Name: Özünde Düzensiz Proteinlerin Çoklu fosforilasyon Saptanma Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Öğrenin, Tau proteininde çoklu fosforilasyon sitelerini NMR spektroskopisi ile belirleme yöntemini. Bu teknik, yapısal ve fonksiyonel değişiklikleri moleküler düzeyde inceleyerek nörodejeneratif hastalıklara yönelik tedavi stratejileri geliştirmeye katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NMR tesisleri, Région Nord, CNRS, Lille Pasteur Enstitüsü, Avrupa Topluluğu (FEDER), Fransız Araştırma Bakanlığı ve Lille Bilim ve Teknoloji Üniversitesi tarafından finanse edildi. TGE RMN THC (FR-3050, Fransa), FRABio (FR 3688, Fransa) ve Lille NMR ve RPE Sağlık ve Biyoloji çekirdek tesisinden gelen desteği kabul ediyoruz. Araştırmamız LabEx (Mükemmeliyet Laboratuvarı), DISTALZ (Alzheimer hastalığına Transdisipliner Bir Yaklaşım için Yenilikçi Stratejilerin Geliştirilmesi), EU ITN TASPPI ve ANR BinAlz'dan alınan hibelerle desteklenmektedir.

15 N 1. üretimi, 13C-tau (Şekil 1) <ol><li> BL21 pET15b-Tau rekombinant T7 ifade plazmid 13,14 Transform (DE3) Yetkili Escherichia coli bakteri hücreleri 15. Not: en uzun (441 amino asit kalıntıları) Tau izoform cDNA kodlama pET15b plasmidde Ncol ve Xhol sınırlama siteleri arasında klonlanmıştır. <ol><li> Yetkili BL21 1.5 ml&#39;lik plastik bir tüp içinde plasmid DNA, 100 ng plazmid DNA ug başına 1-5 x 10 7 koloni oluşturan (DE3) hücreleri nazikçe 50 ul karıştırın. Not: ökaryotik cDNA ifade için kodon-optimize kullanımı bakteri türleri insan Tau üretmek için gerekli değildir. </li><li> 42 ° C&#39;de 10 saniye boyunca, daha sonra 30 dakika karıştırıldı ve ısı şoku buz üzerinde hücre karışımı yerleştirin. Lütfen, buz üzerinde 5 dakika için tüp ve oda sıcaklığında LB (Luria-Bertani) orta 1 ml. yumuşak altında 30 dakika boyunca 37 ° C sıcaklıkta bakteriyel bir süspansiyon inkübeçalkalama. </li></ol></li><li> ampisilin antibiyotik, 100 ug / ml içeren LB ortamında bir agar plakası üzerine bir aşılama köprüsü eşit hücre süspansiyonu 100 ul kullanılarak yayıldı. </li><li> 37 ° C&#39;de 15 saat için seçim plaka inkübe edin. </li><li> Yaklaşık 2 haftalık bir süre için, kültür adımına geçmeden kadar 4 ° C &#39;de bir seçim plaka tutun. Not: bakteri kültürü (% 50 gliserol) bir gliserol stoku, -80 ° C&#39;de saklandı, daha sonraki bir aşamada başlangıç ​​kültürü olarak hazırlanabilir. </li><li> Otoklavlanmış M9 tuzlarının 1 L (6 g 2 Na HPO 4, 3 gr KH 2 PO 4 mi, 100 mM CaCl2, 10 mi 100x MEM vitamin kompleman 1 ml 1 M MgSO 4, 1, 1 mi, 100 mg / ml ampisilin ekleme , 0.5 g NaCI). NOT: beyaz bir çökelti hızlı bir şekilde dağılır M9 tuzları CaCI2 çözeltisi ilave edilmesi üzerine oluşturacaktır. </li><li> 15 N, 300 mg 13 C-tam orta, 15 1 g çözünürNH4CI ile 13 ° C M9 ortam 6 -glükoz 10 ml 2 g. -Filtre sterilize doğrudan M9 ortama, bir 0.2 mikron filtre kullanarak izotop çözümü. </li><li> ampisilin, 100 ug / ml ile takviye edilmiş LB ortamı 20 ml seçeneklerini plaka bakteri dönüştürülmüş pET15b-Tau bir aşılama köprüsü bir koloni ile askıya alınması. </li><li> 6 saat boyunca 37 ° C&#39;de aşılandı orta inkübe edin. </li><li> Plastik bir spektrometre küvet içinde bakteriyel kültür on kat seyreltme 1 ml, 600 nm (OD 600) de optik yoğunluk ölçülür. Not: 