Name: Termo, İfade, saflaştırılması, ve İnsan serotonin Transporter Kristalizasyon Bound S -citalopram (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Öğrenin insan serotonin taşıyıcısının termostabilizasyon, saflaştırma ve kristalleştirme yöntemlerini. Bu protokol zorlu membran proteinlerinin yapısal biyoloji çalışmaları için uyarlanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Monoklonal antikorlar ürettiği için D. Cawley'e teşekkür ederiz. A. Penmatsa ve K. Wang'a dopamin taşıyıcısından geliştirilen fikir ve uzmanlıklarını paylaştıkları için teşekkür ederiz. Rakamlarla ilgili yardım için L. Vaskalis, el yazması hazırlama konusunda yardım için H. Owen ve yararlı tartışmalar için diğer Gouaux laboratuvar üyeleri. J.A.C., Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri'nden Banting doktora sonrası bursundan destek almaktadır. E.M.G., Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Bursu tarafından desteklenmektedir. Bernie ve Jennifer LaCroute'a cömert destekleri ve NIH'den (5R37MH070039) sağlanan fonlar için özellikle minnettarız. E.G., Howard Hughes Tıp Enstitüsü'nde araştırmacıdır.

<ol><li>Kristensen, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLC6+neurotransmitter+transporters%3A+structure%2C+function%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation.</a> Pharmacol Rev. 63 (3), 585-640 (2011).</li>
<li>Broer, S., Gether, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+solute+carrier+6+family+of+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The solute carrier 6 family of transporters.</a> Br J Pharmacol. 167 (2), 256-278 (2012).</li>
<li>Andersen, J., Kristensen, A. S., Bang-Andersen, B., Stromgaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+understanding+of+the+interaction+of+antidepressant+drugs+with+serotonin+and+norepinephrine+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the understanding of the interaction of antidepressant drugs with serotonin and norepinephrine transporters.</a> Chem Commun (Camb). 25 (25), 3677-3692 (2009).</li>
<li>Hahn, M. K., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+impact+of+SLC6+transporter+genetic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">The functional impact of SLC6 transporter genetic variation.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 401-441 (2007).</li>
<li>Abdul-Hussein, S., Andrell, J., Tate, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermostabilisation+of+the+serotonin+transporter+in+a+cocaine-bound+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Thermostabilisation of the serotonin transporter in a cocaine-bound conformation.</a> J Mol Biol. 425 (12), 2198-2207 (2013).</li>
<li>Green, E. M., Coleman, J. A., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermostabilization+of+the+human+serotonin+transporter+in+an+antidepressant-Bound+Conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Thermostabilization of the human serotonin transporter in an antidepressant-Bound Conformation.</a> Plos One. 10 (12), e0145688(2015).</li>
<li>Goehring, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nat Protoc. 9 (11), 2574-2585 (2014).</li>
<li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), 673-681 (2006).</li>
<li>De Becker, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adjuvant+monophosphoryl+lipid+A+increases+the+function+of+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">The adjuvant monophosphoryl lipid A increases the function of antigen-presenting cells.</a> Int Immunol. 12 (6), 807-815 (2000).</li>
<li>Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+structures+and+mechanism+of+the+human+serotonin+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">X-ray structures and mechanism of the human serotonin transporter.</a> Nature. , (2016).</li>
<li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+progress+of+membrane+protein+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">The progress of membrane protein structure determination.</a> Protein Sci. 13 (7), 1948-1949 (2004).</li>
<li>Gambotto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+enhanced+green+fluorescent+protein+%28EGFP%29+in+BALB%2Fc+mice%3A+identification+of+an+H2-Kd-restricted+CTL+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope.</a> Gene Ther. 7 (23), 2036-2040 (2000).</li>
<li>Galfre, G., Howe, S. C., Milstein, C., Butcher, G. W., Howard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+major+histocompatibility+antigens+produced+by+hybrid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines.</a> Nature. 266 (5602), 550-552 (1977).</li>
<li>Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+stability%3A+a+crystallographer%27s+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+F+Struct+Biol+Commun%22%5BJournal%5D)">Protein stability: a crystallographer's perspective.</a> Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 72, 72-95 (2016).</li>
<li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).</li>
<li>Tate, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+seven+different+heterologous+protein+expression+systems+for+the+production+of+the+serotonin+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Comparison of seven different heterologous protein expression systems for the production of the serotonin transporter.</a> Biochim Biophys Acta. 1610 (1), 141-153 (2003).</li>
<li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).</li>
<li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).</li>
<li>Faham, S., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicelle+crystallization%3A+a+new+method+for+crystallizing+membrane+proteins+yields+a+monomeric+bacteriorhodopsin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure.</a> J Mol Biol. 316 (1), 1-6 (2002).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Biyofiziksel tekniklerle membran proteini yapısının belirlenmesi, birçok tıbbi önemli taşıyıcıları, reseptörler ve kanallar 11 için zor bir girişim olarak kalır. Burada S -citalopramın bağlı insan serotonin taşıyıcı yapı tayini için geliştirilen ayrıntılı uzmanlık paylaşır. Biz bu yöntemlerin diğer yapısal durumları yanı sıra diğer zor zar proteinlerinin yapılarda SERT yapılarının yararlı olacağını tahmin ediyoruz. Bundan başka, burada açıklanan biyokimyasal teknikler aynı zamanda, deterjan saflaştırıldı eki ve bir yakın yerel lipid ortam işlevi çalışmak için de kullanılabilir. SERT kristalleşme birkaç araç ve tekniklerin geliştirilmesi üzerine menteşeli. İlk olarak, taşıyıcı termo gelişmeler membranların 6 taşıyıcı çıkarma aşağıdaki çeşitli deterjan miseller iyi davrandım SERT varyantları üretti. İkincisi, kullanımsaflaştırma ve kristalizasyon boyunca yüksek afiniteli ligandı S -citalopramın daha da geliştirilmiş kararlılık ve düşük yapısal heterojenite. Üçüncü olarak, aşılama ve kristalleşme hem de kolaylaştıran 2 hafta gibi kısa bir süre içinde SERT büyük miktarlarda üretimi için izin BacMam sentezleme sistemi 7 geliştirilmesi. Son olarak, stratejilerinin geliştirilmesi kristaller halinde SERT-antikor komplekslerinin iyi sıralı ambalaj teşvik 8B6 antikorunun keşfine izin 3D epitopları tanıyan yüksek afiniteli antikorların seçilmesi için. genellikle protokol boyunca meydana gelen kritik adımlar ve reaktifler yanı sıra ortak bir takım sorunlar vardır. İlk olarak, yüksek titre SERT P2 virüsün üretimi sorunlu olabilir. Bu protokolde tarif edildiği gibi P2 virüs üretmek için P1 virüsünün düşük konsantrasyonlarda eklemek genellikle bu sorunu ortadan kaldıran, ve P2 Virüs titresi düşük olduğu durumlarda, P3 virüsü usin yapılabilir0.0001 bir MOI&#39;da g virüsü. 