Termo, İfade, saflaştırılması, ve İnsan serotonin Transporter Kristalizasyon Bound

Bu prosedürün genel amacı, yapısal çalışmalar için yeterince kararlı bir taşıyıcı oluşturmak ve bu modifiye edilmiş taşıyıcıyı, X-ışını kristalografisi ile yüksek çözünürlükte kırınım yapan kristaller üretmek için kullanmaktır. Bu yöntem, önemli ilaç hedefleri olan membran proteinlerinin yapısının nasıl çözüleceği gibi yapısal biyoloji alanındaki temel sorulara yanıt verebilir. Bu tekniğin temel avantajı, fonksiyonel bir analiz kullanılarak ilaçla bağlı bir konformasyonun seçilmesine olanak tanımasıdır.

Bu yöntem nörotransmitter taşıyıcıları hakkında bilgi sağlayabilse de, küçük molekülleri yüksek afinite ile bağlayan reseptörlere, kanallara ve çözünür proteinlere de uygulanabilir. Tripsinizlenmiş HEK293S GnTI minus hücrelerini, %10 fetal bovine serum ile desteklenmiş DMEM içinde, tek kullanımlık bir pipet rezervuarında mililitre başına 0,5 milyon hücre yoğunluğuna gelecek şekilde tamamen resüspande edin. Çok kanallı bir pipet kullanarak, poli-D-lizin kaplı bir plakanın her kuyucuğuna 100 µL hücre ekleyin.

Hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için her plakayı doldurduktan sonra hücreleri pipet rezervuarında yeniden süspande edin. Hücreleri 37 °C sıcaklıktaki %8 karbondioksit içeren inkübatörde inkübe edin. Transveksiyon işleminden bir saat önce hücre besiyerini değiştirin.

Taranacak olan cert TC arka planındaki her bir konstrükt için 450 nanogram DNA'yı 45 mikrolitre serumsuz DMEM ile karıştırarak DNA transveksiyon reaktif komplekslerini hazırlayın. Ardından, 1,6 mikrolitre transveksiyon reaktifini 45 mikrolitre serumsuz DMEM'e ekleyin ve karıştırın. Seyreltilmiş transveksiyon reaktifi çözeltisini derhal DNA çözeltisine ekleyin ve karıştırın.

Çözeltileri ters sırada karıştırmayın. Transveksiyon reaktifi DNA karışımının 20 µL'sini kuyucukların dördüne eklemeden önce 10 ila 15 dakika bekleyin. Hücreleri 200 nM citalopram ve 25 µL TBS ile oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Hücreleri çözünür hale getirmek için, TBS içinde 25 µL 8 mM C12M, 1 mM CHS ve proteaz inhibitör kokteyli ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, her bir konstrükt için üç kuyucuğa 20 nM trityumla işaretli sitalopram, %0,1 sığır serum albümini ve mg/mL his tag afinite sintilasyon yakınlık analizi veya SPA boncukları içeren 50 µL TBS ekleyin.

Son kuyucuk için aynı TBS çözeltisini ekleyin, ancak spesifik olmayan bağlanmayı belirlemek için 100 micromolar sertraline ile takviye edin. His etiketi afinite SPA Boncuklarını 96 kuyucuklu plakaya eklerken iyice karıştırıldıklarından emin olun. Trityumlu citalopram bağlanmasını, oda sıcaklığında, kuyucuk başına bir dakikalık sayım süresiyle 96 kuyucuklu bir sintilasyon sayacı kullanarak ölçün.

Toplam sayımlar yaklaşık 36 saatte platoya ulaşana kadar plakaları saymaya devam edin. Ölçümün ardından, plakaları ısıtmalı kapağa sahip bir ısıtma bloğunda 33 °C'de 15 dakika boyunca ısıtın. Isıtma işleminden sonra tritiyum işaretli citalopram bağlanmasını tekrar ölçün.

Isıtma adımını modifiye ederek bu adımları tekrarlayın. Isıtma sıcaklıklarını, hedef proteinin görünür erime sıcaklığına ve en stabil konstrüktun termostabilitesine göre ayarlayın. Tüm konstrüktlar düşük spesifik sayımlara ulaşana kadar plakaları ısıtmaya devam edin.

HEK293S GnTI minus hücrelerini, 130 RPM hızında bir çalkalayıcıda, %8 karbondioksit ve %85 nem ile 37 °C'de, %2 fetal bovine serum ile takviye edilmiş 293 ekspresyon besiyerinde süspansiyon şeklinde büyütün. 10 litre hücreyi, iki enfeksiyon çokluğu (MOI) ve mililitre başına üç milyon hücre yoğunluğunda P2 virüsü ile enfekte edin. Enfeksiyondan 12 ila 16 saat sonra, bir molar stoktan 10 mM konsantrasyona ulaşacak şekilde sodyum bütirat ekleyin.

Enfeksiyondan 48 ila 60 saat sonra, hücreleri 15 dakika boyunca 4.000 ×g'de santrifüj ederek hasat edin. Süpernatantı uzaklaştırın. Hücreleri, 2 µM essitalopram veya diğer SERT inhibitörleri içeren 150 mL TBS içerisinde yeniden süspande edin.

10 litre kültürdeki hücreleri yaklaşık 30 °C sıcaklıktaki ılık suda toplayın ve homojen hale gelene kadar hücreleri hızlıca bir 10 ml pipetle geçirerek yeniden süspanse edin. Tüm hücreleri manyetik karıştırıcılı bir behere aktarın ve karıştırma işlemi sırasında tüm deterjan çözeltisini hücrelerin üzerine ekleyin. Hücreleri 4 °C'de bir saat boyunca karıştırarak solubilize edin.