3,0-4,0 600 OD tekabül eden bakteriyel kültür bulanıklığı doygunluk büyüme fazı ulaşılır belirtir. </li><li> 2 L&#39;lik bir Erlenmeyer plastik bölmeli bir kültür şişesi içinde, ampisilin (100 ug / ml nihai konsantrasyon) ile desteklenmiş M9 büyüme ortamı, 1 L doymuş LB kültür 20 ml ekleyin. </li><li> 10 ° ayarlanmış programlanabilir inkübatör kültür şişesi yerleştirinC ve 50 rpm. Ertesi gün sabah erkenden 200 rpm ve 37 ° C geçmek için inkübatör Program. </li><li> Plastik bir spektrometre küvet içinde bakteri kültürü, 1 ml&#39;lik Ölçü OD 600. 1 M IPTG 400 ul (izopropil P-D-1-tiogalaktopiranosid) OD 600 biraraya getiren tau proteininin ekspresyonunu indüklemek için yaklaşık 1.0 arasında bir değere ulaştığında (-20 ° C&#39;de saklanan) stok çözeltisi ekleyin. </li><li> ilave 3 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübasyon devam edin. 20 dakika boyunca 5000 x g&#39;de santrifüj ile bakteri hücreleri toplamak. </li><li> -20 ° C&#39;de bakteriyel pelet dondurun. Gerekirse bir süre için, saflaştırma adımı kadar donmuş tutun. </li></ol> 15 N 2. saflaştırılması, 13C-tau (Şekil 2) <ol><li> 121 ° C&#39;de otoklav katyon değişimli (CEX), saflaştırma, tamponlar, 20 dakika boyunca 15 psi altında. 4 ° C&#39;de saklayın tamponlar. </li><li> bakteriyel hücre pelet çözülme ve 45 ml iyice tekrar süspansiyon haline getirinekstraksiyon cex bir tampon maddesi (50 mM NaPi tamponu pH 6.5, 1 mM EDTA), taze proteaz inhibitör kokteyli 1x (1 tablet) ve DNasel (2.000 ünite) ile takviye edilmiştir. </li><li> 20.000 psi&#39;de bir yüksek basınç homojenizatörü kullanılarak bakteriyel hücrelerin bozulması. 3-4 geçiş gereklidir. 40 dakika için 20,000 x g&#39;de santrifüjleyin çözünmeyen malzemenin ayrılması için. </li><li> bir su banyosu kullanılarak 75 ° C &#39;de 15 dakika süre ile bakteriyel hücre özü ısıtın. NOT: beyaz bir çökelti, birkaç dakika sonra gözlemlenmiştir. </li><li> 20 dakika için 15,000 x g&#39;de santrifüjleyin ve ısıya karşı kararlı Tau protein içeren süpernatant, tutun. </li><li> Aşağıdaki saflaştırma adımı kadar -20 ° C&#39;de saklayın, gerekirse. </li><li> Bir hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) sistemi (Şekil 3 A) ile 5 ml yatak kolonu gibi paketlenmiş güçlü CEX reçine üzerinde bir katyon-değişim kromatografisi gerçekleştirin. <ol><li> 2.5 ml / dak sabit akış hızı. </li><li> Bir tampon cex sütunu dengelenmesi </li><li> 60-70 ml heated- yükleyinTau Örnek pompası kullanılarak içeren özü, ya da seçenek olarak sistemine bağlı olarak, bir pompa. akış yoluyla analiz Tau proteini verimli (2.8) reçine bağlayıcı olduğunu doğrulamak için toplayın. </li><li> Lütfen başlangıç ​​değerine için 280 nm&#39;de absorbans kadar Cex ile bir tampon reçine yıkanır. </li><li> CEX B tamponu kademeli bir artış ile elde edilen üç aşamalı bir NaCI gradyanı kullanılarak kolondan Elute Tau (CEX 1 M NaCI ile tampon A). Program FPLC aşağıdaki gibidir: 500 mM NaCI ulaşmak için 5 CV 250 mM NaCl,% 50 CEX tampon B&#39;ye ikinci adımı ulaşmak için 10 kolon hacim (CV) içinde% 25 CEX tampon B&#39;ye gradyan ilk aşaması ve üçüncü adımı 2 CV% 100 CEX B tamponu 1 M NaCl ulaşmak için. elüsyon adımları sırasında 1.5 mL fraksiyon toplanır. </li></ol></li><li> SDS-PAGE (% 12 SDS-akrilamid