Termo, İfade, saflaştırılması, ve İnsan serotonin Transporter Kristalizasyon Bound S -citalopram

Bu prosedürün genel amacı, yapısal çalışmalar için yeterince kararlı bir taşıyıcı oluşturmak ve bu modifiye taşıyıcıyı, x-ışını kristalografisi ile yüksek çözünürlüğe bozunan kristaller üretmek için kullanmaktır. Bu yöntem, önemli ilaç hedefleri olan zar proteinlerinin yapısının nasıl çözüleceği gibi yapısal biyoloji alanındaki temel sorulara cevap verebilir. Bu tekniğin temel avantajı, fonksiyonel bir tahlil kullanılarak ilaca bağlı bir konformasyondan seçim yapmak için kullanılabilmesidir.

Bu yöntem nörotransmitter taşıyıcıları hakkında bilgi sağlayabilse de, yüksek afiniteye sahip küçük molekülleri bağlayan reseptörlere, kanallara ve çözünür proteinlere de uygulanabilir. % 10 fetal sığır serumu ile takviye edilmiş DMEM'deki tripsonlanmış HEK293S GnTI eksi hücrelerini, tek kullanımlık bir pipet rezervuarında mililitre başına 0.5 milyon hücre yoğunluğuna kadar iyice yeniden askıya alın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, poli-D-lizin kaplı bir plakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre hücre ekleyin.

Hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için her bir plakayı doldurduktan sonra pipet haznesindeki hücreleri yeniden süspanse edin. Hücreleri 37 derece santigrat derece inkübatörde% 8 karbondioksit ile inkübe edin. Transveksiyondan bir saat önce hücre ortamını değiştirin.

Taranacak sertifika TC arka planındaki her yapı için 450 nanogram DNA'yı 45 mikrolitre serumsuz DMEM ile karıştırarak DNA transveksiyon reaktif komplekslerini hazırlayın. Daha sonra 45 mikrolitre serumsuz DMEM'e 1.6 mikrolitre transveksiyon reaktifi ekleyin ve karıştırın. Seyreltilmiş transveksiyon reaktif çözeltisini hemen DNA çözeltisine ekleyin ve karıştırın.

Çözeltileri ters sırada karıştırmayın. Dört oyuğa 20 mikrolitre transveksiyon reaktifi DNA karışımı eklemeden önce 10 ila 15 dakika bekleyin. Hücreleri 200 nanomolar sitalopram ve 25 mikrolitre TBS ile oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Hücreleri çözündürmek için, TBS'ye 25 mikrolitre sekiz milimolar C12M, bir milimolar CHS ve proteaz inhibitörü kokteyli ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Daha sonra, 20 nanomolar tritiye sitalopram,% 0.1 sığır serum albümini ve% 0.1 sığır serum albümini ve etiket afinite sintilasyon yakınlık testi veya SPA Boncuklarının mililitresi başına miligram ile 50 mikrolitre TBS'yi her yapı için üç oyuğa ekleyin.

Son kuyu için aynı TBS çözeltisini ekleyin, ancak spesifik olmayan bağlanmayı belirlemek için 100 mikromolar sertralin ile takviye edin. His tag affinity SPA Boncuklarını 96 kuyulu plakaya eklerken iyice karıştırıldığından emin olun. Kuyu başına bir dakikalık sayım süresi ile oda sıcaklığında 96 kuyulu bir sintilasyon sayacı kullanarak tritiye sitalopram bağlanmasını ölçün.

Toplam sayım yaklaşık 36 saatte plato yapana kadar plakaları saymaya devam edin. Ölçümün ardından, plakaları 33 santigrat derecede ısıtılmış kapaklı bir ısıtma bloğunda 15 dakika ısıtın. Isıtıldıktan sonra tritiye sitalopram bağlamayı tekrar ölçün.

Isıtma adımında değişiklik yaparak bu adımları tekrarlayın. Hedef proteinin görünür erime sıcaklığına ve en kararlı yapının termostabilitesine bağlı olarak ısıtma sıcaklıklarını ayarlayın. Tüm yapılar düşük özgül sayılara sahip olana kadar plakaları ısıtmaya devam edin.

130 RPM'de bir çalkalayıcı üzerinde% 8 karbondioksit ve% 85 nem ile% 37 santigrat derecede süspansiyon halinde HEK293S GnTI eksi hücreleri ve% 2 fetal sığır serumu ile desteklenmiş 293 ekspresyon ortamını büyütün. P2 virüsü ile 10 litre hücreyi, mililitrede iki enfeksiyon çokluğu ve üç milyon hücre yoğunluğunda enfekte edin. Enfeksiyondan 12 ila 16 saat sonra, bir molar stoktan 10 milimolar konsantrasyona sodyum bütirat ekleyin.

Enfeksiyondan 48 ila 60 saat sonra, hücreleri 15 dakika boyunca 4.000 kez G'de santrifüjleme ile hasat edin. Süpernatanı çıkarın. 150 mililitre TBS'deki hücreleri 2 mikromolar essitalopram veya diğer SERT inhibitörleri ile yeniden süspanse edin.

10 litre kültürden alınan hücreler yaklaşık 30 santigrat derece ılık suda tutulur ve homojen olana kadar hücreleri 10 mililitrelik bir pipetten hızla geçirerek yeniden süspanse eder. Tüm hücreleri bir karıştırma çubuğu ile bir behere ekleyin ve karıştırırken tüm deterjan çözeltisini hücrelere ekleyin. Hücreleri karıştırarak bir saat boyunca dört santigrat derecede çözündürün.

