Name: Asma Bırak Yöntemiyle Fare Embriyonik Kök (MES) Hücreler in vitro Farklılaşma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-23T22:33:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Öğrenin fare embriyonik kök hücrelerinin asma bırak yöntemiyle in vitro farklılaşmasını. Bu teknik embriyoid cisim oluşumunu sağlayarak rejeneratif tıp araştırmalarına katkıda bulunur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li> T75 şişesi önce 37 ° C,% 5 CO 2 doku kültürü inkübatör gecede bir gün içinde% 0,1 jelatin solüsyonu ve inkübe plaka kullanarak jelatinleştirmeye. </li><li> Inkübe gelen MES hücreler dışarı atın, orta aspirat, PBS ile ES hücre kültürü durulama, çanak alt kat (2 ml/100mm plaka)% 0.05 tripsin çözüm ekleyin. </li><li> Tabak kapatın hücrelerinin dökülmesi kadar, 37 ° C&#39;de yaklaşık 1 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Yavaşça (pipetlemeyin yukarı ve aşağı) bir takılı Pasteur pipeti ile 4-6 kez ES hücreleri dağıtmak için tripsinize hücreleri, çiğnemek. Prewarmed (37 ° C), orta (MES) içeren 15 ml konik santrifüj tüpü içine dağılmış ES hücrelerinin transferi. </li><li> Santrifüj hücreleri toplayın. Süpernatantı aspire MES orta 10 ml ekleyin ve bir tek hücre süspansiyon formu için yukarı ve aşağı pipetle. </li><li> 37% 0.1 jelatin ve inkübe ile kaplı ön T75 balona hücre süspansiyonu Transfer ° C, bir saat süreyle% 5 CO2 * Bir saat sonra, fibroblastlar plakasına bağlı ama kök hücreler orta kalır. Kök hücreleri toplamak için orta Pipet. </li><li> 1000 rpm&#39;de 5 dakika boyunca hücreleri Spin ve MES orta aspire. Sonra başka bir 10 ml MES farklılaşma orta ekleyin ve hücrelerin ince bir süspansiyon var görünene kadar tekrarlayan pipetleme hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Kök hücre süspansiyonu steril bir havza 20ul (20ul/drop) başına 400 ila 500 hücreden bir konsantrasyon sulandırmak için hemasitometre kullanımı farklılaşması orta hücreleri saymak. </li><li> Kapağı kaldırın, dikkatlice ters ve 10 ml PBS içeren yemeğin üstüne koyun. Bir çok kanallı pipet kullanarak, doku kültürü çanak kapağı yukarı döndü iç yüzeyine 20ul damla satır olun. </li><li> 2 gün boyunca dikkatlice inkübatör tabak koyun. İki gün sonra, dikkatle plaka kapağın üzerine açmak 180 ul taze farklılaşması orta aspirat ve 96 kuyu, ultra eki plaka kuyunun içine birkaç damla koymak. Sonra bırak pipet ve transfer damla, bire-bir, 96 plaka ile pikap. Plakalar 3 gün boyunca rahatsız kuvöz içine yerleştirin. </li><li> Coat her iyi jelatin 0.1% 300ul ile 48 iyi doku kültürü plakası. Jelatin ekledikten sonra, 37 gecede plaka inkübe ° C bir gün öncesinde önce Ebs aktarmak. </li><li> Ertesi gün, 48 plaka jelatin aspirat. Sonra her bir kuyunun 300 ul farklılaşması orta ekleyin. 96 kuyucuğu EBS iyi 48 jelatin kaplı plakaları tek-tek aktarın. Ertesi gün orta değiştirin ve sonra hücreleri korumak için her gün orta değiştirmek. </li><li> Spontan cardiaomyocyte kasılmaları 7 gün içinde belirgin olmalıdır. </li></ol>