1 x 10 8 virüs partiküllerinin daha düşük bir titreye sahip bir virüs / ml kullanılmamalıdır ve hemen hemen her zaman düşük protein verimine neden olur. Ekspresyon için, HEK293S GnTI - bunlar N kompleks N -glycans sentezleyemediği dolayısıyla I aktivitesini -acetylglucosaminyltransferase ve eksik olur hücreler yerine, yalnızca yüksek mannoz N -glycans üreten seçilmiştir. EndoH böler N asparajin bağlı bir N -acetylglucosamine bırakarak hücre dışı döngü 2 (EL2) iki noktada yüksek mannoz glikanların glikozilasyon -bağlı. N sindirimi şekerler kristalleştirme için olası önemli El2 yüzey entropi azaltır -bağlı. Antikorların üretimi için, SERT IC immünizasyon için kullanılmalıdır. GFP 12 yüksek oranda immünojenik ve tamamen SEC tarafından çıkarılması zor olduğu için antikorların üretilmesi için, bir füzyon etiket olarak kullanılmamalıdır. SERT esnek N- ve C-terminali de değildiBu bölgelerin karşı antikor önlemek için bir yapı da yer almaktadır. Fareler yeniden oluşturulmuş proteinin 30 ug ile immünize edilebilir; antikorların yüksek serum konsantrasyonları tespit edilmeye kadar immünize fareler devam tarif 13 hibridoma hücrelerinin üretilmesi. Bir thermostabilized yapı genellikle aşılama için en iyi seçimdir; taşıyıcı iyi davrandım ve arıtma için aşağıdaki biyolojik aktivitesini muhafaza, bu genellikle antikorları geliştirmek için yeterli olmaktadır. 8B6 antikoru WT SERT karşı büyüdü. kristalizasyon için FSEC ile değerlendirildiği gibi tek dağılımlı kompleksini ihtiva SEC sadece pik fraksiyonlar bir araya getirilmiş ve konsantre olmalıdır. SERT-8B6 kristalleri koşullar dar bir aralıkta büyür ve özellikle SERT kristal büyümesi ile ilgili sorunları gidermek için alınması gereken adımların bir dizi vardır. HCI ile ayarlanmıştır Tris baz, bu tampon, kristal büyümesini desteklemez, rezervuar çözeltisi içinde kullanılmamalıdır; böylece CRI olduğukortikal yerine NaOH ile ayarlanmıştır Tris kullanımı. Kristaller uzamıyor veya çok sayıda küçük kristaller gözlenir ise, PEG 400 konsantrasyonda bile küçük bir artış veya azalış tavsiye edilir eğer öyleyse SERT kristalleri, PEG 400 dar bir konsantrasyon aralığında büyür. Bundan başka, ilave 6-aminoheksanoik asit, aynı zamanda, nükleasyon artırmak için optimize ekran kullanılmıştır. Protein damla oranı: de bir çözüm de, kristal büyümesi için önemli bir belirleyici faktör olduğunu. tipik olarak daha büyük bir 3 boyutlu kristallerin büyümesine destek 1: 2 daha yakın açılan oranları önerilmektedir 1: 2 - 1.5 oranlarını bırakın. Son olarak, düşük profil 24 oyuklu plakalar kullanımı ki tahminen bu, buharı difüzyon hızının değiştirilmesi için, kristal büyüme yönünde çok önemlidir. SPA yöntemine alternatif bir yaklaşım, tahlil 5 bağlayıcı filtre kullanılarak kokaine bağlı konformasyonunda sıçan serotonin taşıyıcısını stabilize mutantlar için ekrana geliştirilmiştir. Buna karşılık, SPA baSED deney ligandına bağlı kalır SERT fraksiyonunun belirlenmesi ile, sırasıyla aşağıdaki ısıtma adımları sağlar. Bu nedenle, bu örneklerin az sayıda erime sıcaklığının hızlı bir şekilde belirlenmesine izin verir. SPA yöntem radyo-etiketli yüksek afiniteli bir ligandın varlığına dayanır ve herhangi bir ligand submikromolar afınite ile bağlanan, bilinmektedir sonra alternatif bir yaklaşım, gerekli olacaktır. Birçok diğer yöntemler yaygın olarak bu tür floresan boyalar ve kalorimetri 14 bağlayıcı protein stabilitesini ölçmek için kullanılan, ancak, düşük-verimlilik ve işlevi doğrudan ölçülmesi veya yüksek miktarda protein gerektirecek ya edemiyoruz vardır. SPA yöntem kullanılabilir olamaz, alternatif bir yüksek verimli bir yaklaşım, örnek taşıyıcı kalan fraksiyonunun ayrılması ve ardından ısıtılan bir FSEC tabanlı Termostabilite Deney 15 (FSEC-TS) vardır. FSEC-TS kromatografik davranış ve oligomerik durumunu erişmek için kullanışlı bir yaklaşım ve ApSPA yöntemiyle birlikte kullanılabilecek owerful tamamlayıcı bir araç. Çeşitli ortak protein ekspresyon sistemlerinin bir karşılaştırma da SERT ifadesi 16 için memeli hücrelerinin kullanımı tercih bulunmuştur ve şaşırtıcı Bu büyük olasılıkla, memeli kökenli birçok proteinler için geçerlidir. Biz ifade için kullanılan metodlar SERT için uyarlanmış ancak büyük olasılıkla kolayca adapte edilmiştir. yüksek ifade seviyeleri tercih şartlar dikkatli bir şekilde, örneğin sodyum bütirat histon deasetilaz inhibitörleri sentezlenmesi, sıcaklık, virüs konsantrasyonu ve varlığı süresi değiştirilerek belirlenmelidir. Genellikle bağlanmadan önce yüksek afiniteli bir ligandın tutmak için yeniden-teşekkül ettirilmeden CHS birlikte böyle C12M gibi hafif bir uzun zincirli deterjan afinite saflaştırma lehinedir. hidrofobik emilimini kullanarak Sulandırma biz birkaç diğer nakliyecilere ve alıcıları için etkili olduğu bulduk hafif bir tekniktir. Eğer budiyaliz, seyreltme, veya sek. yüksek kritik misel konsantrasyonu ile deterjan çıkarılması 17 antijeni deterjanlar içinde yeterince kararlı olarak temin başarılı kullanılabilir değildir. Uygun bir antikor bulunan durumlarda, hemen hemen her zaman sorun işlevi veya antijen denatürasyon kaybı nedeniyle ve bu gibi durumlarda başarıyla protein biyokimyası özel dikkat yeni aşılar uygulandı bulabilirsiniz. Son olarak, yüksek bir afinite ile bağlanan ligandlar ve antikorlar, bir rasyonel olarak planlanmış kristalizasyon deney için bir temel oluşturacaktır ve ısıya dayanıklı bir varyantın yararlanarak, biri farklı deterjanların özellikleri değiştirilerek koşullarının geniş bir aralıkta tarayabilir. Bundan başka, bir lipidik mezofaz 18 kristalleştirme veya bicelles 19 kullanılarak her miseller kristalleşme alternatif olarak düşünülmelidir. Bu ilkeler ve yöntemler bazı modifi ile kullanılabilirifade ve diğer ekspresyon ana den saflaştırmak ve yüksek afiniteli ilaçların hedeflerinden yapı tayini için özellikle faydalı olacaktır zor olan diğer zar proteini için bir katyondur.

