürü ile tedavi edilmiş herhangi bir plaka uygun olacaktır</td></tr><tr><td>Transwell Polyester Membran Ekler - 8.0&nbsp; &mikro; m</td><td>Fisher Scientific 7200150'den sipariş edilen</td><td></td> m Gözenek boyutu Costar <td>3422 24 oyuklu plakalar için; Gözenek boyutu: 8.0 ve mikro; m; 6,5 mm çap; 0,33 cm2 büyüme alanı</td></tr><tr><td>HARLECO Hematoloji Boyaları ve Reaktifleri, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 & 3</td><td>EMD Millipore ve VWR</td><td>65044A, B, & C</td><td>Hemacolor leke seti, üç adet 500 ml (16,9 oz.) poli şişeden oluşur ve bir metanol fiksatif (Çözelti 1), bir eozin veya asit lekesi (Çözelti 2) ve bir metilen mavisi veya bazik leke (Çözelti 3) içerir</td></tr> <tr><td>Pamuk Uçlu Aplikatör</td><td>Puritan Medical</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Tek kenarlı endüstriyel tıraş bıçakları</td><td>VWR</td><td>55411 - 055</td><td>Kalınlık: 0,30 mm (0,012 inç)</td></tr><tr><td>Mikroskop Slaytları - Önceden Temizlenmiş/Düz</td><td>Fisher Scientific</td><td>12550A3</td><td>Boyutlar: 25 mm x 75 mm x 1.0 mm</td></tr><tr><td>Fisherbrand Kapak Camları - Dikdörtgenler no. 1</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545E</td><td>Kalınlık: 0,13 ila 0,17 mm; Boyut: 50 mm x 22 mm</td></tr><tr><td>Fisher Chemical Permount Montaj Ortamı</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Leica Stereo diseksiyon mikroskobu</td><td>Leica Microsystems Microsope</td><td></td><td>Leica mikroskop kamera Model MC170 HD ile donatılmıştır ve kamera yazılımı Leica App. Suite (LAS E2) Sürüm 3.1.1 [Yapı: 490]. Mikroskop parçaları:&nbsp; LED3000 Spot Işık Aydınlatma Modeli: MEB126, Leica M80 Optik Taşıyıcı Model M80, Objektif akromat 1.0X, WD = 90 &nbsp; mm Modeli: MOB306 ve Objektif akromat 0.32X, WD = 303 & nbsp; mm Model: MOB315, Video Objektif 0.5X Model: MTU-293</td></tr><tr><td>Hemasitometre</td><td>Asistanı Almanya&nbsp;</td><td></td><td>0.100 mm Derinlik - 0.0025 mm2</td></tr><tr><td>Olympus ters ışık mikroskobu</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX41SF</td><td>Microsope ile donatılmıştır Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapiksel CMOS Renkli Kamera ve kamera yazılımı Infinity analizidir Sürüm 6.5.2</td></tr><tr><td>Laminer akış kabini 1300 Serisi A2</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>Model: 1375</td><td>Hücre kültürü çalışması için herhangi bir laminer akış kabini uygun olacaktır&nbsp;</td></tr><tr><td>Hücre kültürü inkübatörü</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>Model: 370</td><td>Herhangi bir hücre kültürü inkübatörü uygun olacaktır - Hücreler nemli ortamda,% 5 CO2, 37 ° C altında kültürlendi; C&nbsp;</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>Sürüm 1.50e</td><td>Minimum sürüm gereken</td></tr><tr><td>Java Runtime Environment</td><td>Oracle</td><td>Sürüm 1.8.0_66</td><td>Minimum sürüm gerekli</td></tr></tbody></table>