Lizatı dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 8.000 kez G'de döndürün. Süpernatanı temiz ultra santrifüj tüplerine boşaltın ve peleti atın. Daha sonra süpernatanı bir ultra santrifüjde bir saat boyunca 100.000 kez G'de döndürün.

Ultra santrifüjlemenin ardından, süpernatanı 0,2 mikronluk bir filtreden süzün ve peleti atın. Daha sonra, lizatı 10 mililitre strep afinite reçinesi üzerinden geçirin, yıkama tamponunda dengelenmiş bir perisaltik pompa kullanarak bir kolona paketleyin. Daha sonra bir strep afinite kolonunu hızlı bir protein sıvı kromatografi sistemine bağlayın ve kolonu 66 mililitre yıkama tamponu ile dakikada iki mililitre hızla yıkayın.

Saflaştırılmış proteini, 33 mililitre tampon kullanarak dakikada 0.5 mililitre hızında beş milimolar desthiobiotin ile takviye edilmiş aynı yıkama tamponunda elute edin. Bir mililitrelik kesirler toplayın. Tepe fraksiyonları yaklaşık 10 mililitre olacaktır.

Taşıyıcı antikor komplekslerini oluşturmak için, önce saflaştırılmış proteini gece boyunca oda sıcaklığında trombin ile sindirin ve etiketleri çıkarmak için trombin ve deglikosilasyon için Endo H'yi çıkarın. Proteini mililitre başına 10 miligram konsantrasyona ve 100 kilodalton moleküler ağırlık kesme santrifüj protein yoğunlaştırıcı kullanarak 250 ila 300 mikrolitre hacme konsantre edin. Konsantre SERT proteinini, 500 mikrolitreden daha az bir hacimde bir ila 1.2 molar rasyonda 8B6 Fab ile karıştırın.

Karışımı 100.000 kez G ve dört santigrat derecede 20 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, SERT Fab kompleksini içeren süpernatanı toplayın ve peleti atın. Bir boyut dışlama sütununda hızlı protein sıvı kromatografisi kullanarak kompleksi ayırın.

Dakikada 0,5 mililitre takviye edilmiş TBS ile dengeleyin. Kristalleşmeden önce, 100 kilodalton moleküler ağırlıklı kesme santrifüj protein yoğunlaştırıcısı kullanarak kompleksin ayrılmasından elde edilen tepe fraksiyonlarını mililitre başına iki miligrama konsantre edin. 280 nanometrede iki AU'luk bir absorbans, mililitre başına bir miligrama eşittir.

Ücretsiz Fab'a bir ila 0,05 kompleks oranında ek Fab ekleyin. Ayrıca 10 mikromolar serbest S sitalopram ekleyin. Numuneyi santrifüjledikten sonra, SERT Fab kompleksini içeren süpernatanı toplayın ve peleti atın.

Metin protokolündeki birinci tabloya göre dört santigrat derecede asılı bir damla 24 kuyulu ekran kurun. Her bir rezervuar çözeltisinden 500 mikrolitreyi, her bir oyuğa sızdırmazlık maddesi uygulanmış düşük profilli 24 oyuklu bir plakaya pipetleyin. 1.5, 1.75 ve iki mikrolitre SERT Fab kompleksini 18 milimetrelik silikonlu cam kapak kızağı üzerine pipetleyin.

Daha sonra protein örneğinin üzerine bir mikrolitre rezervuar solüsyonu pipetleyin. Tek kristaller yaklaşık üç gün içinde ortaya çıkacak ve 14 gün sonra 100 ila 175 mikrometreye kadar büyüyecektir. Burada, tritiye sitalopram varlığında termostabilitenin taranması için temsili sonuçlar gösterilmiştir.

Maksimum bağlanmaya karşı çizilen erime sıcaklığı değerleri, yüksek termostabilite ve ekspresyona sahip mutantları göstermektedir. Burada, vahşi tip SERT TC ve ilk üç mutant, Y110A, I291A ve T439S için termostabilite eğrileri gösterilmektedir. Bu mikroskopi görüntüsü, hücre zarında bulunan yeşil floresan ile SERT CC'yi eksprese eden HEK293S GnTI eksi hücreyi göstermektedir.

SERT CC'nin floresan algılama boyutu dışlama kromatografisi, 15 mililitrede büyük bir tepe noktası gösterir. SDS-PAGE tarafından yapılan analiz, büyük ölçüde kirletici maddelerden arınmış tek bir protein türünü göstermektedir. Taşıyıcı antikor komplekslerinin boyut dışlama kromatografisi ile temsili olarak ayrılması gösterilmiştir.

11.5 mililitrede kaçan ana zirve, bir SDS-PAGE jeli üzerinde gösterildiği gibi hem SERT hem de Fab içeriyordu. İki haftalık büyümeden sonra S sitalopramına bağlanan SERT antikor kompleksinin ışık mikroskobu, yaklaşık 100 ila 175 mikronluk prizma şeklinde kristaller gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, ligand'a bağlı bir doğrulamada bir zar proteinini stabilize eden mutasyonların nasıl tanımlanacağını ve protein antikor kompleksleri ile kristalizasyon ekranlarının nasıl kurulacağını iyi anlamış olmalısınız.

Bu prosedürü yapmaya çalışırken, ligandların SERT TC'nin stabilizasyonu için gerekli olduğunu ve SERT CC'nin kristalizasyonu için gerekli olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, saflaştırılmış SERT'in işlevi, biyokimyasal ve biyofiziksel yöntemler kullanılarak karakterize edilebilir.