Özünde Düzensiz Proteinlerin Çoklu fosforilasyon Saptanma Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi

Bu metodolojinin genel amacı, bir vaka çalışması olarak tau proteini kullanılarak nükleer manyetik rezonans spektroskopisi ile içsel olarak düzensiz bir proteinin çoklu fosforilasyonunu tanımlamaktır. Bu yöntem, fosforilasyonun moleküler ortağı ile protein etkileşimi üzerindeki etkisi gibi hastalıkla ilgili moleküler düzenlemedeki kilit soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, düzensiz bir proteindeki bölgeye özgü fosforilasyonu tanımlayabilmemiz ve bunu yapısal ve fonksiyonel değişikliklerle ilişkilendirebilmemizdir.

Bu yöntem, işlev hakkında içgörü sağlayabilir. aPtc virüsünden DNA proteininin düzensiz kalıntıları gibi diğer proteinlere de uygulanabilir Bu tekniğin uygulamaları, protein, protein etkileşim inhibitörlerinin geliştirilmesi yoluyla tedaviye kadar uzanır. Bu yöntem, grubumuzdan doktora öğrencileri olan Clement Danis, Clement Despres, Luiza Bessa ve Hamida Merzougui tarafından gösterilecektir.

Başlamak için, 50 mikrolitre yetkin BL21 hücresini 100 nanogram plazmit DNA ile nazikçe karıştırın ve 1.5 mililitrelik bir plastik tüpte mikrogram plazma DNA'sı başına 10 ila 15 milyon koloni oluşturun. Hücre karışımını 30 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirdikten sonra, 42 santigrat derecede 10 saniye boyunca ısı şoku verin. Ardından, bir mililitre oda sıcaklığında Luria Bertani veya LB ortamı eklemeden önce tüpü beş dakika boyunca tekrar buzun üzerine koyun.

Bakteriyel süspansiyonu hafif çalkalama altında 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bir yayıcı kullanarak, 100 mikrolitre hücre süspansiyonunu, mililitre ampisilin antibiyotik başına 100 mikrogram içeren bir LB ortamı agar plakasına eşit olarak yayın. Seçim plakasını 37 santigrat derecede 15 saat inkübe edin.

Daha sonra, 300 miligram Azot 15 ve Karbon 13 ile zenginleştirilmiş ortam, bir gram Azot 15 Amonyum Klorür ve iki gram Karbon 13 etiketli glikozu 10 mililitre M9 ortamında çözündürün. Filtre: izotop çözeltisini 0,2 mikronluk bir filtre kullanarak doğrudan M9 ortamına sterilize edin. Bir pastör pipeti kullanarak, rekombinant plazmaya dönüştürülmüş bakterilerin bir kolonisini, mililitre ampisilin başına 100 mikrogram ile desteklenmiş 20 mililitre LB ortamında seçim plakasından süspanse edin.

Aşılanmış ortamı yaklaşık altı saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Plastik bir spektrometre küvetinde bir mililitre bakteri kültürünün on kat seyreltilmesini kullanarak 600 nanometre veya OD600'de optik yoğunluğu ölçün. Daha sonra, iki litrelik bir Erlenmeyer cam şaşkın kültür şişesinde ampisilin ile desteklenmiş bir litre M9 büyüme ortamına 20 mililitre doymuş LB kültürü ekleyin.

Kültür şişesini 10 santigrat derece ve 50 RPM'ye ayarlanmış programlanabilir bir inkübatöre yerleştirin. İnkübatörü ertesi gün sabahın erken saatlerinde 200 RPM ve 37 santigrat dereceye geçecek şekilde programlayın. OD600'ü plastik bir spektrometre küvetinde bir mililitre bakteri kültürü üzerinde ölçün.

Rekombinant tau proteininin ekspresyonunu indüklemek için OD600 yaklaşık 1.0 değerine ulaştığında 400 mikrolitre bir molar IPTG stok çözeltisi ekleyin. Bakteri hücrelerini 37 santigrat derecede üç saat daha inkübe ettikten sonra, 20 dakika boyunca 5.000 kez g'de santrifüjleme ile toplayın. Bakteri hücresi peletini çözün ve 1x proteaz inhibitör kokteyli DNasel 1 ile taze takviye edilmiş 45 mililitre katyon değişim tamponu A içinde iyice süspanse edin.