Serotonin (SERT) hücre membranları 1 arasında serotonin taşınmasını kolaylaştıran bir integral membran proteinidir. SERT ayrıca dopamin ve norepinefrin taşıyıcıları 2 içeren nörotransmitter Sodyum Symporters (NSSs) bir aile aittir. SERT rekabetçi serotonin naklini 3 inhibe hareket yaygın olarak reçete antidepresan ve anti-anksiyete ilaçları moleküler hedeftir. SERT sinaptik gelen nörotransmitter çıkarmak için sodyum enerjik olumlu cotransport patlatır. Serotonerjik sistemin kapsamlı karakterizasyonu serotonin metabolizmasında değişiklikler neredeyse ruh hali, uyku, ağrı, kavrama dahil olmak üzere tüm nörolojik süreçleri etkilemek için görünür olduğunu göstermiştir ve saldırganlık 4 davranışları. SERT fonksiyonu S -citalopramın gibi antidepresanlar ve selektif serotonin gerialım inhibitörleri (SSRI) kullanımı yoluyla yanı sıra psychostimula tarafından değiştirilebilirNTS ve amfetamin ve 3,4-Metilendioksi N -methylamphetamine veya &quot;ecstasy&quot; 1,2 olarak bağımlılık ilaçlar. SSRI ruh hali bozukluklarının tedavisi için son derece önemli olan, ancak bunların eylem için değerli yapı temeli çok iyi anlaşılmamıştır. WT SERT Böylece SERT 5,6 bir üç boyutlu (3D) bir yapı doğru ilerlemeyi engelleyen, deterjan miseller stabil değildir. Son zamanlarda, deterjan geniş bir sağlam kararlıdır ve aktivitesi 6 bağlanma SSRI korumak SERT varyantlarını geliştirdi. Bu termo SERT varyantları, bir sintilasyon yakınlık tabanlı termostabilite deneyi kullanılarak belirlenmiştir. Burada antikorun ve S -citalopramın ile kompleks olarak, SERT bağlanan yüksek afiniteli antikorların üretilmesi için bir işlem, ve ısıya dayanıklı SERT saflaştırılması ve kristalleşme açıklar. Bu protokol SERT ve 8B6 genler başarılı olmuştur varsayary, sırasıyla, BacMam 7 ve böcek sentezleme vektörlerine klonlanmıştır. Antikorların üretilmesi için, bir cDNA kodlayan tortuları WT SERT&#39;in 73-616 bir C-terminal Strep II etiketi (SERT İS) BacMam vektörüne klonlanmıştır. Termostabilite ekran için, SERT artıkları C-terminali GFP ile 73-616, Strep II ve 10-His etiketleri (SERT TC) kullanılmıştır. Bireysel nokta mutasyonları SERT TC arka planda üretildi. Kristalleşme protokolü için, SERT-GFP füzyon proteini yüzey sisteinler C554A, C580A ve ısı ayarlı mutantlar, Y110A, I291A ve T439S ve mutasyonlar taşıyan Twin-Strep [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) 2 GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] ve 10-His etiketleri ile kullanılmıştır ve C622A (SERT CC). Trombin parçalama dizileri (LVPRGS) de N- çıkarılması ve C-ucu sağlamak için S76 ve T618 sonra SERT CC sokulmuştur. 8B6 Fab kodlayan plazmid ağır ve hafif hem de ifade etmek için olaniki ayrı polihedrin promoterlerin kontrolü altında GP67 salgılama sekansları ile antikor zincirleri. 8B6 antikorunun ağır zincirinin C-terminal 8 His etiketi ile etiketlenmiş ve bir trombin parçalanma alanı ağır zincir ve etiket arasına sokulmuştur.

<table><tbody><tr><td>DH10Bac</td><td>Invitrogen</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td>Fisher</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>Fisher</td><td>BP918-1</td><td></td></tr><tr><td>Tetrasiklin</td><td>Sigma</td><td>T-7660</td><td></td></tr><tr><td>Bluo-gal</td><td>Invitrogen</td><td>15519-028</td><td>5-Bromo-3-indolil ve beta;-D-galaktopiranosid</td></tr><tr><td>İzopropil beta-D-1-tiyokalaktopiranosit</td><td>Anatrace</td><td>I1003</td><td>IPTG</td></tr><tr><td>Miniprep kiti</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td>Sf9 transfeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>Sf9</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 III SFM ortamı</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12658-027</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293S GnTI-</td><td>ATCC</td><td>CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>Serbest Stil 293 medya</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12338-018</td><td>293 ifade ortamı</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>0984018DJ</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bütirat</td><td>Sigma</td><td>303410<</td><td></td></tr><tr><td>em>S-sitalopram</td><td>Sigma</td><td>E4786</td><td>Anagrade</td></tr><tr><td>n-Dodesil-beta-D-Maltopiranosid</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>Kolesteril hemmisoksitinat</td><td>Sigma</td><td>C6013</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfokolin</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>850457P</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>850757P</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfogliserol</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>840457P</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>Sigma</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Desthiobiotin</td><td>Iba Yaşam Bilimleri</td><td>2-1000-05</td><td></td></tr><tr><td>Azolektin</td><td>Sigma</td><td>11145</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol</td><td>Sigma</td><td>C-8667</td><td></td></tr><tr><td>Lipid A</td><td>Sigma</td><td>L5399</td><td></td></tr><tr><td>Beyin polar lipid</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>141101C</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads</td><td>Biorad</td><td>152-3920</td><td>Hidrofobik absorpsiyon reçinesi</td></tr><tr><td>Keçi anti-fare IRDye 680RD</td><td>Odyssey</td><td>926-68070</td><td>İkincil antikor olarak kullanılır. batı lekesi</td></tr><tr><td>Lauril maltoz neopentil glikol</td><td>Anatrace</td><td>NG310</td><td>Anagrade</td></tr><tr><td>Serotonin</td><td>Sigma</td><td>H9523</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac 8B6</td><td></td><td></td><td>Yazarlardan edinilebilir</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT Strep II</td><td></td><td></td><td>SERTIC, Yazarlardan edinilebilir</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His</td><td></td><td></td><td>SERTTC, Yazarlardan temin edilebilir</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT ts3 GFP ikiz Strep His</td><td></td><td></td><td>SERTCC, Yazarlardan edinilebilir</td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>Sigma</td><td>56749</td><td></td></tr><tr><td>n-Oktil &beta;-D-maltosid</td><td>Anatrace</td><td>O310</td><td>Anagrad</td></tr><tr><td>Trombin</td><td>Hematolojik Teknolojiler</td><td>HCT-0020</td><td></td></tr><tr><td>EndoH</td><td>New England Biolabs</td><td>P0702</td><td></td></tr><tr><td>Trizma-HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>Tris, kristalizasyon rezervuarlarının hazırlanmasında kullanılır</td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>Sigma</td><td>91893</td><td></td></tr><tr><td>6-aminoheksanoik asit</td><td>Sigma</td><td>7260</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Fisher</td><td>MT25052CV</td><td></td></tr><tr><td>İzoplate-96 TC</td><td>PerkinElmer</td><td>6005070</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen</td><td>SL100688</td><td>Mamalya hücreleri için polimer transfeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>Bakır HIS-Tag YSI SPA Boncukları</td><td>PerkinElmer</td><td>RPNQ0096</td><td>His-tag afinitesi SPA boncukları</td></tr><tr><td>Citalopram, [N-Metil-3H]</td> <td>PerkinElmer</td><td>NET1039250UC</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>termostabilite deneyi için 5382000023 ısıtma bloğu</td></tr><tr><td>ThermoTop</td><td>Eppendorf</td><td>5308000003</td><td></td></tr><tr><td>SmartBlock PCR 96, PCR plakaları için termoblok</td><td>Eppendorf</td><td>5306000006</td><td></td></tr><tr><td>0.2 & mikro; m şırınga filtresi</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-243</td><td></td></tr><tr><td>1 L filtre sistemi</td><td>Corning</td><td>430517</td><td></td></tr><tr><td>2 L düz tabanlı doku kültürü şişesi</td><td>Genemate</td><td>F-5909-2000</td><td></td></tr><tr><td>2 L şaşkın doku kültürü şişesi</td><td>Genemate</td><td>F-5909-2000B</td><td></td></tr><tr><td>CO2 inkübatörü</td><td>Thermo Scientific</td><td>3950</td><td></td></tr><tr><td>Forma Orbital Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>416</td><td></td></tr><tr><td>Strep-Tactin reçinesi</td><td>Iba Life Sciences</td><td>2-1208-025</td><td>Strep afinite reçinesi</td></tr><tr><td>Ekstruder</td><td>Northern Lipids</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Li-Cor görüntüleme sistemi</td><td>Odyssey</td><td></td><td>western blot görüntüleme sistemi</td></tr><tr><td>XK16 sütunu</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9889-37</td><td>sütunu Strep-Tactin ve Talon saflaştırmak için kullanılan sütun</td></tr><tr><td>100 kDa MWCO protein yoğunlaştırıcı</td><td>Millipore UFC910096</td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 kDa MWCO protein yoğunlaştırıcı</td><td>Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; kta FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>UPC-900</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>51476</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 (10/300) sütun</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td>FSEC</td></tr><tr><td>Teğetsel akış aparatı</td><td>Pall Filtron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 ve mikro için kullanılır; m filtre teğetsel akış hücresi</td><td>Pall Filtron</td><td>PSM20C11</td><td></td></tr><tr><td>30 kDa MWCO teğetsel akış yoğunlaştırıcı</td><td>Pall Filtron</td><td>OS030T12</td><td></td></tr><tr><td>Talon reçinesi</td><td>Clonetech</td><td>635504</td><td>Fab saflaştırması için kullanılan His-tag afinite reçinesi</td></tr><tr><td>1 mL HiTrap SP sütunu</td><td>GE Healthcare</td><td>17115101</td><td>Fab saflaştırması için kullanılan katyon değiştirici</td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL sütunu</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td>SERT-8B6</td></tr><tr><td>24 kuyulu VDXm plakasının</td> SEC ayrımı için kullanılır <td>Hampton Research</td><td>HR3-306</td><td></td></tr><tr><td>18 mm lameller</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-239</td><td></td></tr><tr><td>Virocyt virüs sayacı</td><td>Virocyt</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>MicroBeta Trilux</td><td>PerkinElmer</td><td>1450</td><td>96 kuyulu sintilasyon sayacı</td></tr><tr><td>HiTrap SP sütunu</td><td>GE Sağlık</td><td>17115101</td><td></td></tr><tr><td>Sertralin</td><td>Sigma</td><td>S6319</td><td></td></tr></tbody></table>

