Asma Bırak Yöntemiyle Fare Embriyonik Kök (MES) Hücreler in vitro Farklılaşma
23 Temmuz 2008
Bu video asılı bırak yöntemini kullanarak embriyoid organları fare embriyonik kök hücreleri in vitro farklılaşması nasıl yürütüleceğini gösteriyor.
Kök hücreler, vücutta birçok farklı hücre tipine dönüşme konusunda olağanüstü bir potansiyele sahiptir. Vücut için bir tür onarım sistemi görevi görür. Diğer hücreleri yenilemek için teorik olarak sınırsız bölünebilirler.
Bir kök hücre bölündüğünde, her yeni hücre ya bir kök hücre olarak kalma ya da daha özel bir işleve sahip başka bir hücre türü olma potansiyeline sahiptir. Bu umut verici bilim alanı, bilim adamlarını in vitro olarak hastalığı tedavi etmek için hücre bazlı tedavilerin olasılığını araştırmaya yönlendiriyor. Embriyonik kök hücrelerin farklılaşması, hücrelerin süspansiyon kültüründe toplanmasına izin verildiğinde meydana gelir.
Fare embriyonik, fibroblast besleyicileri ve lösemi inhibitör faktörünün yokluğunda, bu hücre agregatlarına embriyo cisimleri denir. Asılı damla yöntemi, kök hücrelerin in vitro olarak embriyo cisimciklerine farklılaştırılması için etkili bir prosedürdür. Merhaba, ben Stanford Üniversitesi Kardiyovasküler Tıp Bölümü'nün solağından Sha Juan.
Bugün size embriyonik kök hücrenin elle damlatma yöntemini kullanarak vücudu kızartmak için bireysel olarak farklılaşması için bir prosedür göstereceğiz. Bu yöntemi genellikle embriyonik kök hücreyi kardiyomiyositlere ayırmak için kullanırız. Aşağıdaki adımları içeren bu prosedür, embriyonik kök hücrelerin tek hücreli bir süspansiyonunun hazırlanması, el damla kültürlerinin oluşturulması, el damla kültürlerinin ultra düşük bağlantı plakalarına aktarılması ve embroid gövdelerinin jüt kaplı plakalar üzerine kaplanmasıdır.
Tamam, başlayalım. İşlemin ilk adımı, embriyonik kök hücrelerin tek hücreli bir süspansiyonunu hazırlamaktır. Farklılaşmamış embriyonik kök hücrelerimizi fare embriyonik fibroblastları üzerinde büyüterek kültürlediğimiz için, hücreleri ayırmalı ve fibroblastlardan ayırmalıyız.
Bunu yapmak için, standart prosedürleri kullanarak hücreleri anize etmeye çalışıyoruz. Deneme ve tedavi tamamlandıktan sonra, tripsini nötralize etmek için fare embriyonik kök hücre ortamı ekleyin. Ardından, hücre süspansiyonunu 15 mil konik bir tüpe aktarın.
Ardından, görünür kümeler olmadan ince bir hücre süspansiyonu elde edene kadar tüpün dibine doğru yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre kolonilerini parçalayın. Şimdi hücreleri beş dakika boyunca bin RPM'de döndürün. Döndürdükten sonra, hücreler süpernatı aspire edin ve hücreleri 10 mil fare ES hücresi ile yeniden süspanse edin. Orta.
Hücre süspansiyonunu %0.1 jelatin ile önceden kodlanmış bir T 75 şişesine aktarın ve bir saat boyunca %5 CO2 ile 37 derecede inkübe edin. Bir saat sonra, fibroblastlar plakaya yapışır, ancak kök hücreler ortamda kalır. Kök hücreleri toplamak için ortamı pipetleyin.
Hücreleri beş dakika boyunca bin RPM'de döndürün ve ortamı aspire edin. Daha sonra 10 mil daha farklılaşma ortamı ekleyin ve ince bir hücre süspansiyonu gibi görünene kadar tekrarlayan pipetleme ile hücreleri yeniden süspanse edin. Bir hemo sitometre kullanarak hücreleri sayın.