20.000 PSI'da yüksek basınçlı bir homojenizatör kullanarak bakteri hücrelerini parçalayın, hücreleri yeterince parçalamak için üç ila dört geçiş gereklidir. Çözünmeyen materyali çıkarmak için bozulmuş hücreleri 40 dakika boyunca 20.000 kez g'de santrifüjleyin. Bakteri hücresi ekstraktını bir su banyosu kullanarak 75 santigrat derecede 15 dakika ısıtın.

Birkaç dakika sonra beyaz bir çökelti gözlenecektir. Daha sonra, ısıtılmış ekstraktı 20 dakika boyunca 15.000 kez g'de santrifüjleyin ve ısıya dayanıklı tau proteini içeren süpernatanı tutun. Ardından, hızlı bir protein sıvı kromatografi sistemi kullanarak 5 mililitrelik bir yatak sütunu olarak paketlenmiş güçlü bir CEX reçinesi üzerinde katyon değişim kromatografisi gerçekleştirin.

Akış hızını dakikada 2,5 mililitre olarak ayarlayın ve sütunu CEX A tamponunda dengeleyin. Daha sonra, bir numune pompası kullanarak 60 ila 70 mililitre ısıtılmış tau ekstraktını yükleyin, tau proteininin reçineye verimli bir şekilde bağlandığını doğrulamak için analiz için akışı toplayın. 280 nanometredeki emilim başlangıç değerine geri dönene kadar reçineyi CEX A tamponu ile yıkayın.

FPLC'yi 25 milimolar Sodyum Klorüre ulaşmak için 10 sütun hacminde %25'e kadar CEX B tamponu ile programlayın. Bunu, 500 milimolar Sodyum Klorüre ulaşmak için beş sütun hacminde% 50 CEX B tamponu ile takip edin. Son olarak, bir molar Sodyum Klorüre ulaşmak için gradyanı iki sütun hacminde %100 CEX B tamponuna yükseltin.

Elüsyon adımları sırasında 1,5 mililitrelik fraksiyonları toplayın. Ardından, havuzlanmış kesirler içeren tau üzerinde bir tampon değişimi gerçekleştirin. Bir FPLC sistemi kullanarak 15 milimolar amonyum bikarbonat tamponunda 53 mililitrelik G25 reçine dolgulu bir yatakla bir tuzdan arındırma kolonunu dengeleyin.

Akış hızını dakikada beş mililitreye ayarlayın ve tau örneğini beş mililitrelik bir enjeksiyon döngüsü aracılığıyla kolona enjekte edin. 280 nanometrede absorpsiyon zirvesine karşılık gelen fraksiyonları toplayın. Numuneyi tüplere ayırmadan önce tüm tau fraksiyonlarını bir araya getirin.

Bu tüpleri, çözeltinin hacmi tüpün hacmine kıyasla küçük olacak şekilde seçin. Ardından, daha sonra liyofilizasyon için tau örneklerini eksi 80 santigrat derecede dondurmadan önce bir iğne kullanarak tüp kapaklarına delikler açın. Dört miligram liyofilize Azot 15 ve Karbon 13 ile zenginleştirilmiş erk fosforile tau'yu 400 mikrolitre NMR tamponunda çözündürün.

NMR spektrometresinin alan kilitlemesi için yüzde beş döteryum oksit ve dahili bir NMR sinyal referansı olarak bir milimolar TMSP ekleyin. Ayrıca, tam bir proteaz inhibitörü kokteylinin 40 EK stok çözeltisinden 10 mikrolitre ekleyin. Numuneyi, uzun iğneli elektronik bir şırınga veya bir pastör pipeti kullanarak beş mililitrelik bir NMR tüpüne aktarın.

Pistonu kullanarak NMR tüpünü kapatın. Pistonu hareket ettirerek piston ile sıvı arasında sıkışan hava kabarcıklarını çıkarın. NMR tüpünü bir döndürücüye yerleştirin.