termo, İfade, saflaştırılması, ve İnsan serotonin transporter kristalizasyon bound<em&gt; s</em&gt; -citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Serotonin taşıyıcı hücre içine ekstraselüler serotonin &quot;pompaları&quot; bir sodyum ve klorür-birleştiğinde taşıyıcı olduğunu. S -citalopram serotonin geri alımını engelleyerek, yüksek afinite ile serotonin taşıyıcısı bağlanarak depresyon ve anksiyete tedavisinde kullanılan bir ilaçtır. Burada verimli bir prosedür ve ekspres, stabilize arındırmak ve S -citalopramın ve diğer antidepresanlara bağlı serotonin taşıyıcı-antikor kompleksleri kristalize için bir dizi araç sunduk. Serotonin taşıyıcısını stabilize mutasyonlar bağlanma tahlili S -citalopram kullanılarak belirlendi. Bakulovirüs kalıt HEK293S GnTI ifade serotonin taşıyıcı - hücreleri, proteoliposomes halinde yeniden kurulmuş ve yüksek afıniteli antikorlar yükseltmek için kullanılmıştır. Biz yapısal çalışmalar için yararlı olan antikorları keşfetmek için bir strateji geliştirdik. Sf9 hücrelerinde antikor fragmanlarının ekspresyonu için basit bir yaklaşım, aynı zamanda tespit edilmiştir.Bu yordamı kullanarak arıtılmış Transporter-antikor kompleksleri uslu ve kolayca 3-4 Å çözünürlük X-ışınları yaymak S -citalopramın ile kompleks üreten, kristalize bulunmaktadır. Burada geliştirilen stratejiler diğer zorlu membran proteinlerinin yapısını belirlemek için kullanılabilir.