Şimdi, asılı damla yöntemini kullanarak hücre süspansiyonunu kültürlemeye hazırız. Asılı damla kültürüne başlamak için, kök hücre süspansiyonunu 20 mikrolitre başına 500 hücre konsantrasyonuna seyreltmek için farklılaşma medyanını kullanın. Ardından, 150 milimetrelik bir doku kültürü plakası kapağını ters çevirin.
Daha sonra 20 mikrolitre hücre süspansiyonunu plaka kapağının iç yüzeyine pipetleyin. Çok kanallı bir pipetleyici kullanarak plakaya 10 mil PBS ekleyin. Plaka kapağını hızlı bir şekilde ters çevirin ve asılı damlaları oluşturmak için yavaşça plakanın üzerine yerleştirin.
Plaka kapağı yerleştirildikten sonra, plakayı dikkatlice inkübatör kültürüne aktarın. Hücreler iki gün boyunca rahatsız edilmedi. Kuluçka tamamlandıktan sonra, asılı damla kültürünü ultra düşük bağlantı plakalarına aktarmaya devam edeceğiz.
İki gün sonra, 180 mikrolitre taze farklılaşma ortamını aspire etmek için plaka kapağını dikkatlice ters çevirin ve 96 kuyulu ultra düşük bağlantı plakasına birkaç damla damlatın. Daha sonra damlaları bir pipetle toplayın ve tek tek 96 oyuklu plakaya aktarın. Plakaları üç gün boyunca rahatsız edilmeden inkübatöre yerleştirin.
Embriyo gövdeleri bir top şeklinde büyümeye devam edecektir. Kuluçka tamamlandığında, embriyo cisimlerini kaplamaya hazır olacağız. Embriyo cisimciklerinin farklılaşmaya devam etmesine yardımcı olmak için.
Bunları 48 kuyulu jelatin kaplı bir plakaya aktarıyoruz. Bunu yapmak için, önce plakanın her bir kuyusunu 300 mikrolitre% 0.1 jelatin ile kaplıyoruz. Jelatini ekledikten sonra, plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Ertesi gün, jelatini 48 oyuklu plakadan aspire edin. Daha sonra her birine 300 mikrolitre farklılaşma ortamı ekleyin. Şimdi, embriyo cisimciklerini birer birer 96 kuyusundan 48 kuyulu jelatin kaplı plakalara aktarın.
Hücreleri korumak için genellikle ertesi gün ve daha sonra her gün ortamı değiştiririz. Bu yöntemi, embriyonik kök hücreleri ayırt etmek için daha iyi protokoller aramak için kullanıyoruz. Kardiyomiyositlerde, asılı damla kültürleri kullanarak fare embriyonik kök hücrelerinin in vitro farklılaşmasını nasıl gerçekleştireceğinizi gösterdik.
Bu yöntem etkilidir çünkü asılı damlanın yuvarlak tabanı embriyonik kök hücrelerin toplanmasına izin verir, böylece Embry cisimciklerinin oluşumu için iyi bir ortam sağlar. Bu prosedürü yaparken, asılı bir damlada toplanan embriyonik kök hücrelerin sayısının, ilk hücre süspansiyonundaki hücre sayısı değiştirilerek kontrol edilebileceğini hatırlamak önemlidir. Bu kadar.
İzlediğiniz için teşekkürler. Denemenizde iyi şanslar.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu video, fare embriyonik kök hücrelerinin embriyoid gövdeler halinde in vitro farklılaşmasını, damla yöntemi kullanarak göstermektedir. Kök hücreler, vücut için bir onarım sistemi olarak görev yaparak çeşitli hücre tiplerine dönüşme potansiyeline sahiptir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kök hücre biyolojisi
- Hücre farklılaşması
- In vitro kültür teknikleri
Arka Plan
- Kök hücreler teoride sınırsız şekilde bölünme potansiyeline sahiptir.