Numune çözeltisinin çoğu NMR bobininin içinde olacak şekilde döndürücüdeki dikey konumunu ayarlamak için uygun göstergeyi kullanın. Ardından, Mıknatıs Kontrol Sistemi penceresindeki kaldırmaya tıklayarak NMR cihazındaki hava akışını başlatın. Döndürücüyü, tüp ile birlikte mıknatıs deliğinin üst kısmındaki hava akışına dikkatlice yerleştirin.

Ardından hava akışını durdurun ve tüpün mıknatıs içindeki prob kafasının içindeki yerine inmesine izin verin. Numunenin 25 santigrat dereceye kadar dengelenmesine izin verdikten sonra, güç aktarımını optimize etmek için prob kafasının yarı otomatik olarak ayarlanmasını ve eşleştirilmesini gerçekleştirmek için komut satırına ATMM yazın. Ardından, spektrometrenin alan frekansı kilidini devreye sokmak için Mıknatıs Kontrol Sistemi penceresindeki kilite tıklayın.

Numunenin konumundaki manyetik alanın homojenliğini optimize etmek için, önce dolgu penceresini açmak için komut satırına TopShim GUI yazarak dolgu prosedürünü başlatın. Ardından dolgu penceresinde başlat'a tıklayın. Şimlerin optimal olduğunu doğrulamak için kalan B0 standart sapmasını kontrol edin.

Ardından, bir proton radyo frekansı darbesinin mikrosaniye cinsinden uzunluğu olan P1 parametresini kalibre edin. Bu parametre, proton spin manyetizasyonunun 90 derecelik bir dönüşünü elde etmek için gereklidir. Tek boyutlu bir su protonu spektrumu kullanarak 360 derecelik darbeyi hedefleyin.

O1 parametresini tek boyutlu spektrumdaki proton su frekansına ayarlayarak frekans ofsetini ayarlayın. Son olarak, komut satırına ZG yazarak tek boyutlu proton spektrumunun edinimini başlatın. Rekombinant tau'nun saflaştırılmasının temsili bir sonucu, elüsyon gradyanı sırasında gözlemlenen 280 nanometrede büyük bir absorpsiyon zirvesi gösterir.

Bu zirve, kromatogramın üzerindeki akrilamid jel üzerinde görüldüğü gibi saflaştırılmış tau proteinine karşılık gelir. Rekombinant saflaştırılmış tau'nun tuzdan arındırılması için kromatogram, 280 nanometredeki absorpsiyon zirvesinin ve iletkenlik zirvesinin iyi bir şekilde ayrıldığını ve proteinin tuzdan arındırılmasının liyofilizasyon aşaması için verimli olmasını sağladığını gösterir. 900 megahertz'de rekombinant nitrojen 15 tau'nun tek boyutlu NMR spektrumu, protein örneğinden bir NMR sinyalinin tespit edilebileceğini doğrular.

İyi sinyal-gürültü oranı, temel edinim parametrelerinin doğru ayarlandığını gösterir. Fosforile proteinin iki boyutlu spektrumu iyi çözünürlük gösterir, rezonanslar dar ve iyi ayrılmıştır. Spektrumun kırmızı ile kutulanmış bölgesindeki rezonanslar, fosforile edilmiş kalıntılara karşılık gelir.

Bu videoyu izledikten sonra, bu proteini saflaştırmak ve spektrum veri toplama için temel parametreyi ayarlamak için seçmesi kolay etiketleme ile rekombinant bir protein üretebilmelisiniz. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu protokol düzgün bir şekilde organize edilirse iki hafta içinde yapılabilir. NMR spektroskopisinin metalik nesnelerle yaklaşılmaması gereken çok güçlü mıknatıslar kullandığını unutmayın.

Bu prosedürü denerken, bu diğer proteinlerin proteaz lizine duyarlı olduğunu ve numunenin bozulmasını önlemek için bir dizi önlem alınması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, genellikle düzensiz proteinler tarafından oluşturulan amiloid benzeri agregatları araştırmak için katı hal NMR gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, kimyasal biyoloji alanındaki araştırmacıların, in vitro model sistemlerinde serapatik potansiyele sahip aktif bileşikleri keşfetmelerinin yolunu açtı.