imagej eklentileri kullanma hücre sayım usul otomatik niceleme ve analizi

Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

Sağlık ImageJ National Institute güçlü, serbestçe kullanılabilir görüntü işleme yazılımı paketidir. ImageJ çeşitli biyolojik partiküller saymak için etkili bir şekilde kullanılabilir kapsamlı parçacık analizi algoritmaları. hücre örneklerinin çok sayıda sayım yaparken, hemositometre zaman açısından bir darboğaz sunar. Aynı şekilde, ImageJ eklentisi Cell Counter ile göç / işgali deneyleri gelen zarları sayma doğru olsa da, bilek ağrılarına sebep için son derece emek yoğun sübjektif ve rezil. Bu ihtiyacı karşılamak için, biz otomatik hemasitometre (ya da bilinen hacim) ve göç / işgali hücre sayımı tek görev için ImageJ içinde iki eklentileri geliştirmiştir. Her iki eklentileri minimum arka plan ile yüksek kalitede mikrograflar elde etmek yeteneğine güveniyor. Bunlar, kullanımı kolay ve sayıları kalibrasyonunu yardımcı olmak için yerleşik analiz araçları ile geniş örneklem boyutları hızlı sayım ve analiz için optimize edilmiş. Çekirdek prensibini birleştirerekotomatik sayım algoritması ve sonrası sayma analizi ile Cell Counter s, bu büyük ölçüde göç deneyleri doğruluk kaybı olmaksızın işlenebilir kolaylığını artırır.

Hücre Konsantrasyon Hesaplama Şekil 1 CCC kalibrasyon ve sayılabilir görüntü alımı genel sürecini sunmaktadır. Şekil 1A ve 1B piksel P-kare uzunluğu P-kare kalibrasyon görüntü ve hesaplama betimliyor. CCC, aşağıdaki formül kullanılarak, belirli bir hacim içinde hücre konsantrasyonunu belirler: <img alt="denklem 1" src="/files/ftp_upload/54719/54719eq1....

Bu makale, iki yeni açık kaynaklı ImageJ eklentisi aracılığıyla hemositometre ve migrasyon/invazyon mikrograflarının miktar tayinini açıklamaktadır: Hücre Konsantrasyonu Hesaplayıcısı ve migrasyon tahlili Sayacı. Ayrıca, görüntü alma ve kalibrasyon protokollerini açıklar ve eklentilerin giriş gereksinimlerini ayrıntılı olarak tartışır.

ImageJ Eklentileri Kullanma Hücre Sayım Usul Otomatik Niceleme ve Analizi

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis ...