jeli) ve Coomassie boyama (Şekil 3 A), 16 tarafından elusyon basamağı sırasında toplanan fraksiyonlar 10 ul analiz edin. analy tarafından da kolon üzerinde yükleme adımı kontrolflow-through 10 ul zing. </li><li> Tau içeren kesirler seçin ve bir sonraki adım için bu kesirler havuz. </li><li> Tau-içeren toplanmış fraksiyonların (Şekil 3 B) bir tampon değişimi gerçekleştirin. <ol><li> Bir FPLC sistemi kullanılarak 50 mM amonyum bikarbonat (uçucu tamponu) 53 mi G25 reçinesi paketlenmiş yatak (26 x 10 cm) bir tuz alıcı sütun dengelenmesi. </li><li> 5 ml / dk için sabit akış hızı. 5 ml&#39;lik bir enjeksiyon döngüsü ile sütun üzerinde Tau örnek enjekte edilir. 280 nm &#39;de absorpsiyon tepe noktasına karşılık gelen fraksiyonlar toplanır. </li><li> İlk CEX havuzun hacmine bağlı olarak, enjeksiyonu 3-4 kez tekrarlayın. </li></ol></li><li> 280 nm&#39;de (Tau 1 mg 140 Mau * ml tekabül eder) de kromatogramının pik alanı kullanılarak, saflaştırılmış tau proteininin miktarını hesaplayın. Not: 280 nm tau proteininin sönüm katsayısı 7550 M-1 cm-1 olan. Tau bir Trp kalıntısı içermez. </li><li> Havuz tüm Tau fraksiyonları. </li><li> AliquoTau 1-5 mg eşdeğeri içeren tüplere örnek t. çözeltisinin hacmi borusu (50 ml tüp içinde çözelti, örneğin 5 mi) hacmi ile karşılaştırıldığında küçük olup, böylece, bu tüpler seçin. </li><li> Bir iğne kullanılarak tüp kapaklar delikler. -80 ° C&#39;de Tau örnekleri dondurun. </li><li> Liyofilize edilir Tau örnekler. Liyofilize Tau proteini uzun bir süre boyunca -20 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol> 15 N-Tau 3. İn Vitro Fosforilasyon <ol><li> 500 ul fosforilasyon tamponu (50 mM Hepes · KOH, pH 8.0, 12.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 50 mM NaCI), liyofilize Tau 5 mg eritin. </li><li> 0.5 M stoktan 2,5 mM ATP (100 mM&#39;lik bir stok çözeltiden 25 ul, -20 ° C&#39;de tutulur), 1 mM DTT (1 M stok çözeltisinin 1 ul -20 ° C &#39;de tutulur), 1 mM EGTA ekleyin (2 ul çözelti), 1 x proteaz inhibitör kokteyli (1 mi fosforilasyon tamponu içinde 1 tablet çözülmesiyle elde edilen bir 40x stoklar 25 | il) ve 181; M His-ERK2 aktif (koruma tampon maddesi içinde 250 ul 10 -80 ° C&#39;de saklandı mM HEPES, pH 7.3, 1 mM DTT, 5 mM MgCI2, 100 mM NaCI ve% 10 gliserol), toplam numune hacminin 1 mi. NOT: Aktif His-ERK2 MEK kinaz ile fosforilasyonu ile in-house 5,8 hazırlanabilir. </li><li> 37 ° C&#39;de 3 saat inkübe edin. </li><li> ERK kinaz inaktive etmek için 15 dakika süreyle 75 ° C de bir örnek ısıtılır. </li><li> 15 dakika için 20,000 x g&#39;de santrifüjleyin. Toplamak ve süpernatant tutun. </li><li> 1 ml&#39;lik bir örnek için uygundur 3.45 mi G25 reçinesi paketlenmiş yatak (1.3 x 2.6 cm), bir kolon kullanılarak 50 mM amonyum bikarbonat içine protein örnek desalt. </li><li> Bütünlüğünü ve verimli fosforilasyon (Şekil 4) kontrol etmek için protein örnek 2.5 ul% 12 SDS-PAGE 16 çalıştırın. </li><li> fosforile tau örnek liyofilize. -20 ° C&#39;de bir toz saklayın. </li></ol> NMR Spectra 4. Acquisition (Fişekil 5) <ol><li> Liyofilize 15 N 4 mg, 400 ul NMR tamponu içinde 13 C ERK-fosforile-tau (50 mM NaPi veya tris- D11 .Cl dötere 50 mM, pH 6.5, 30 mM NaCI, 2.5 mM EDTA, 1 mM DTT) çözünürleştirilir. </li><li> İç NMR sinyali referans