SERT TC arka planda tek nokta mutantlar bir kütüphane mutasyonlarını termo ekranına oluşturuldu. Bağımsız mutantlar standart mutagenez kullanılarak elde edilmiştir. Şekil 1A tarif edilen tarama programı geçici hızlı kimlik kristalleştirme için yararlı mutasyonlara HEK293S hücreleri ve bir sintilasyon yakınlık tabanlı termostabilite ekran transfekte kullanmaktadır. Çizim Tm değerleri bağlı [3H] oda sıcaklığında sitalopram, yüksek termostabilite ve sentezleme seviyeleri, uygun olan yapılar ortaya karşısında protein saflaştırma için (Şekil 1B). Üç mutant (Y110A, I291A ve T439S) son derece stabil bir yapı (Şekil 1C) oluşturmak üzere bir araya getirilmiştir. Termostabilitesini ayrıca SERT-Fab kompleksinin kristalleşme için gerekli kısa zincirli deterjanlarda artan istikrar ile ilişkilidir. baculovirüs-tr kullanılarak insan SERT büyük ölçekli ekspresyonuansduced HEK293S GnTI - hücreleri en az 2 hafta sürebilir ve Şekil 2A&#39;da gösterildiği gibi, miligram miktarları üretebilir. GFP etiketli SERT CC proteininin kullanımı SERT uygun floresan (Şekil 2B) ile ekspresyonu ve saflaştırılması sırasında takip edilebilir. ; Stabilize edici bir lipid olarak CHS mevcudiyetinde C12M hücrelerin - Bizim saflaştırma stratejisi 1) HEK293S GnTI S -citalopramın bağlı SERT çözünürlüğünü dahil 2) Strep afinite matrisi Sert bağlanması; Kapsamlı yıkama ile kirletici madde proteinlerinin 3) kaldırılması; ve 4) tamponu ihtiva eden destiyobiyotin (Şekil 2C) fonksiyonel SERT elüsyonu. FSEC (Şekil 2D, E) ile değerlendirildiği gibi Elüt edilen protein, büyük ölçüde, Coomassie mavi boyanması yolu ile, diğer tespit proteinlerin serbest ve tek dağılımlı olduğunu. Benzer bir strateji, reconstitutio için kullanılan bir Strep II etiketiyle SERT saflaştırmak için alındın ve aşılama (Şekil 3A, B). proteoliposomes halinde SERT eklenmesi SERT serum yarı-ömrü ve stabilitesini artırır ve yüksek afıniteli antikorların izole edilmesi ihtimalini arttırır. Bundan başka, lipid A dahil, bakteri hücre duvarının bir bileşeni olan güçlü bir yardımcı madde 9 olarak hizmet eder. Çok katmanlı lipozomlar cam tüplerde bir kurutulmuş lipid karışımına tampon maddesinin eklenmesi ile hazırlanmış ve tampon maddesi içinde yeniden süspansiyona alınmıştır. 200 nm gözenek büyüklüğü filtrelerden lipozomların Ekstrüzyon tek dağılımlı tek lamelli lipozom süspansiyonları üretir. Lipozomlar daha sonra deterjan saflaştırılmış SERT ilave edilir deterjan ile doymuştur. deterjan karışımı: Son olarak, deterjan lipide hidrofobik emici reçinenin eklenmesiyle kaldırılır. Ek ligand antidepresan bağlı yapısını tanıyan antikorları seçmek için yeniden örnek eklenmelidir. proteoliposomes içinde SERT varlığı ile teyit edilmelidirSDS-PAGE yükleme boya veya C12M olan küçük bir örnek çözündürülmesi ve SDS-PAGE ve FSEC (Şekil 3C, D) üzerinde çalışan. SERT antikorları eksprese eden hibridoma hücre çizgileri 3D epitopları tanıyan yüksek afiniteli bağlayıcılar için taranabilir. Antikor sıkıca homojen, iyi sıralı etki kristal ambalaj teşvik etmek yapılandırılmış bölgeye bağlı kalmalıdır gibi bu özellikler, kristalleşme nihai başarısı için çok önemlidir. İlk adımda, yapısal olmayan bölgeleri tanıyan antikorlar tanımlanmıştır. SERT denature edilir ve bir nitroselüloz zarı üzerine beneklendirilmiştir; denatüre SERT bağlanan antikorlar batı-pozitif ve büyük olasılıkla lineer epitopları tanıyacaktır. Şekil 4A, biz batı-pozitif ve crystallogenesis teşvik etmek olası yararlı değildir antikorların 2 örneklerini göstermektedir. Şekil 4B&#39;de, diğer Batı negatif antikorlar 100 nM SERT-GFP ile kuluçkaya yatırılır ve ayrılmışFSEC. SERT önceki bir konuma GFP pozitif tepe kayacak bağlayan antikorlar. SERT-antikor kompleksleri FSEC ile analiz ardından nanomolar afinite ile bağlanan belirlemek için başka deterjan seyreltilebilir. yapısal taşıyıcı değişiklikleri ve böylece antikorlar serotonin sonuçları eklenmesi de özellikle SSRI bağlı yapısını kabul belirlemek için tekrar elenebilir edilebilir. Şekil 4C&#39;de, antikorlar, epitop (lar) ilişkili bir durumu substrat SSRI arasında değişmez gösteren serotonin mevcudiyetinde SERT bağlandığı gösterilmiştir. Son olarak, Şekil 4D&#39;de antikorların kombinasyonları daha sola doğru bir kayma ile sonuçlanır, apayn epitopları bağlanma yetenekleri açısından test edilir. Burada 15B8 veya 8A11 antikorlar 8B6 farklı bir epitopu tanır. 8B6 antikor papain Akne tedavi edici ile ön kristal tarama dayalı daha fazla yapısal analiz için seçildited Fab. 8B6 Fab genler, bir böcek hücresi sentezleme vektörüne klonlanmıştır. Fab ifade süspansiyon içinde büyüyen Sf9 hücrelerinden salgılanabilir. 8B6 Fab His-tag afinite (Şekil 5a, b) ve SDS-PAGE jelleri üzerinde yabancı maddelerden arındırılmış görünen protein elde katyon değişim kromatografisiyle (Şekil 5C, D) Sf9 hücre yüzer saflaştırılabilir. Şekil 5E&#39;de, yeniden birleştirici 8B6 Fab SERT bağlandığı gösterilmiştir ve sonraki biyokimyasal ve biyofiziksel deneylerde kullanılır. Eğilim saf hale getirilmiş SERT CC trombin ve EndoH ile sindirilmiş ve S -citalopramın mevcudiyetinde bir kompleks oluşturmak için 8B6 Fab ile karıştırılır. Taşıyıcı-antikor kompleksi, daha sonra C8M (Şekil 6A) SEC ile ayrılır ve SDS-PAGE (Şekil 6B) ile gösterildiği gibi, en yüksek fraksiyonlar eki ve Fab ikisini de içerir. C8M kullanımı kristal oluşumu muhtemelen için çok önemlidirkısa zincirli deterjan kristal kafes içinde moleküller arasında daha iyi ambalaj sağlar. FSEC kristalizasyon için toplanmış hangi fraksiyonlar belirlemek için kullanılmıştır (Şekil 6C); tek dağılımlı değildir ve / veya serbest SERT veya Fab büyük miktarlarda içeren fraksiyonlar kombine edilmemelidir. Prizma şeklindeki SERT-antikor kristaller damla buhar difüzyonu (Şekil 7A) asılarak Bu protokol kullanılarak S -citalopramın mevcudiyetinde yetiştirilebilir. Oluşan kristaller 3.15 Å 10 (Şekil 7B) bir çözünürlük X-ışınları yaymak. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig1.jpg" /> Şekil 1:. Sintilasyon Termostabilite Deneyi A Yakınlık tabanlı. [3H] sitalopram. B mevcudiyetinde termostabilite taranması için protokol bakış. En bağlanmış [3 </belirgin erime sıcaklığı (Tm) karşı destek&gt; H] sitalopram. Noktalı çizgiler WT taşıyıcısı değerlerini temsil etmektedir. 3 En termostabil mutantlar etiketlenir. Gri alanı nedeniyle düşük sinyal-gürültü. C WT ve dolayısıyla doğru olmayan Tm değerlerine kıyasla bağlanan [3H] sitalopram% 10&#39;dan daha az olan mutantlar temsil eder. WT SERT TC ve ilk 3 mutantlar için termostabilite eğrileri. Hata çubukları standart sapmayı (SD) temsil etmektedir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig2.jpg" /> Şekil 2:. Memeli Heterolog Protein Ekspresyonu A Genel Bakış. HEK293S GnTI içinde BacMam virüs üretimi ve SERT ifade şematize bakış -. Hücreler B. HEK293S GnTI -. SERT CC (GFP floresans) Cı ifade eden hücreler. Strep afinite reçine SERT CC elüsyon profili. % 100 (0 - - 5 mM) D. Yeşil iz destiyobiyotin konsantrasyonunu, 0 temsil eder. % 15 SDS-PAGE jeli e -. 4 üzerinde yakınlık saf hale SERT CC analizi. GFP floresans tespit afinite saflaştırılmış SERT CC FSEC (eksitasyon: 480 nm; emisyon: 510 nm). 15 mL akıtılarak zirve SERT (#) ve 18 ml ücretsiz GFP (*) &#39;dir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54792/54792fig3.jpg" /> Şekil 3:. SERT IC A Temsilcisi Affinity Arıtma ve Sulandırma. Antikor nesil şematik bakış. &lt;strong&gt; B. Elüsyon profili Strep afinite reçinesi üzerinde SERT IC afinite saflaştırma 280 nm&#39;de gözlendi. % 100. (0 - - 5 mM) C yeşil iz destiyobiyotin konsantrasyonunu, 0 temsil eder. Afinitesi analizi saf hale getirilir ve bir 4 SERT yeniden -% 15 SDS-PAGE jeli D.. yeniden çözme aşamalarından sonraki çözündürülmüş SERT&#39;in FSEC. Triptofan artıklarının floresan SERT (: 280 nm; Emisyon: Uyarma 335 nm) tespit etmek için kullanılmıştır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54792/54792fig4.jpg" /> Şekil 4:. Temsilci SERT Antikorların Analizi. Western blot ile antikorların taranması. Yaklaşık 1 mikrogram GFP ile veya olmadan SERT CC 4 uygulandı -% 15 SDSPAGE jel ve bir nitroselüloz zarı üzerine beneklendirilmiştir. Bağlama IR boyası konjüge edilmiş bir keçi anti-sıçan antikoru kullanılarak tespit edildi. 2G4 ve 10F2 batı olumlu. B bulunmaktadır. FSEC 100 nM GFP etiketli eki ve algılama antikorların bağlanma GFP floresan kullanılarak tespit edildi. C. 1 mM serotonin. D varlığında 100 nM GFP etiketli Sert seçilen Fab&#39;ların bağlanması. 8A11 ve 15B8 Fab&#39;ın bağlanma SERT-8B6 için Fab. 18 mL akıtılarak minör zirveleri ücretsiz GFP vardır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54792/54792fig5.jpg" /> Şekil 5: Sf9 hücrelerinden 8B6 Fab&#39;ın Örnek saflaştırılması için uygun değildir.. Elüsyon profili His-tag afinite kromatografisi yolu ile 8B6 Fab saflaştırılması 280 nm&#39;de gözlenmiştir<html> hy. % 50 (0 - - 250 mM) B. Yeşil iz imidazol konsantrasyonunu, 0 temsil eder. Indirgeyici olmayan ve His-etiketi afinite saflaştırmadan sonra, SDS-PAGE jeli azaltır. 50 kDa yakınına kadar protein indirgenmemiş Fab (#) ve kDa Fab (*). C azalır 25 ° küçük bir türdür. Elüsyon profili, doğrusal bir sodyum klorür gradyanı altında elüt edilmektedir tek simetrik tepe gösteren katyon değişimiyle 8B6 Fab saflaştırılması 280 nm&#39;de gözlendi. % 100. (0 - - 500 mM) D yeşil iz NaCl konsantrasyonu, 0 temsil eder. Katyon değişim. E ile saflaştırma sonrasında% 12.5 SDS-PAGE jeli üzerinde 8B6 Fab analizi. GFP floresan kullanılarak tespit, 10 nM GFP etiketli SERT için 8B6 Fab bağlanması. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> e 6 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54792 / 54792fig6.jpg &quot;/&gt; Şekil 6:. Varlığı S -citalopram A SERT-8B6 Kompleksi&#39;nin Temsilcisi Jel Filtrasyon Kromatografisi. saflaştınldı SERT-8B6 kompleksinin Jel filtrasyon elüsyon profili. 11.5 mL elüsyon ana pik SERT-8B6 kompleksidir. 15 tepe -. 17 mL GFP ve Fab B içerir. % 15 SDS-PAGE jeli - 4 üzerinde saflaştırıldı SERT-8B6 kompleksi analizi. SERT ve Fab ağır ve hafif zincirlerinin pozisyonları tire. C ile gösterilir. beden ayrılan fraksiyonların FSEC. SERT-8B6 kompleksleri triptofan floresan kullanılarak tespit edildi. Fraksiyon 17 Fab ile kompleks vermedi SERT daha büyük bir miktarda içerir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7,"src = &quot;/ files / ftp_upload / 54792 / 54792fig7.jpg&quot; /&gt; Şekil 7:. S -citalopram A Bound SERT-8B6 Kompleksinin Kristalizasyon. büyüme 2 hafta sonra SERT-8B6 kompleksinin paralel yüzlü şekilli kristallerin ışık mikroskobu. Ölçek çubuğu 200 mikron. B eşittir. SERT-8B6 kristalleri 3.15 Å X-ışınları yaymak. Mavi halka 3.15 Å temsil eder. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Tablo 1:. S -citalopramın Bound SERT-8B6 Kompleksi için bir Kristalizasyon Ekranı <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792table1.xlsx">Bu tabloyu indirmek için tıklayınız.</a>