Bu protokolün genel amacı, süspansiyondaki hücrelerin veya bir invazyon deneyi membranındaki migrasyonun hızlı ve doğru sayımlarını yapmak için dijital analiz araçlarını kullanmaktır. Bu protokol, araştırmacıların yaygın teknikler ve in vitro hücre hareketliliği deneyleri için gerekli olan hücre sayısını belirlemesine yardımcı olabilir. Bu yöntemin temel avantajı, birden fazla filtre ve analiz aracı sunarken hızlı ve doğru hücre sayımları sağlamasıdır.Başlamak için mikroskop aydınlatmasını maksimuma ayarlayın. 4x objektife geçin ve faz kontrast filtrelerinin kullanımda olduğundan emin olun. Ardından, mikroskop yazılımı üzerinden görüntü yakalama ayarlarını varsayılan değerlerine getirin.Şimdi standart bir hemositometreyi mikroskop tablasına yerleştirin ve görüntü hacim kalibrasyonu adımı için bir görüntü yakalayın. Pozlama süresini gerektiği gibi ayarlayın. ImageJ'de, hücre konsantrasyonu hesaplayıcı altında görüntüyü açın ve Get Image Dimension düğmesine tıklayın.Bu işlem, görüntü genişliği ve yüksekliği metin kutularını pikseller cinsinden görüntü çözünürlüğü ile doldurur. Ardından, düz çizgi aracını seçin ve imleci tıklayıp sürükleyerek hemositometrenin birincil p-karesinin tüm uzunluğu boyunca düz bir çizgi çizin. Daha sonra, sonuçlar penceresini görüntülemek için M tuşuna basın.Şimdi, uzunluk sütunundaki değeri hücre konsantrasyonu hesaplayıcısındaki p-kare uzunluğu metin kutusuna yazın. Ardından, görüntü hacmini görüntü hacmi metin kutusuna aktarmak için Görüntü Hacmini Hesapla düğmesine tıklayın. Son olarak, eklentinin kalibrasyonunu tamamlamak için Kaydet düğmesine tıklayın.Numune analizi için, bir hemositometre lamının her iki haznesine de 10 µL hücre yükleyin ve hücrenin kutupları yerine merkezi kesitine odaklanmak için hücre içini hücre membranından daha koyu görünecek şekilde odaklayın. Ardından, hücrelerin aşırı pozlanmadığından emin olmak için pozlama süresini yeniden ayarlayın. Hemositometre çizgilerinin hafifçe görünür olması kabul edilebilir.Şimdi, hemositometrenin merkezi bölgesinin birbirinin üzerine binmeyen beş ila on görüntüsünü yakalayın. Her bir görüntünün çözünürlüğü ve büyütmesi, hacim kalibrasyon görüntüsü ile aynı olmalıdır. Ardından, hücre konsantrasyonu hesaplayıcısında, Hücreleri Say'a tıklayın ve açılan pencerede sayılacak klasörü seçin.Ardından, örnek sayısı giriş kutusuna her bölme için alınan görüntü sayısını girin ve Tamam'a tıklayın. Eklenti şimdi verileri toplayacaktır. Daha fazla ayrıntı için metne bakın. Başlamak için, mikroskop yazılımı içinde görüntü yakalama ayarlarını varsayılan değerlerine getirin.Diseksiyon mikroskobunun tablası için düz beyaz bir arka plan ve tabla üstü bir ışık kaynağı, tercihen iki adet esnek LED ışık kullanın. Şimdi, tamamlanmış bir migrasyon deneyi membran lamını tablanın üzerine yerleştirin. Yazılım tarafından görüntülenen gerçek zamanlı görüntüye bakarak, tek bir membranın kenarları kamera görüş alanının hemen içinde kalacak şekilde büyütmeyi manuel olarak ayarlayın.Ardından, arka plan renginin minimum olduğu ve membranın homojen şekilde aydınlatıldığı ideal görüntüyü mümkün olduğunca yakından yeniden oluşturmak için ışık kaynağı konumlarını ve pozlama sürelerini ayarlayın. Hücre sayımının doğruluğu, yüksek kaliteli görüntü elde edilmesine bağlıdır.Bu nedenle, eklentilerin en verimli şekilde kullanılabilmesi için kullanıcının kamerasının elde edebileceği en iyi görüntünün yakalanması önemlidir. Şimdi, kalibrasyonu tamamlamak için lamı çıkarın ve mikroskop yazılımında görüntünün beyaz dengesini ayarlayın. Görüntüleme işleminden hemen önce, hapsolmuş baloncukların mümkün olduğunca fazlasını gidermek için lamel üzerine basınç uygulayarak her bir membranı düzleştirin.