olarak NMR spektrometresi alan kilitleme ve 1 mM TMSP (3- (trimetilsilil) propiyonik-2,2,3,3-d4 asit sodyum tuzu))% 5 D 2 O ekleyin. tam proteaz inhibitör kokteyli 40x stok çözeltisi 10 ul ekle. </li><li> uzun bir iğne ya da Pasteur pipeti ile bir elektronik şırınga kullanılarak 5 mm&#39;lik NMR tüpü içinde örnek aktarın. pistonu kullanarak NMR tüpü kapatın. piston hareketleri ile piston ve sıvı arasında sıkışmış hava kabarcığı çıkarın. </li><li> bir döndürücüye NMR tüpü yerleştirin. örnek çözeltisi çoğu NMR bobin içinde olacak şekilde, kullanılan NMR prob kafası için uygun göstergesi ile spinner kendi dikey konumunu ayarlar. </li><li> Hava akışını başlatmak: asansör i tıklayınn mıknatıs kontrol sistemi penceresi. Dikkatle mıknatıs deliğin üstündeki hava akımı tüp ile spinner yerleştirin. Hava akışını durdurmak (lift tıklayın) ve tüp mıknatıs prob kafasının içinde yerine iner edelim. </li><li> 25 ° C (298 K) &#39;ye ayarlama sıcaklığı. </li><li> güç iletimini optimize etmek için yarı-otomatik ayarlamayı ve prob kafasının eşleştirme gerçekleştirin. Komut satırında atmm yazın. </li><li> Döteryum kanalda kayıtlı numunenin D 2 O sinyali kullanarak spektrometre frekansını kilitleyin. Mıknatıs kontrol sistemi penceresinde kilidi tıklayın. </li><li> Numunenin pozisyonda manyetik alanın homojenliğini optimize layneri prosedürü başlatın. Şim penceresini açmak için komut satırında gui topshim yazın. Şim penceresinde başlangıç tıklayın. şimleri (en az 2 Hz iyidir) optimum olduğunu doğrulamak için kalan B0 standart varyasyon değerini kontrol edin. </li><li> bir protonun p1 parametresini (uzunluk kalibreProton spin 90 ° rotasyon elde etmek için gerekli olan mikro-saniye radyofrekans darbe). Su proton 1D spektrumunu (Şekil 6) kullanılarak 360 ° darbe hedefleyin. </li><li> (Şekil 6) 1D spektrumunda proton su frekansa (Hz) o1 parametresini ayarlayarak ofset frekansı ayarlayın. </li><li> Örnek (Şekil 7) gelen sinyalleri kontrol etmek için (örneğin zggpw5, su sinyal bastırılması watergate sırası ile atım dizisi) 1B proton spektrumunun edinimi başlar. göreceli bir protein konsantrasyonuna taramalarının sayısını uyarlayın. Edinimi başlatmak için komut satırında zg yazın. </li><li> 2B alımı için ek parametrelerini ayarlamak [1 H, 15 N] HSQC spektrumu (darbe dizisi hsqcetfpf3gpsi, 8-9 Şekiller). <ol><li> Bir 15 N için 13 C 15 N dolaylı evrimi sırasında 13 C decouple, örnek etiketli. </li><li&gt; Noktalarının sayısını ve 1 H (F2) ve 15 N (F1) boyutlarında spektrum genişliği (ppm) ayarlayın. NOT: noktasının başına Hz benzer sayıda tutmak için spektrometre alanına edinme veri noktalarının sayısını uyarlayın ve saatleri ayırımı sınırlamak için: 1 H boyutta, 900 MHz ve 600 MHz hızında 2048 noktada 3072 puan kullanın. </li><li> , Darbe dizilerinin ek parametrelerini optimize gecikmeler, darbe uzunlukları karşılık, frekansları, güç seviyeleri ofset. Komut satırında ased tip deney için ilgili tüm parametreleri görüntülemek için. </li></ol></li><li> 3D kazanılması için set parametreleri [1 H, 15 N, 13 C] HNCACB spektrumu (darbe dizisi hncacbgpwg3d, Şekil 10A) 600 MHz&#39;de. </li><li> 600 MHz hızında 3D [1 H, 15 N, 15 N] HNCANNH deneyi (darbe dizisi hncannhgpwg3d) için parametreleri ayarlayın. 