<ol><li>Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+mouse+embryonic+stem+cells+are+able+to+differentiate+into+cardiomyocytes+expressing+chronotropic+responses+to+adrenergic+and+cholinergic+agents+and+Ca2%2B+channel+blockers%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers.</a> Differentiation. 48, 173-182 (1991).</li>
<li>Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+in+cardiac+contractile+sensitivity+to+calcium+during+the+in+vitro+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> J Cell Biol. 126, (1994).</li>
</ol>

: Bir damla sıvı hacmi, yüzey gerilimi kapağı nedeniyle asılı damla korumak için daha az 50ul sınırlı ve damla asılı orta değiştirmek imkansız asılı damla yöntemi dezavantajları aşağıdaki gibidir. Mikroskobu ile doğrudan damla EBS oluşturan Gözlem ekimi sırasında da çok zordur. Dahası, asılı damla yöntemi iki aşamadan oluşur, bu nedenle, asılı damla yöntemi adım bir dizi sorun olabilir.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Reaktif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Reaktif</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Reaktif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Esansiyel Olmayan Amino Asitler</td><td>Reaktif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Reaktif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Piruvat</td><td>Reaktif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11360-70</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>Reaktif</td><td>Chemicon International</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>lösemi inhibitör faktörü (LIF)</td><td>Reaktif</td><td>Chemicon International</td><td>LIF2005</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyucuklu ultra düşük yapışmalı plaka</td><td>Ekipman</td><td>Corning</td><td>3474</td><td></td></tr></tbody></table>

asma bırak yöntemiyle fare embriyonik kök (mes) hücreler in vitro farklılaşma

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

Kök hücreler birçok farklı hücre türleri geliştirmek için olağanüstü bir potansiyele sahiptir. Bir kök hücre böler, her yeni hücre, ya da bir kök hücre kalır veya daha uzmanlaşmış bir fonksiyonu ile başka bir tür hücre haline potansiyele sahiptir, bilim Bu umut verici bir hastalığın tedavisi için hücre tabanlı tedavi olasılığını araştırmak için bilim adamları lider. Antidifferentiation faktörleri olmadan süspansiyon kültür, embriyonik kök hücreler kendiliğinden farklılaştırmak ve üç boyutlu çok hücreli bir araya toplanırlar. Bu hücre agrega embriyoid organları (EB) olarak adlandırılır. Açılan kültür Asma yaygın olarak kullanılan bir EB oluşumu indüksiyon yöntemi. Asılı damla yuvarlak alt MES hücreleri oluşturan EBS için iyi bir ortam sağlayabilir ES hücrelerinin toplama sağlar. Petri kabı kapağı bir damla gibi asılı ilk hücre süspansiyon hücrelerinin sayısını değiştirerek asılı açılan aggregatied ES hücrelerinin sayısı kontrol altına alınabilir. Bu yöntemi kullanarak tekrarlanabilir ES hücrelerinin belli sayıda homojen EBS oluşabilir.

Bu video asılı bırak yöntemini kullanarak embriyoid organları fare embriyonik kök hücreleri in vitro farklılaşması nasıl yürütüleceğini gösteriyor.

Asma Bırak Yöntemiyle Fare Embriyonik Kök (MES) Hücreler in vitro Farklılaşma

Kök hücreler, birçok farklı hücre tipine dönüşebilme yönünde dikkat çekici bir potansiyele sahiptir. Bir kök hücre bölündüğünde, her yeni hücre ya ...