Lizatı 4 °C'de 15 dakika boyunca 8,000 ×g hızında santrifüjleyin. Süpernatantı temiz ultra santrifüj tüplerine aktarın ve peleti atın. Ardından, süpernatantı bir ultra santrifüjde bir saat boyunca 100,000 ×g hızında santrifüjleyin.

Ultra santrifüj işleminin ardından, süpernatantı 0.2 mikronluk bir filtreden süzün ve pelleti atın. Daha sonra, lizatı, yıkama tamponu ile dengelenmiş ve bir kolona doldurulmuş 10 mililitre strep afinite rezininden, perisaltik bir pompa kullanarak geçirin. Ardından, bir strep afinite kolonunu hızlı protein sıvı kromatografisi sistemine bağlayın ve kolonu, dakikada iki mililitre hızla 66 mililitre yıkama tamponu ile yıkayın.

Saflaştırılmış proteini, 5 mM desthiobiotin eklenmiş aynı yıkama tamponu ile 0,5 ml/dakika hızında 33 ml tampon kullanarak elüe edin. 1 ml'lik fraksiyonlar toplayın. Pik fraksiyonlar yaklaşık olarak 10 ml olacaktır.

Taşıyıcı antikor komplekslerini oluşturmak için önce, etiketleri uzaklaştırmak amacıyla trombin ile ve deglikozilasyon için Endo H ile saflaştırılmış proteini oda sıcaklığında gece boyunca sindirin. 100 kilodalton moleküler ağırlık kesim noktalı santrifüj protein konsantratörü kullanarak proteini 10 mg/mL konsantrasyona ve 250 ila 300 µL hacme konsantre edin. Konsantre SERT proteinini, 500 µL'den daha az bir hacimde, 1 ila 1,2 molar oranında 8B6 Fab ile karıştırın.

Karışımı 100,000 ×g'de ve 4 °C'de 20 dakika boyunca santrifüj edin. Santrifüj işleminin ardından, SERT Fab kompleksini içeren süpernatanı toplayın ve peleti atın. Kompleksi, boyut dışlama kolonunda hızlı protein sıvı kromatografisi kullanarak ayırın.

Sistemi, dakikada 0.5 mL hızında takviye edilmiş TBS ile dengeleyin. Kristalizasyon öncesinde, kompleks ayırmadan elde edilen pik fraksiyonları, 100 kDa moleküler ağırlık kesme limitli bir santrifüj protein konsantratörü kullanarak 2 mg/mL konsantrasyona getirin. 280 nm'de iki AU'luk bir absorbans, 1 mg/mL'ye eşittir.

Komplekse karşı serbest Fab oranı 1:0,05 olacak şekilde ek Fab ekleyin. Ayrıca 10 µM serbest S-sitalopram ekleyin. Numuneyi santrifüj ettikten sonra, SERT Fab kompleksini içeren süpernatanı toplayın ve pellet kısmını atın.

Metin protokolündeki tablo bire göre, 4 °C'de asılı damla 24 kuyucuklu tarama düzeneği kurun. Her kuyucuğa sızdırmazlık malzemesi uygulanmış düşük profilli 24 kuyucuklu bir plakadaki her bir rezervuar çözeltisinden 500 µL pipetleyin. 18 mm'lik silikonize cam lam üzerine 1,5, 1,75 ve 2 µL SERT Fab kompleksini pipetleyin.

Ardından, protein örneğinin üzerine bir mikrolitre rezervuar çözeltisi pipetleyin. Tekil kristaller yaklaşık üç gün içinde ortaya çıkacak ve 14 gün sonra 100 ila 175 mikrometre boyutuna ulaşacaktır. Burada, trityumlanmış citalopram varlığında termostabilite taraması için temsili sonuçlar gösterilmektedir.

Maksimum bağlanmaya karşı çizilen erime sıcaklığı değerleri, yüksek termostabilite ve ekspresyona sahip mutantları göstermektedir. Burada, vahşi tip SERT TC ve en iyi üç mutant olan Y110A, I291A ve T439S'nin termostabilite eğrileri sunulmuştur. Bu mikroskopi görüntüsü, hücre membranında yeşil floresan bulunan ve SERT CC eksprese eden HEK293S GnTI minus hücrelerini göstermektedir.

SERT CC'nin floresan tespitli boyut dışlama kromatografisi, 15 mililitrede majör bir pik göstermektedir. SDS-PAGE analizi, büyük ölçüde kontaminantlardan arındırılmış tek bir protein türü sergilemektedir. Taşıyıcı antikor komplekslerinin boyut dışlama kromatografisi ile temsili ayrımı gösterilmiştir.

SDS-PAGE jelinde gösterildiği üzere, 11,5 mililitrede elüye olan ana pik hem SERT hem de Fab içeriyordu. İki haftalık büyümeden sonra S sitaloprama bağlı SERT antikor kompleksinin ışık mikroskobu görüntüleri, yaklaşık 100 ila 175 mikron boyutunda prizma şeklinde kristaller göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, bir membran proteinini ligand bağlı konformasyonda stabilize eden mutasyonların nasıl tanımlanacağı ve protein antikor kompleksleri ile kristalizasyon taramalarının nasıl kurulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Bu prosedür uygulanırken, ligandların SERT TC'nin stabilizasyonu için gerekli olduğu ve SERT CC'nin kristalizasyonu için temel teşkil ettiği unutulmamalıdır. SERT, birçok antidepresan ilacın moleküler hedefi olduğundan, bu tekniğin etkileri psikiyatrik durumların tedavisine kadar uzanmaktadır. Bu prosedürün ardından, saflaştırılmış SERT'in fonksiyonu biyokimyasal ve biyofiziksel yöntemler kullanılarak karakterize edilebilir.