1 H 2048 noktalarının sayısını ayarlayın ve 64ve iki 15 K boyutta 128 sayı. 25 milyon (ppm) başına 25 parça 4.7, 119, 1 H 119 ppm, 15 N ile 15 N boyutları üzerinde merkezlenmiş 14 olarak spektral genişlikleri tanımlar. 16 taramaları ile iktisap Süresi 1 gün ve 22 saattir. </li></ol> Fosforilasyon Siteleri 5. Tanımlama <ol><li> toplama ve işleme NMR yazılımını kullanarak proses spektrumları. <ol><li> Veri (Şekil 7) bir Fourier dönüşümünü gerçekleştirir. 1D spektrumu için Tip ft, bir 2D spektrumu için Xfb veya komut satırında, 3D spektrum için ft3d. </li><li> Faz ve referans tüm spektrumları (Şekil 7C) interaktif pencereleri kullanarak. </li></ol></li><li> 2D HSQC potansiyel fosforile Ser ve Thr artıklarının (Şekil 9, kırmızı kutu) karşılık gelen ilgi rezonans tanımlayın. </li><li> Özü uçakları (yani 2D 1H 13 C spektrumları)2B ilgi rezonans 15 N kimyasal kaymalar kullanarak 3D 1 H 15 N 13 C spektrumu. Görüntülenmiştir edilecek düzlem (w1-w3) karşılık gelen 15 N frekansı (Şekil 10B) seçmek için boyut 2 (w2) imleci kullanın. </li><li> Her biri için &#39;CA&#39; rezonans frekanslarını ve &#39;i&#39; ve &#39;CB&#39; 13 C çekirdekleri ve &#39;i-1&#39; tortuları, (i kalıntısının kıyasla sinyallerin zayıf kümesi) seçin [1 H, 15 N] rezonans işaretçi modu menüsünde, rezonans tıklayarak HNCACB 3D spektrumunda bir ilgi zirve listesi dosyasında kimyasal kayma değer katmak, zirve eklemek / bulabilirsiniz. <ol><li> Bilinen CA değerleri ve pSer ve PTHr 17 CB kimyasal değişikliklere zirve listesinde kimyasal kaymalar karşılaştırarak, ben kalıntı tipi, pSer veya PTHr tanımlayın. </li><li> karakteristik Ek 2 ppm kayması o I + 1 konumunda bir Pro kalıntısını varlığının belirlenmesiCA kimyasal kayma değeri 18 f. </li><li> I-1 pozisyonunda tortu doğasını belirlemek için Tau amino asit kalıntıları 19 için öngörülen kimyasal kaymalar bir tablo I-1 kalıntıya karşılık gelen, CA ve CB rezonansların kimyasal kayma değerleri, karşılaştır. </li></ol></li><li> HNCANNH spektrumda ilgi her [1 H 15 N] rezonans rezonans &#39;i&#39; 15 N çekirdeklerinin frekansları ve &quot;i-1 &#39;artıkları seçin. </li><li> 23 - Tau proteini 20 kimyasal kayma atama 15 N kimyasal kayma değerleri karşılaştırın. </li><li> diziye özgü atama tanımlamak için Tau dizisi ile özdeşleşmiş dipeptidler karşılaştırın. </li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Biz enzimatik modifiye Tau örnekleri karakterize etmek NMR spektroskopisi kullandık. Rekombinant sentezleme ve tam boyunda insan tau proteinini burada tarif edilen saflaştırma Benzer mutant tau ya da tau etki üretmek için kullanılabilir. Izotopik olarak zenginleştirilmiş protein, yeniden birleştirici ifade gerektiren NMR spektroskopi için gereklidir. Fosforilasyon alanların belirlenmesi rezonans atama ve 15 N, 13 C çift etiketli protein gerektirir. izotopların maliyeti göz önüne alındığında, iyi bi...