Bu el yazması, mutasyonlar termo için ekran insan serotonin taşıyıcı arındırmak, yüksek afiniteli antikorların üretilmesi ve antidepresan ilaç S -citalopramın bağlı serotonin taşıyıcı-antikor kompleksi kristalize açıklamaktadır. Bu protokol için diğer zor membran ileticileri, reseptör ve kanal çalışması için adapte edilebilir.

Termo, İfade, saflaştırılması, ve İnsan serotonin Transporter Kristalizasyon Bound<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Bu prosedürün genel amacı, yapısal çalışmalar için yeterince kararlı bir taşıyıcı oluşturmak ve bu modifiye edilmiş taşıyıcıyı, X-ışını kristalografisi ile yüksek çözünürlükte kırınım yapan kristaller üretmek için kullanmaktır. Bu yöntem, önemli ilaç hedefleri olan membran proteinlerinin yapısının nasıl çözüleceği gibi yapısal biyoloji alanındaki temel sorulara yanıt verebilir. Bu tekniğin temel avantajı, fonksiyonel bir analiz kullanılarak ilaçla bağlı bir konformasyonun seçilmesine olanak tanımasıdır.Bu yöntem nörotransmitter taşıyıcıları hakkında bilgi sağlayabilse de, küçük molekülleri yüksek afinite ile bağlayan reseptörlere, kanallara ve çözünür proteinlere de uygulanabilir. Tripsinizlenmiş HEK293S GnTI minus hücrelerini, %10 fetal bovine serum ile desteklenmiş DMEM içinde, tek kullanımlık bir pipet rezervuarında mililitre başına 0,5 milyon hücre yoğunluğuna gelecek şekilde tamamen resüspande edin. Çok kanallı bir pipet kullanarak, poli-D-lizin kaplı bir plakanın her kuyucuğuna 100 µL hücre ekleyin.Hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için her plakayı doldurduktan sonra hücreleri pipet rezervuarında yeniden süspande edin. Hücreleri 37 °C sıcaklıktaki %8 karbondioksit içeren inkübatörde inkübe edin. Transveksiyon işleminden bir saat önce hücre besiyerini değiştirin.Taranacak olan cert TC arka planındaki her bir konstrükt için 450 nanogram DNA'yı 45 mikrolitre serumsuz DMEM ile karıştırarak DNA transveksiyon reaktif komplekslerini hazırlayın. Ardından, 1,6 mikrolitre transveksiyon reaktifini 45 mikrolitre serumsuz DMEM'e ekleyin ve karıştırın. Seyreltilmiş transveksiyon reaktifi çözeltisini derhal DNA çözeltisine ekleyin ve karıştırın.Çözeltileri ters sırada karıştırmayın. Transveksiyon reaktifi DNA karışımının 20 µL'sini kuyucukların dördüne eklemeden önce 10 ila 15 dakika bekleyin. Hücreleri 200 nM citalopram ve 25 µL TBS ile oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.Hücreleri çözünür hale getirmek için, TBS içinde 25 µL 8 mM C12M, 1 mM CHS ve proteaz inhibitör kokteyli ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, her bir konstrükt için üç kuyucuğa 20 nM trityumla işaretli sitalopram, %0,1 sığır serum albümini ve mg/mL his tag afinite sintilasyon yakınlık analizi veya SPA boncukları içeren 50 µL TBS ekleyin.Son kuyucuk için aynı TBS çözeltisini ekleyin, ancak spesifik olmayan bağlanmayı belirlemek için 100 micromolar sertraline ile takviye edin. His etiketi afinite SPA Boncuklarını 96 kuyucuklu plakaya eklerken iyice karıştırıldıklarından emin olun. Trityumlu citalopram bağlanmasını, oda sıcaklığında, kuyucuk başına bir dakikalık sayım süresiyle 96 kuyucuklu bir sintilasyon sayacı kullanarak ölçün.Toplam sayımlar yaklaşık 36 saatte platoya ulaşana kadar plakaları saymaya devam edin. Ölçümün ardından, plakaları ısıtmalı kapağa sahip bir ısıtma bloğunda 33 °C'de 15 dakika boyunca ısıtın. Isıtma işleminden sonra tritiyum işaretli citalopram bağlanmasını tekrar ölçün.Isıtma adımını modifiye ederek bu adımları tekrarlayın. Isıtma sıcaklıklarını, hedef proteinin görünür erime sıcaklığına ve en stabil konstrüktun termostabilitesine göre ayarlayın. Tüm konstrüktlar düşük spesifik sayımlara ulaşana kadar plakaları ısıtmaya devam edin.HEK293S GnTI minus hücrelerini, 130 RPM hızında bir çalkalayıcıda, %8 karbondioksit ve %85 nem ile 37 °C'de, %2 fetal bovine serum ile takviye edilmiş 293 ekspresyon besiyerinde süspansiyon şeklinde büyütün. 10 litre hücreyi, iki enfeksiyon çokluğu (MOI) ve mililitre başına üç milyon hücre yoğunluğunda P2 virüsü ile enfekte edin. Enfeksiyondan 12 ila 16 saat sonra, bir molar stoktan 10 mM konsantrasyona ulaşacak şekilde sodyum bütirat ekleyin.Enfeksiyondan 48 ila 60 saat sonra, hücreleri 15 dakika boyunca 4.000 ×g'de santrifüj ederek hasat edin. Süpernatantı uzaklaştırın. Hücreleri, 2 µM essitalopram veya diğer SERT inhibitörleri içeren 150 mL TBS içerisinde yeniden süspande edin.10 litre kültürdeki hücreleri yaklaşık 30 °C sıcaklıktaki ılık suda toplayın ve homojen hale gelene kadar hücreleri hızlıca bir 10 ml pipetle geçirerek yeniden süspanse edin. Tüm hücreleri manyetik karıştırıcılı bir behere aktarın ve karıştırma işlemi sırasında tüm deterjan çözeltisini hücrelerin üzerine ekleyin. Hücreleri 4 °C'de bir saat boyunca karıştırarak solubilize edin.Lizatı 4 °C'de 15 dakika boyunca 8,000 ×g hızında santrifüjleyin. Süpernatantı temiz ultra santrifüj tüplerine aktarın ve peleti atın. Ardından, süpernatantı bir ultra santrifüjde bir saat boyunca 100,000 ×g hızında santrifüjleyin.Ultra santrifüj işleminin ardından, süpernatantı 0.2 mikronluk bir filtreden süzün ve pelleti atın. Daha sonra, lizatı, yıkama tamponu ile dengelenmiş ve bir kolona doldurulmuş 10 mililitre strep afinite rezininden, perisaltik bir pompa kullanarak geçirin. Ardından, bir strep afinite kolonunu hızlı protein sıvı kromatografisi sistemine bağlayın ve kolonu, dakikada iki mililitre hızla 66 mililitre yıkama tamponu ile yıkayın.Saflaştırılmış proteini, 5 mM desthiobiotin eklenmiş aynı yıkama tamponu ile 0,5 ml/dakika hızında 33 ml tampon kullanarak elüe edin. 1 ml'lik fraksiyonlar toplayın. Pik fraksiyonlar yaklaşık olarak 10 ml olacaktır.Taşıyıcı antikor komplekslerini oluşturmak için önce, etiketleri uzaklaştırmak amacıyla trombin ile ve deglikozilasyon için Endo H ile saflaştırılmış proteini oda sıcaklığında gece boyunca sindirin. 100 kilodalton moleküler ağırlık kesim noktalı santrifüj protein konsantratörü kullanarak proteini 10 mg/mL konsantrasyona ve 250 ila 300 µL hacme konsantre edin. Konsantre SERT proteinini, 500 µL'den daha az bir hacimde, 1 ila 1,2 molar oranında 8B6 Fab ile karıştırın.Karışımı 100,000 ×g'de ve 4 °C'de 20 dakika boyunca santrifüj edin. Santrifüj işleminin ardından, SERT Fab kompleksini içeren süpernatanı toplayın ve peleti atın. Kompleksi, boyut dışlama kolonunda hızlı protein sıvı kromatografisi kullanarak ayırın.Sistemi, dakikada 0.5 mL hızında takviye edilmiş TBS ile dengeleyin. Kristalizasyon öncesinde, kompleks ayırmadan elde edilen pik fraksiyonları, 100 kDa moleküler ağırlık kesme limitli bir santrifüj protein konsantratörü kullanarak 2 mg/mL konsantrasyona getirin. 280 nm'de iki AU'luk bir absorbans, 1 mg/mL'ye eşittir.Komplekse karşı serbest Fab oranı 1:0,05 olacak şekilde ek Fab ekleyin. Ayrıca 10 µM serbest S-sitalopram ekleyin. Numuneyi santrifüj ettikten sonra, SERT Fab kompleksini içeren süpernatanı toplayın ve pellet kısmını atın.Metin protokolündeki tablo bire göre, 4 °C'de asılı damla 24 kuyucuklu tarama düzeneği kurun. Her kuyucuğa sızdırmazlık malzemesi uygulanmış düşük profilli 24 kuyucuklu bir plakadaki her bir rezervuar çözeltisinden 500 µL pipetleyin. 18 mm'lik silikonize cam lam üzerine 1,5, 1,75 ve 2 µL SERT Fab kompleksini pipetleyin.Ardından, protein örneğinin üzerine bir mikrolitre rezervuar çözeltisi pipetleyin. Tekil kristaller yaklaşık üç gün içinde ortaya çıkacak ve 14 gün sonra 100 ila 175 mikrometre boyutuna ulaşacaktır. Burada, trityumlanmış citalopram varlığında termostabilite taraması için temsili sonuçlar gösterilmektedir.Maksimum bağlanmaya karşı çizilen erime sıcaklığı değerleri, yüksek termostabilite ve ekspresyona sahip mutantları göstermektedir. Burada, vahşi tip SERT TC ve en iyi üç mutant olan Y110A, I291A ve T439S'nin termostabilite eğrileri sunulmuştur. Bu mikroskopi görüntüsü, hücre membranında yeşil floresan bulunan ve SERT CC eksprese eden HEK293S GnTI minus hücrelerini göstermektedir.SERT CC'nin floresan tespitli boyut dışlama kromatografisi, 15 mililitrede majör bir pik göstermektedir. SDS-PAGE analizi, büyük ölçüde kontaminantlardan arındırılmış tek bir protein türü sergilemektedir. Taşıyıcı antikor komplekslerinin boyut dışlama kromatografisi ile temsili ayrımı gösterilmiştir.SDS-PAGE jelinde gösterildiği üzere, 11,5 mililitrede elüye olan ana pik hem SERT hem de Fab içeriyordu. İki haftalık büyümeden sonra S sitaloprama bağlı SERT antikor kompleksinin ışık mikroskobu görüntüleri, yaklaşık 100 ila 175 mikron boyutunda prizma şeklinde kristaller göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, bir membran proteinini ligand bağlı konformasyonda stabilize eden mutasyonların nasıl tanımlanacağı ve protein antikor kompleksleri ile kristalizasyon taramalarının nasıl kurulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Bu prosedür uygulanırken, ligandların SERT TC'nin stabilizasyonu için gerekli olduğu ve SERT CC'nin kristalizasyonu için temel teşkil ettiği unutulmamalıdır. SERT, birçok antidepresan ilacın moleküler hedefi olduğundan, bu tekniğin etkileri psikiyatrik durumların tedavisine kadar uzanmaktadır. Bu prosedürün ardından, saflaştırılmış SERT'in fonksiyonu biyokimyasal ve biyofiziksel yöntemler kullanılarak karakterize edilebilir.