Kök hücreler, vücuttaki birçok farklı hücre tipine dönüşebilme konusunda dikkat çekici bir potansiyele sahiptir. Vücut için bir tür onarım sistemi görevi görürler. Teorik olarak, diğer hücreleri yenilemek için sınırsız bir şekilde bölünebilirler.Bir kök hücre bölündüğünde, her yeni hücre ya bir kök hücre olarak kalma ya da daha özelleşmiş bir işleve sahip başka bir hücre tipine dönüşme potansiyeline sahiptir. Bilimin bu gelecek vadeden alanı, bilim insanlarını hastalıkları in vitro tedavi etmek için hücre tabanlı tedavilerin olasılığını araştırmaya yöneltmektedir. Embriyonik kök hücrelerin farklılaşması, hücrelerin süspansiyon kültüründe kümelenmelerine izin verildiğinde gerçekleşir.Fare embriyonik fibroblast besleyici hücreler ve lösemi inhibitör faktörü yokluğunda, bu hücre agregatlarına embriyo gövdeleri denir. Asılı damla yöntemi, kök hücrelerin in vitro ortamda embriyo gövdelerine farklılaşması için etkili bir prosedürdür. Merhaba, ben Stanford Üniversitesi Kardiyovasküler Tıp Bölümü'nden Sha Juan.Bugün sizlere, el damlatma yöntemini kullanarak embriyonik kök hücrelerin embriyoid cisimciklere bireysel farklılaşması için uygulanan bir prosedürü göstereceğiz. Bu yöntemi genellikle embriyonik kök hücreleri kardiyomiyositlere farklılaştırmak için kullanırız. Bu prosedür; embriyonik kök hücrelerden tek hücre süspansiyonu hazırlama, el damlatma kültürleri oluşturma, el damlatma kültürlerini ultra düşük yapışmalı plakalara aktarma ve embriyoid cisimcikleri jelatin kaplı plakalara ekme adımlarını içermektedir.Tamam, başlayalım. Prosedürün ilk adımı, embriyonik kök hücrelerden tek hücre süspansiyonu hazırlamaktır. Diferansiye olmamış embriyonik kök hücrelerimizi fare embriyonik fibroblastları üzerinde büyüterek kültüre ettiğimiz için, hücreleri ayırmalı ve fibroblastlardan uzaklaştırmalıyız.Bunu yapmak için, hücreleri standart prosedürleri kullanarak tripsinize ederiz. Tripsin işlemi tamamlandığında, tripsini nötralize etmek için fare embriyonik kök hücre besiyeri ekleyin. Ardından, hücre süspansiyonunu 15 ml'lik konik bir tüpe aktarın.Ardından, görünür herhangi bir kümelenme olmadan ince bir hücre süspansiyonu elde edene kadar, tüpün dibine karşı pipetleyerek hücre kolonilerini parçalayın. Şimdi hücreleri beş dakika boyunca 1000 RPM hızda santrifüj edin. Santrifüj işleminden sonra süpernatanı aspire edin ve hücreleri 10 mL mouse ES hücre besiyeri ile yeniden süspanse edin.Hücre süspansiyonunu %0,1 jelatin ile önceden kaplanmış bir T 75 flaska aktarın ve 37 °C sıcaklıkta, %5 CO2 ortamında bir saat boyunca inkübe edin. Bir saat sonra, fibroblastlar plağa tutunmuş olacak ancak kök hücreler medyumda kalacaktır. Kök hücreleri toplamak için medyumu pipetle çekin.Hücreleri 1000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve ortamı aspire ederek uzaklaştırın. Ardından 10 mL daha diferansiyasyon medyumu ekleyin ve hücrelerin ince bir süspansiyon oluşturduğu görülene kadar tekrarlayan pipetleme ile hücreleri yeniden süspande edin. Hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın.Şimdi, asılı damla yöntemini kullanarak hücre süspansiyonunu kültüre etmeye hazırız. Asılı damla kültürüne başlamak için, kök hücre süspansiyonunu 20 mikrolitrede 500 hücre konsantrasyonuna getirmek amacıyla farklılaşma medyumu ile seyreltin. Ardından, 150 milimetrelik bir doku kültürü plak kapağını ters çevirin.Ardından, hücre süspansiyonunun 20 µL'sini plaka kapağının iç yüzeyine pipetleyin. Çok kanallı bir pipet kullanarak plakanın üzerine 10 mL PBS ekleyin. Plaka kapağını hızla ters çevirin ve asılı damlacıkları oluşturmak için nazikçe plakanın üzerine yerleştirin.Plaka kapağı kapatıldıktan sonra, plakayı dikkatlice inkübatör kültürüne aktarın. Hücreleri iki gün boyunca rahatsız etmeyin. İnkübasyon tamamlandığında, asılı damla kültürünü ultra düşük yapışmalı plakalara aktarma işlemine geçeceğiz.İki gün sonra, plaka kapağını dikkatlice ters çevirin, ardından 180 µL taze farklılaşma ortamı aspire edin ve birkaç damlayı 96 kuyucuklu ultra düşük yapışma özelliğine sahip bir plakaya damlatın. Daha sonra damlaları bir pipet yardımıyla alın ve tek tek 96 kuyucuklu plakaya aktarın. Plakaları üç gün boyunca rahatsız edilmeden inkübatöre yerleştirin.Embriyo gövdeleri küre şeklinde büyümeye devam edecektir. İnkübasyon tamamlandığında, embriyo gövdelerini ekmeye hazır olacağız. Bu işlem, embriyo gövdelerinin farklılaşmaya devam etmesine yardımcı olmak amacıyla yapılacaktır.Bunları 48 kuyucuklu jelatin kaplı bir plakaya aktarıyoruz. Bunu yapmak için, önce plakanın her kuyucuğunu 300 µL %0,1 jelatin ile kaplıyoruz. Jelatini ekledikten sonra, plakayı 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.Ertesi gün, 48 kuyucuklu plakadaki jelatini aspire edin. Ardından her birine 300 µL diferansiyasyon medyumu ekleyin. Şimdi embriyo gövdelerini 96 kuyucuklu plakadan, jelatin kaplı 48 kuyucuklu plakalara tek tek aktarın.Hücreleri sürdürmek için genellikle ertesi gün ve ardından gün aşırı olarak besiyerini değiştiririz. Embriyonik kök hücrelerin farklılaşması için daha iyi protokoller aramak amacıyla bu yöntemi kullanıyoruz. Kardiyomiyositler kısmında, asılı damla kültürleri kullanarak fare embriyonik kök hücrelerinin in vitro farklılaştırmasının nasıl gerçekleştirileceğini size göstermiş olduk.Bu yöntem etkilidir çünkü asılı damlanın yuvarlak tabanı embriyonik kök hücrelerin agregasyonuna izin verir ve böylece Embriyo cisimciklerinin oluşumu için uygun bir ortam sağlar. Bu prosedürü uygularken, asılı damlada agrege olan embriyonik kök hücre sayısının, başlangıçtaki hücre süspansiyonundaki hücre sayısı değiştirilerek kontrol edilebileceğini unutmamak önemlidir. Hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkürler. Deneyinizde başarılar dileriz.

