Asma Bırak Yöntemiyle Fare Embriyonik Kök (MES) Hücreler in vitro Farklılaşma

Kök hücreler, vücutta birçok farklı hücre tipine dönüşme konusunda olağanüstü bir potansiyele sahiptir. Vücut için bir tür onarım sistemi görevi görür. Diğer hücreleri yenilemek için teorik olarak sınırsız bölünebilirler.

Bir kök hücre bölündüğünde, her yeni hücre ya bir kök hücre olarak kalma ya da daha özel bir işleve sahip başka bir hücre türü olma potansiyeline sahiptir. Bu umut verici bilim alanı, bilim adamlarını in vitro olarak hastalığı tedavi etmek için hücre bazlı tedavilerin olasılığını araştırmaya yönlendiriyor. Embriyonik kök hücrelerin farklılaşması, hücrelerin süspansiyon kültüründe toplanmasına izin verildiğinde meydana gelir.

Fare embriyonik, fibroblast besleyicileri ve lösemi inhibitör faktörünün yokluğunda, bu hücre agregatlarına embriyo cisimleri denir. Asılı damla yöntemi, kök hücrelerin in vitro olarak embriyo cisimciklerine farklılaştırılması için etkili bir prosedürdür. Merhaba, ben Stanford Üniversitesi Kardiyovasküler Tıp Bölümü'nün solağından Sha Juan.

Bugün size embriyonik kök hücrenin elle damlatma yöntemini kullanarak vücudu kızartmak için bireysel olarak farklılaşması için bir prosedür göstereceğiz. Bu yöntemi genellikle embriyonik kök hücreyi kardiyomiyositlere ayırmak için kullanırız. Aşağıdaki adımları içeren bu prosedür, embriyonik kök hücrelerin tek hücreli bir süspansiyonunun hazırlanması, el damla kültürlerinin oluşturulması, el damla kültürlerinin ultra düşük bağlantı plakalarına aktarılması ve embroid gövdelerinin jüt kaplı plakalar üzerine kaplanmasıdır.

Tamam, başlayalım. İşlemin ilk adımı, embriyonik kök hücrelerin tek hücreli bir süspansiyonunu hazırlamaktır. Farklılaşmamış embriyonik kök hücrelerimizi fare embriyonik fibroblastları üzerinde büyüterek kültürlediğimiz için, hücreleri ayırmalı ve fibroblastlardan ayırmalıyız.

Bunu yapmak için, standart prosedürleri kullanarak hücreleri anize etmeye çalışıyoruz. Deneme ve tedavi tamamlandıktan sonra, tripsini nötralize etmek için fare embriyonik kök hücre ortamı ekleyin. Ardından, hücre süspansiyonunu 15 mil konik bir tüpe aktarın.

Ardından, görünür kümeler olmadan ince bir hücre süspansiyonu elde edene kadar tüpün dibine doğru yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre kolonilerini parçalayın. Şimdi hücreleri beş dakika boyunca bin RPM'de döndürün. Döndürdükten sonra, hücreler süpernatı aspire edin ve hücreleri 10 mil fare ES hücresi ile yeniden süspanse edin. Orta.

Hücre süspansiyonunu %0.1 jelatin ile önceden kodlanmış bir T 75 şişesine aktarın ve bir saat boyunca %5 CO2 ile 37 derecede inkübe edin. Bir saat sonra, fibroblastlar plakaya yapışır, ancak kök hücreler ortamda kalır. Kök hücreleri toplamak için ortamı pipetleyin.

Hücreleri beş dakika boyunca bin RPM'de döndürün ve ortamı aspire edin. Daha sonra 10 mil daha farklılaşma ortamı ekleyin ve ince bir hücre süspansiyonu gibi görünene kadar tekrarlayan pipetleme ile hücreleri yeniden süspanse edin. Bir hemo sitometre kullanarak hücreleri sayın.

Şimdi, asılı damla yöntemini kullanarak hücre süspansiyonunu kültürlemeye hazırız. Asılı damla kültürüne başlamak için, kök hücre süspansiyonunu 20 mikrolitre başına 500 hücre konsantrasyonuna seyreltmek için farklılaşma medyanını kullanın. Ardından, 150 milimetrelik bir doku kültürü plakası kapağını ters çevirin.

Daha sonra 20 mikrolitre hücre süspansiyonunu plaka kapağının iç yüzeyine pipetleyin. Çok kanallı bir pipetleyici kullanarak plakaya 10 mil PBS ekleyin. Plaka kapağını hızlı bir şekilde ters çevirin ve asılı damlaları oluşturmak için yavaşça plakanın üzerine yerleştirin.

Plaka kapağı yerleştirildikten sonra, plakayı dikkatlice inkübatör kültürüne aktarın. Hücreler iki gün boyunca rahatsız edilmedi. Kuluçka tamamlandıktan sonra, asılı damla kültürünü ultra düşük bağlantı plakalarına aktarmaya devam edeceğiz.

İki gün sonra, 180 mikrolitre taze farklılaşma ortamını aspire etmek için plaka kapağını dikkatlice ters çevirin ve 96 kuyulu ultra düşük bağlantı plakasına birkaç damla damlatın. Daha sonra damlaları bir pipetle toplayın ve tek tek 96 oyuklu plakaya aktarın. Plakaları üç gün boyunca rahatsız edilmeden inkübatöre yerleştirin.

Embriyo gövdeleri bir top şeklinde büyümeye devam edecektir. Kuluçka tamamlandığında, embriyo cisimlerini kaplamaya hazır olacağız. Embriyo cisimciklerinin farklılaşmaya devam etmesine yardımcı olmak için.

Bunları 48 kuyulu jelatin kaplı bir plakaya aktarıyoruz. Bunu yapmak için, önce plakanın her bir kuyusunu 300 mikrolitre% 0.1 jelatin ile kaplıyoruz. Jelatini ekledikten sonra, plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, jelatini 48 oyuklu plakadan aspire edin. Daha sonra her birine 300 mikrolitre farklılaşma ortamı ekleyin. Şimdi, embriyo cisimciklerini birer birer 96 kuyusundan 48 kuyulu jelatin kaplı plakalara aktarın.

Hücreleri korumak için genellikle ertesi gün ve daha sonra her gün ortamı değiştiririz. Bu yöntemi, embriyonik kök hücreleri ayırt etmek için daha iyi protokoller aramak için kullanıyoruz. Kardiyomiyositlerde, asılı damla kültürleri kullanarak fare embriyonik kök hücrelerinin in vitro farklılaşmasını nasıl gerçekleştireceğinizi gösterdik.

Bu yöntem etkilidir çünkü asılı damlanın yuvarlak tabanı embriyonik kök hücrelerin toplanmasına izin verir, böylece Embry cisimciklerinin oluşumu için iyi bir ortam sağlar. Bu prosedürü yaparken, asılı bir damlada toplanan embriyonik kök hücrelerin sayısının, ilk hücre süspansiyonundaki hücre sayısı değiştirilerek kontrol edilebileceğini hatırlamak önemlidir. Bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler. Denemenizde iyi şanslar.