Şimdi, yazılım içerisinde görüntü yakalama klasörünün konumunu ayarlayın. Ardından, her membran için bir görüntü yakalayın ve görüntü dosyalarını, her görüntü için sayıların artımlı olarak ilerlediği "örnek 001" isimlendirme kuralını kullanarak TIF formatında kaydedin. Eklentinin dosyaları bulabilmesi için bu isimlendirme kuralı gereklidir.Düz alan düzeltmesi (flatfield correction) isteniyorsa, her lam için boş bir alan bulun ve boş bir görüntü alın. Dosyayı "örnek adı blank" şeklinde kaydedin. Ardından, ImageJ'de TC eklentisini açın.TC içerisinde Flatfield düğmesine tıklayın ve Dizin Seçme iletişim kutusundan membran görüntülerinin kaydedildiği klasörü seçin. Şimdi, bir migrasyon deneyi membran görüntüsü açın ve Color Threshold seçeneğini belirleyin. Pencerede, yöntemi Shanbhag olarak ayarlayın.Eşik rengini beyaz olarak ayarlayın. Renk uzayını RGB olarak belirleyin ve koyu arka plan seçeneğinin işaretini kaldırın. Ardından, görüntünün tamamen beyaz olması için üst sürgüleri sıfıra, alt sürgüleri ise 255'e ayarlayın.Beyazlaştıktan sonra, yalnızca çekirdekler görünene kadar yeşil ve kırmızı sürgüleri ayarlayın. TC eklentisinde, RGB sürgü değerlerini ilgili konfigürasyon ayarlarındaki RGB eşik metin kutularına kopyalayın. Ardından, Ekle/Değiştir düğmesine tıklayın ve konfigürasyonun üzerine yazın.Yapılandırma ayarları panelinde, ayarları sabit sürücüye kaydetmek için Kaydet'e tıklayın. Şimdi, görüntüleri TC eklentisi ile saymak için Klasörü Say'a tıklayın ve sayılacak klasörü seçin. Program daha sonra görüntüleri işleyecek ve verileri otomatik olarak ana tabloya ekleyecektir.Şimdi, ana tabloda, görüntü ideal metriklere olan benzerliğine göre kalibrasyon için işaretlenmişse Calibrate? sütununda bir onay işareti yer alacaktır. Kalibrasyon için işaretlenmiş tüm örnekleri seçin.Ardından, sağ tıklayın ve Recount and Suggested Size seçeneğini belirleyin. Bu işlem, görüntüleri önerilen minimum partikül alanı ile yeniden sayacaktır. Daha sonra, tekrar sağ tıklayın ve Show Plot seçeneğini belirleyin.İdeal bir görüntü, uzun bir sağ kuyruklu normal dağılıma benzeyen bir grafiğe sahip olacaktır. Gerektiğinde, örneği seçip sağ tıklayarak "Recount and Manual Settings" seçeneğini belirleyin ve alt boyut aralığını veya RGB eşik ayarlarını düzenleyin. Ardından, istenen ayarları girin ve görüntüyü yeniden saydırmak için "Count" düğmesine tıklayın.Sayımları manuel olarak ayarlamak için örnekleri seçin, tabloya sağ tıklayın ve Sayımlarla birlikte görüntüyü aç seçeneğini belirleyin. Eklenti tarafından sayılan her bir parçacığı temsil eden kırmızı işaretlerle birlikte orijinal görüntü açılacaktır. Ayrıca, bireysel hücrelerin renk eşikleme ile ne kadar iyi çözümlendiğini kontrol etmek için Sayılan ikili görüntüyü göster seçeneği kullanılabilir.Manuel olarak bir sayım eklemek için kontrol tuşuna basılı tutun ve sol tıklayın. Bu işlem, imleç konumuna toplam sayıma eklenecek bir işaretleyici ekleyecektir. Manuel olarak bir işaretleyiciyi kaldırmak için görüntüye sağ tıklayın; eklenti imlece en yakın olan işaretleyiciyi kaldıracaktır.Bir grup belirteci kaldırmak için, kontrol tuşuna basılı tutarken bir ilgi alanı seçin ve bu bölgeye sağ tıklayın. Hücre konsantrasyon hesaplayıcısının işleyişi, p-kare kalibrasyon görüntüsüne ve p-kare uzunluğu ile piksellerin hesaplanmasına bağlıdır. Bir hemositometrenin p-karesi 100 nanolitrelik bir hacme sahiptir ve bu sabit değerle, pikseller milimetreye dönüştürüldükten sonra toplam görüntü hacmi hesaplanabilir.Çeşitli deneylerden ve hücre tiplerinden alınan 57 görüntü üzerinden yapılan manuel ve otomatik sayımların karşılaştırması, her iki yöntem arasında oldukça güçlü bir korelasyon olduğunu göstermektedir. Mililitrede beş milyon ile 2.000 hücre arasındaki konsantrasyonlar, otomatik işlem kullanılarak doğru bir şekilde sayılmıştır. Q metriği, belirgin partikül boyutlarının dağılımına dayalı olarak görüntülerin genel netliğini temsil eder.Yeterli bir Q değeri 0,5'ten büyüktür. Bu nitelikler; parlaklık ve arka plan gürültüsü açısından orta düzeyden mükemmele kadar değişen bir dizi görüntüye uygulandığında, kalibre edilmiş görüntü sayımlarının manuel sayımlara, kalibre edilmemiş görüntü sayımlarına kıyasla anlamlı derecede daha yakın olduğu görülmüştür. Bu videoyu izledikten sonra, CCC ve TC ImageJ eklentilerini kullanarak süspansiyondaki hücreleri ve hücre hareketliliği analizlerindeki hücreleri nasıl doğru ve verimli bir şekilde sayacağınız konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.TC eklentisine hakim olunduğunda; hücre sayımlarının elde edilmesi, nicellenmesi ve ayarlanması bir saatten kısa sürede gerçekleştirilebilir. Her iki eklenti de ImageJ'in parçacık sayma özelliğine dayanır ve ImageJ tarafından kullanılan makrolar düzenlenerek modifiye edilebilir. Bu durum, kullanıcının eklentilerin kapsamını diğer parçacıklara genişletmesi için daha fazla esneklik sunar.