- Her yeni hücre, kök hücre olarak kalabilir veya özelleşmiş bir hücreye dönüşebilir.
- Bu bilim alanı, potansiyel hücre temelli terapilere yol açmaktadır.
- Embriyonik kök hücre farklılaşması, süspansiyon kültüründe gerçekleşir.
Çalışmanın Amacı
- Embriyonik kök hücrelerin farklılaşmasını göstermek.
- Hücre agregasyonu için damla yöntemini sergilemek.
- Potansiyel terapötik uygulamalar hakkında bilgiler sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Fare embriyonik kök hücrelerinin in vitro farklılaşması.
- Hücre agregasyonu için damla yöntemi.
- Süspansiyon kültür teknikleri.
- Embriyoid gövde oluşumunun gözlemlenmesi.
Ana Sonuçlar
- Kök hücrelerden başarılı embriyoid gövde oluşumu.
- Damla yönteminin etkinliğinin gösterilmesi.
- Kök hücrelerin farklılaşma sürecine dair bilgiler.
- Hücre temelli terapiler için potansiyel etkiler.
Sonuçlar
- Damla yöntemi kök hücre farklılaşması için etkilidir.
- Embriyoid gövdelerin fare embriyonik kök hücrelerden in vitro oluşturulabilir.
- Bu teknik, rejeneratif tıp alanında araştırmayı ilerletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Controlled embryoid body formation enables reproducible in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in regenerative medicine research. The hanging drop method provides a scalable, standardized approach to generate homogeneous multicellular aggregates, reducing variability in downstream phenotypic screening and assay development. This technique enhances predictive confidence by allowing precise cell number control, facilitating consistent embryoid body generation for therapeutic hypothesis testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of stem cell differentiation pathways and functional target validation through controlled embryoid body formation.
- Operational Value: Supports biological de-risking by providing a reproducible system to assess lineage commitment and early differentiation markers.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by allowing standardized evaluation of differentiation efficiency across genetic or pharmacological perturbations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated embryoid body systems for downstream compound screening and phenotypic assessment.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through controlled cell aggregation in hanging drops.
- Scalability: Enables platform reuse and consistent compound evaluation across multiple wells and plates.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by generating embryoid bodies that model early developmental processes pertinent to regenerative therapies.
- Operational Value: Provides continuity from discovery through preclinical validation via standardized embryoid body production.
- Risk Mitigation: Supports risk-adjusted advancement decisions by enabling quantitative assessment of differentiation kinetics and homogeneity.
Pipeline & Workflow Integration
The hanging drop method integrates into the discovery continuum from early stem cell differentiation through lead identification and preclinical validation, enabling standardized embryoid body generation for therapeutic screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling controlled aggregation of mouse embryonic stem cells into embryoid bodies.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through uniform embryoid body formation, facilitating reliable compound screening outcomes.
- Analytics: Provides quantitative outputs such as embryoid body size, number, and morphology to compare differentiation conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by generating disease-relevant embryoid bodies for mechanistic de-risking and biomarker alignment studies.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across projects requiring standardized embryoid body production for differentiation assays.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in differentiation outcomes, target validation, and reduction of mechanistic ambiguity in stem cell research.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of embryoid body formation across laboratories and experiments.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in regenerative medicine pipelines.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on consistent embryoid body quality and differentiation efficiency.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, single-cell suspension preparation, and embryoid body handling.
- Depends on access to low-attachment plates, gelatin-coated surfaces, and standardized differentiation media.
- Necessitates cross-team standardization of cell concentration, drop volume, and incubation timing for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when transferring embryoid bodies to different culture surfaces for downstream differentiation.
- Limited by the need for manual pipetting precision and careful handling to avoid embryoid body disruption during transfer steps.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
1:10
Introduction
2:06
Preparing Single Cell Suspension of Embryonic Stem Cells
3:46
Generating Hanging Drop Cultures
4:39
Transferring Hanging Drops to Ultralow Attachment Plates
5:17
Plating Embryoid Bodies onto Gelatin- Coated Plates
6:12
Conclusion