21. yüzyılda sağlık temel güçlüklerden biri gibi Alzheimer hastalığı (AH) gibi nörodejeneratif hastalıklar bulunmaktadır. Tau mikrotübül (MT) oluşumunu teşvik eden bir mikrotübüle bağlı proteindir. Tau eşit çeşitli nörodejeneratif hastalıkların iyi bilinen AD olduğu sözde tauopatıler, yer almaktadır. Bu hastalıklarda, Tau çiftlenmiş helezon şeklinde lifler (PHF&#39;ler) kendine gruplar ve fosforilasyon 1 ile posttranslasyonel modifikasyonlar (PTMS) birçok kalıntıları modifiye bulunur. Tau proteininin fosforilasyonu MT stabilizasyonu AD nöronları karakterize fonksiyon patolojik kaybı fizyolojik fonksiyonun iki düzenlenmesinde implike edilmektedir. Hastalıklı nöronların PHF&#39;lerin entegre Dahası, Tau proteini, kaçınılmaz 2 hiperfosforilatlandırılmaya edilir. 2-3 fosfat gruplarını içeren normal Tau aksine, PHF&#39;lerin içinde hiperfosforilize Tau 5-9 Phosphat içeriyorE grupları, 3. Tau hiperfosforizasyon&#39;un bazı bölgelerde ve fosforilasyon patolojik sitesi olarak adlandırılan ek yerleriyle fosforilasyonuna stokiyometri artışa hem de karşılık gelir. Ancak, üst üste seviye 4 nicel farklılıklara rağmen, AD ve fosforilasyon normal erişkin modelleri arasında var. Nasıl özel fosforilasyon olayları etkisi fonksiyonu ve Tau disfonksiyon büyük ölçüde bilinmemektedir. Biz, moleküler düzeyde PTMS tarafından Tau düzenleme deşifre hedefliyoruz. Tau moleküler yönlerini anlayışı derinleştirmek için, teknik zorlukların üstesinden gelmek için var. İlk olarak, Tau çözelti içinde yalıtılmış bir içsel düzensiz protein (IDP) &#39;dir. Bu tür proteinler, fizyolojik koşullar altında, iyi tanımlanmış üç boyutlu bir yapıya sahip olmaması ve fonksiyon (lar) ve yapısal özelliklerini incelemek için, özellikle biyo-fiziksel yöntemler gerektirir. Tau yerinden edilmiş kişilerin artan sınıf için bir paradigma olduğunu sık sık ilişkili bulunduBöyle nörodejeneratif hastalıklar gibi patolojiler, bu nedenle görevlerini altında yatan moleküler parametreleri anlamak için ilgi artmaktadır. İkincisi, Tau fosforilasyonu karakterizasyonu uzun 441 amino asit Tau izoformunun dizisi boyunca 80 potansiyel fosforilasyon siteleri ile, bir meydan okumadır. Antikorların bir dizi Tau fosforile epitoplarına karşı geliştirilmiş ve nöronlar ve beyin dokusunda patolojik tau saptanması için kullanılır. Fosforilasyon olayları Proline zengin bölgede yakın çoğu prolin-yönelimli kinazlar tarafından hedef en az 20 sitelerinde yer alabilir. Nitel (hangi sitelerin?) Ve (Ne stoikiometri?) Kantitatif karakterizasyonu bile en son MS teknikleri 5 tarafından zordur. NMR spektroskopisi çok konformerlerin topluluklar oluşturduğu dinamik sistemlerdir düzensiz proteinleri araştırmak için kullanılabilir. Yüksek çözünürlüklü NMR spektroskopisi başvurunun oldued Tau proteini hem yapısını ve fonksiyonunu araştırmak için. 8 - Buna ek olarak, Tau fosforilasyon profilinin karmaşıklığı fosforilasyon 6 tanımlanması için NMR kullanılarak moleküler araçlar ve yeni analitik yöntemlerin geliştirilmesine yol açmıştır. bir analitik yöntemin NMR fosfat dahil ölçüde küresel bir şekilde Tau fosforilasyon tanımlanması, tek bir deneyde, tüm tek-mevkili modifikasyonlarının görselleştirme ve miktar tayini için izin verir. Tau üzerinde fosforilasyon Literatürde bol birlikte, çoğu fosforilasyonu profilinin tamamı üzerinde bir belirsizlik geniş çapta ve böylece tek tek fosforilasyon olaylarının gerçek etkisini bırakarak antikorlar ile gerçekleştirilmiştir için bu husus çok önemlidir. PKA, Glikojen-sentaz kinaz 3p (GSK3), sikline bağımlı kinaz 2 / siklin A (CDK2 / CycA), sikline bağlı kinaz 5 (CDK5) / p25 eylemi içeren rekombinant kinazlarTau doğru fosforlaştırma etkinliği görülür ivator proteini, hücre dışı sinyal ile düzenlenen kinaz 2 (ERK2) ve mikrotübül-afinite düzenleyici kinaz (Mark), bir aktif formda hazırlanabilir. Buna ek olarak, iyi karakterize edilmiş fosforilasyon desen belirli bir Tau proteini izoformlarının üretilmesi için izin Tau mutantları tau&#39;nun fosforilasyonu kodunu çözmek için kullanılır. 