automated-quantification-analysis-cell-counting-procedures-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Hücresel mimarili normale Yapıştırıcı micropatterns, ilaç etkileri algılama duyarlılığını artırmak, tekrarlanabilirlik geliştirmek ve otomatik görüntü elde edilmesi ve analizi basitleştirmek için kullanılabilir. Bu teknoloji, geleneksel hücre kültürleri destekleyen üzerinde gerçekleştirilen ve dolayısıyla aşırı hücre-hücre değişkenlik muzdarip ilaç / siRNA tarama testleri, fayda sağlayacaktır.

İlaç Etkisi Micropatterned Hücreler Geliştirilmiş Görselleştirme ve Kantitatif Analiz

Biz invadopodia aracılı matriks yıkımı görselleştirmek için floresan jelatin kaplı mikroskop lamelleri üretmek için prototip yöntem açıklanmaktadır. Mevcut yazılımını kullanarak hesaplama teknikleri karışık bir popülasyon içindeki ve bütün mikroskobik alanı kapsayan çok hücreli grupları için tek hücreler ile matris proteolizin sonuç seviyeleri ölçülmesi için sunulmuştur.

Tek ve Çok hücreli Bağlamlarda Invadopodia aracılı Ekstrasellüler Matriks Proteoliz Kantitatif Ölçümü

Kaynak: Dodge, R., ve diğerleri. Drosophila mikrobiyomuna uygulanan 96 oyuklu plaka formatında hızlı koloni oluşturan birim sayımı. J. Vis. Uzm. (2023)Bu video, seri seyreltme ve kaplama yaklaşımı kullanılarak Drosophila sineklerinde bağırsakla ilişkili bakterilerin koloni oluşturan birimlerinin (CFU'lar) miktarının belirlenmesini göstermektedir. Bağırsak bakterileri içeren homojenize sinek örnekleri seri olarak seyreltilir, agar üzerine kaplanır ve koloni büyümesine izin vermek için inkübe...

Drosophila Sineklerinde Bağırsakla İlişkili Bakterilerin Koloni Oluşturan Birimlerinin Miktarının Belirlenmesi

Bu protokol, ilgilenilen belirli hücre tiplerini izole etmek için desthiobiotin, streptavidin ve APTES sisteminin özelleştirilebilir yüzey işlevselleştirmesini tanımlar. Ek olarak, bu makale bu sürecin uygulamalarını, optimizasyonunu ve doğrulanmasını kapsar.