in-vitro-differentiation-mouse-embryonic-stem-mes-cells-using-hanging

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol detayları fare embriyonik kök hücreler (ESC) ve ölümcül ışınlanmış alıcı farelere sonraki enjeksiyon transplante hematopoietik kök hücre türetme. Kısaca ESC embriyoid organları, sonra retroviral HoxB4 ve OP9 stromal hücreler ve hematopoetik sitokinlerin birlikte kültürlü ile enfekte olarak ayırt edilirler.

Murin Embriyonik Kök Hücre Hematopoetik Kök Hücre türetilmesi

Biz microfabricated kuyu içine hücrelerin önceden tanımlı numaralar yüklemek ve embriyoid vücut gelişimi için onları korumak için basit ve hızlı bir yöntem gösteriyor.

Damlalar Asma Shrinky Dink: embriyoid Organları Formu ve Kültür Basit Yolu

Biz bir fare ES hücre tabanlı testin Wnt / β-katenin ve kardiyojenik indüksiyon sırasında BMP sinyal aktivasyonu için kritik zaman pencere tanımlamak için kullandıklarını açıklarlar. Bu yöntem, güvenilir bir kardiyojenik verimliliği rakamlarla standart bir platform sağlar ve diğer hücre soylarının çalışma için geçerlidir.