thermostabilization-expression-purification-crystallization-human

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Protokolleri LCP kristalizasyon denemeler ve hasat kristalleri kurma, LCP-sıkı bağlamak kristalleşme öncesi testlerin başlangıç ​​koşulları bulma lipidik kübik bir fazlı (LCP) protein, sulandırıldıktan itibaren bir membran proteini kırınım kaliteli kristaller elde etmek için gerekli adımları açıklar .

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Kristallendirilmesi

Heterolog ifade ve kistik fibrozis transmembran iletkenlik regülatör (CFTR) saflaştırılması önemli sorunlar ve kistik fibrozis için ilaç tedavilerinin gelişiminde sınırlayıcı faktörler. Bu protokol, yapısal ve işlevsel çalışmalar için uygun CFTR miligram miktarları izolasyonu için iki yöntem açıklanır.

Olarak ifade edilmiştir kistik fibroz transmembran kondüktans regülatörü Protein Saflaştırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Bu, salgılanan, glikosile edilmiş memeli proteinlerinin üretimi ve ardından X-ışını kristalografisi ve diğer biyofiziksel çalışmalar için yeterli homojen protein verimi ile tek aşamalı saflaştırma için hızlı, uygun maliyetli bir protokoldür.

Verimli memeli hücre ekspresyon ve Kristalizasyon için hücre dışı Glikoproteinlerin Tek aşamalı saflaştırma

Escherichia'dan denatüre edici olmayan koşullar altında, kodon-optimize edilmiş insan cis- preniltransferazın aşırı ekspresyonu ve saflaştırılması için basit bir protokol   Coli , bir enzimatik aktivite tahlili ile birlikte anlatılmıştır. Bu protokol, mekanik çalışmalara uygun miktarda ve kalitede diğer cis- prenyltransferase proteinlerinin üretimi için genelleştirilebilir.

Aşırı Ezme ve İnsanın Saflaştırılması Cis -prenıltransferaz in Escherichia coli

Bu makalede biyokimyasal miktarda deterjan çözündürüldükten TRPV1 spektroskopik analiz için elde için belirli yöntemleri açıklar. Kombine protokoller memeli iyon kanalları membran kontrollü bir ortamda yapısal ve fonksiyonel çalışmaları kolaylaştırmak için uyarlanmış Biyokimya ve biyofizik araçları sağlar.

Arıtma ve TRPV1 sulandırma spektroskopik analizi için

Bu iletişim kuralı tarafından cryo-elektron mikroskobu, verimli bir şekilde en az çaba ve toksisite, protein ayıklama, arıtma ile memeli hücrelerinde genlerin ifade etmek için kullanılan bir baculovirus sistemi de dahil olmak üzere iyon kanal yapılarını belirlemek için kullanılan teknikler açıklanır, ve kalite kontrol, örnek kılavuz hazırlık ve tarama, hem de veri toplama ve işleme.

İfade ve insan Lipid duyarlı ba * kanal TRPC3 arınma için tek-parçacık Cryo-elektron mikroskobu ile yapısal kararlılık

Burada hızlı, solubilize ve birçok ökaryotik Bor taşıyıcılar homoloji Maya kullanarak SLC4 taşıyıcı ailesi ile arındırmak için bir protokol mevcut. Ayrıca saf homomeric protein multimeric derleme için değerlendirmek için bir kimyasal cross-linking tahlil açıklar. Bu protokoller için zorlu diğer membran proteinlerinin adapte edilebilir.

İfade, Solubilization ve ökaryotik Bor taşıyıcılar arıtma

Bu makale, Salmonella tiphimurium triptofan sintazının ekspresyonu ve saflaştırılması için bir dizi ardışık yöntem sunar, bu protokol protein kompleksini bir günde arındırmak için hızlı bir sistemdir. Kapsanan yöntemler escherichia coliprotein ekspresyözü, benzeşim kromatografisi, jel filtrasyon kromatografisi ve kristalizasyondur.

PCR Mutagenezi, Klonlama, İfade, Hızlı Protein Saflaştırma Protokolleri ve Triptofan Synthase'in Vahşi Tipinin ve Mutant Formlarının Kristalizasyonu

İnsan zarı taşıyıcılarının yapısal ve biyokimyasal çalışmaları, miligram miktarlarda kararlı, sağlam ve homojen protein gerektirir. Burada, kodon için optimize edilmiş genleri kullanarak insan çözünen taşıyıcı taşıyıcıları taramak, eksprese etmek ve saflaştırmak için ölçeklenebilir yöntemleri açıklıyoruz.

Yapısal ve biyokimyasal çalışmalar için insan çözünen taşıyıcılarının yüksek verimli ekspresyonu ve saflaştırılması

Burada, S100A12'yi (calgranulin C) ifade etmek ve saflaştırmak için bir yöntem sunuyoruz. İnsan patojen H. pylori'ye karşı antimikrobiyal aktivitesini ölçmek için bir protokolü açıklıyoruz.

S100A12&#39;nin Ekspresyon, Saflaştırma ve Antimikrobiyal Aktivitesi

Öğrenin insan serotonin taşıyıcısının termostabilizasyon, saflaştırma ve kristalleştirme yöntemlerini. Bu protokol zorlu membran proteinlerinin yapısal biyoloji çalışmaları için uyarlanabilir.

Termo, İfade, saflaştırılması, ve İnsan serotonin Transporter Kristalizasyon Bound

Daha fazla video keşfet