Cam Yüzey fonksiyonlandırmalar aracılığıyla Hedefli Hücre İzolasyonu Bir Yöntem

Sosyal amip Dictyostelium discoideum, yakın zamanda protein yanlış katlanması ve proteostazı incelemek için bir sistem olarak kurulmuştur. Burada, D. discoideum'da sıcaklığa bağlı protein agregasyonunu ve hücresel stres tepkisini incelemek için yeni bir görüntüleme tabanlı metodoloji açıklıyoruz.

Protein Kalite Kontrol Sistemi incelenmesi<em&gt; D. diskodeyum</em&gt; Sıcaklık kontrollü Canlı Hücre Görüntüleme kullanarak

Bu el yazması görselleştirmek ve hücre altı bölmeleri olaylarda yerelleştirilmiş çeviri ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bu el yazması önerilen yaklaşım temel confocal görüntüleme sistemi ve Kimyasalları gerektirir ve hızlı ve düşük maliyetlidir.

Nicel ayirt ölçmek küresel çeviri lokalize

Makalede, 1) odak yapışıklıklarının büyüklüğü ve sayısı ile 2) hücre şekil indeksi ve MCF7 hücrelerinin eşzamanlı monolayers konfokal görüntülerinden dağılımının nicelikselleştirilmesi açıklanmaktadır.

MCF7 HücreLi Monokatmanlarda Hücre-Substrat Adezyon Alanı ve Hücre Şekli Dağılımlarının Ölçülmesi

Hücre sayımlarını tanımlamak için genelleştirilebilir alan tabanlı görüntü analizi yaklaşımını kullanan bir yöntem sunuyoruz. Farklı hücre popülasyonlarının analizi, uyarlanabilir bir algoritma içinde farklı hücre tipleri arasındaki önemli hücre yüksekliği ve yapı farklılıklarından yararlandı.

Makrofaj-fibroblast Kokültürlerinin Nicelleştirilmesi için Alan Tabanlı Görüntü Analiz Algoritması

Burada, nematod Caenorhabditis elegans'ta protein agregasyon kinetiğinin analizi için bir yöntem sunulmuştur. Yaş senkronize edilmiş bir popülasyondan gelen hayvanlar farklı zaman noktalarında görüntülenir, ardından CellProfiler'da yarı otomatik dahil etme sayımı ve AmyloFit'teki matematiksel bir modele uyar.

Caenorhabditis elegans'ta Otomatik Inklüzyon Sayımı Kullanarak Protein Agregasyon Kinetiğinin In Vivo'da İzlenmesi

Bu yöntem, koloni oluşturma birimlerine (CFU'lar) plaka oluşturmak için 96 kuyucuklu bir plaka formatı kullanarak mikrobiyal bolluğu ölçer ve tüm sinek homojenat numunelerinde Drosophila mikrobiyomuna uygulanır. CFU'lar, burada sağlanan otomatik bir görüntü analiz yazılımı ile sayılır.

Drosophila Mikrobiyomuna Uygulanan 96 Delikli Plaka Formatında Hızlı Koloni Oluşturma Birimi Sayımı

Bu makalede, bir dizi hücre yoğunluğunda doğrulanmış açık kaynaklı bir yürütülebilir program kullanarak görüntü tabanlı çekirdek nicelemeyi otomatikleştirmek için adım adım yöntemler açıklanmaktadır. Bu program, maliyetle ilgili engelleri, sınırlı teknolojik becerilere sahip kullanıcılar için erişilebilirliği ve mevcut teknolojilerin kullanımını sınırlayabilecek uygulamaya özel doğrulamayı ele alan bir alternatif sunar.

Çekirdek Miktarını Kolaylaştırmak için Bilgisayarla Görme Kitaplıklarını Kullanma

Öğrenin, ImageJ eklentileriyle hücre sayımı ve migrasyon analizi yapmayı. Hızlı ve doğru sonuçlar elde ederek in vitro hücre hareketliliği çalışmalarınızı kolaylaştırın.

ImageJ Eklentileri Kullanma Hücre Sayım Usul Otomatik Niceleme ve Analizi

Daha fazla video keşfet