Kardiyojenik İndüksiyon Verimlilik miktarının için modifiye Fare Embriyonik Kök Hücre tabanlı Testi

Biz motor nöronlar içine fare embriyonik kök hücreleri in vitro ayrımında verimliliğini artırmak için yeni bir protokol geliştirdi. Farklılaşmış ES hücreleri motor nöronlar gibi immünohistokimyasal teknikler kullanılarak nöron ve motor nöron belirleyicilerin ekspresyonu ile kanıtlandığı özellikleri satın aldı.

Motor Nöronlar içine Fare Embriyonik Kök Hücre Verimli Farklılaşma

Video, fare embriyonik kök hücrelerinin (mESC'ler) asılı bırakma yöntemiyle embriyoid cisimlere (EB'ler) farklılaşmasını göstermektedir. mESC'leri asılı damlalarda askıya aldıktan ve inkübe ettikten sonra, hücreler, retinoik asit (RA) ile desteklenmiş bir farklılaşma ortamı kullanılarak nöronal progenitör hücrelere (NPC'ler) daha da farklılaşan EB'leri oluşturmak üzere toplanır.

Asılı Damla Yöntemi ile Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Nöral Progenitörlerin Üretilmesi

Bu video, fare embriyonik kök hücrelerinden (mESC'ler) nöral progenitör hücrelerin (NPC'ler) in vitro olarak üretilmesi için bir yöntemi göstermektedir. mESC'ler, embriyoid cisimcikleri (EB'ler) oluşturmak için süspansiyon halinde kültürlenir ve daha sonra yapışık bir kültürde retinoik asit tedavisi yoluyla NPC'lere farklılaşmaya yönlendirilir.

Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Nöral Progenitör Hücreler Üretmek İçin Bir Teknik

Bu protokol, serum içermeyen tek katmanlı bir yöntem kullanarak embriyonik kök hücrelerden nöral progenitörler üretme yöntemini ayrıntılı olarak açıklar. Bu progenitörler, olgun nöral hücre tiplerini türetmek veya nöral spesifikasyon sürecini incelemek için kullanılabilir ve bileşik tarama için çok kuyulu format ölçeklendirmesine uygundur.

Serum serbest Tek tabakalı Kültüründe Fare Embriyonik Kök Hücre Sinir Farklılaşma

Bu iletişim kuralı kortikal interneuron ataları ve sonrası Mitotik interneuron öncüleri fare embriyonik kök değiştirilmiş bir embryoid vücut monolayer yöntemi kullanarak hücre oluşturmak için bir yöntem açıklanır. Bu ataları/hareketlenme öncesi ilk belirtiler kullanılan vitro olabilir fluorescently sıralanmış ve kader tayini çalışmak için yenidoğan yeni korteksimiz içine nakledilen veya tedavi uygulamalarında kullanılan.

Fare embriyonik kök hücre farklılaşma içine kortikal Interneuron Kara filmin tarih öncesi

Burada embriyonik kök hücrelerden nöronlara hızlı ve verimli farklılaşmayı yönlendiren düşük maliyetli ve kullanımı kolay bir yöntem kurduk. Bu yöntem laboratuvarlar arasında popülerleşmeye uygundur ve nörolojik araştırmalar için yararlı bir araç olabilir.

Fare Embriyonik Kök Hücre in vitro nöronal farklılaşma

Fare embriyonik kök hücrelerinin asma damlası yöntemini kullanarak nöronal hücrelere in vitro farklılaşması prosedürünü açıklıyoruz. Ayrıca RT-qPCR, immünofluoresans, RNA-seq ve akış sitometrisi ile kapsamlı bir fenotipik analiz gerçekleştiriyoruz.

Nöral Progenitörlerin ve Nöronların Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Farklılaşması ve Karakterizasyonu

Öğrenin fare embriyonik kök hücrelerinin asma bırak yöntemiyle in vitro farklılaşmasını. Bu teknik embriyoid cisim oluşumunu sağlayarak rejeneratif tıp araştırmalarına katkıda bulunur.

Asma Bırak Yöntemiyle Fare Embriyonik Kök (MES) Hücreler in vitro Farklılaşma

Daha fazla video keşfet