8 - NMR spektroskopisi, sonra enzimatik olarak modifiye edilmiş Tau örnekleri 6 karakterize etmek için kullanılır. Tau in vitro fosforilasyonu glutamik asit (Glu) kalıntıları seçilen Ser / Thr mutasyon ile olduğu gibi sözde fosforilasyon daha zor olmasına rağmen, bu yaklaşım da yararları vardır. Gerçekten de, fosforilasyon, ne yapısal etkisi de etkileşim parametreler her zaman glutamik asit ile taklit edilebilir. Bir örnek Glu mutasyonları 9 ile yeniden değildir fosfoserin 202 (pSer202) etrafında gözlenen dönüş motifi / fosfotreonin 205 (pThr205) &#39;dir. <p claP = &quot;jove_content&quot;&gt; Burada, NMR incelemeleri için izotopik olarak etiketlenmiş Tau hazırlanması ilk olarak tarif edilecektir. ERK2 tarafından fosforile tau proteini fosforilasyon patolojik siteler olarak tanımlanan çok sayıda sitelerde modifiye ve böylece hiperfosforillenmiş Tau ilginç bir model temsil eder. Rekombinant ERK2 kinaz tarafından in vitro fosforilasyonuna Tau ayrıntılı bir protokol verilmektedir. 12 - ERK2 mitojen ile aktive edilmiş protein kinaz / ERK kinaz (MEK) 10 ile fosforilasyonu ile aktif hale gelir. değiştirilirse izotopik olarak etiketlenmiş tau proteininin hazırlanmasına ek olarak, PTMS tespit etmek için kullanılan NMR stratejisi açıklanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>pET15B rekombinant T7 ekspresyon plazmidi</td><td>Novagen</td><td>69257</td><td>-20 °C'de tutun; C</td></tr><tr><td>BL21 (DE3) dönüşümü yetkin E. coli bakteri</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527I</td><td>-80 ° C'de tutun; C</td></tr><tr><td>Otoklavlanmış LB Et Suyu, Lennox&nbsp;</td><td>DIFCO</td><td>240210</td><td>Bakteri Büyüme Ortamı</td></tr><tr><td>MEM vitamini 100x</td><td>Sigma</td><td>58970C</td><td>Bakteri Büyüme Ortamı</td></tr> <tr><td>Takviyesi15N, 13C-ISOGRO tam orta toz</td><td>Sigma</td><td>608297</td><td>Bakteriyel Büyüme Ortamı Takviyesi</td></tr><tr><td>15NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>299251</td><td>İzotopu</td></tr><tr><td>13C 6-Glukoz</td><td>Sigma</td><td>389374</td><td>İzotop Proteaz</td></tr><tr><td>inhibitörü tabletleri & nbsp;</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td>4 & derece'de tutun; C</td></tr><tr><td>1 ml'de 1 tablet, -20 ° C'de tutulabilen 40x çözeltidir; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>EUROMEDEX</td><td>1307</td><td>-20 ° C'de tutun & C</td></tr><tr><td>Homojenizatör (EmulsiFlex-C3)</td><td>AVESTIN</td><td></td><td>Lizisi 4 ° C'de gerçekleştirilir; C</td></tr><tr><td>Pierce ve ticaret; Boyanmamış Protein MW İşaretleyici</td><td>Pierce</td><td>266109</td><td></td></tr><tr><td>Aktif insan MEK1 kinaz, GST Etiketli</td><td>Sigma</td><td>M8822</td><td>-80 °C'de tutun; C</td></tr><tr><td>AKT & AUML; Saf kromatografi sistemi</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>FPLC</td></tr><tr><td>HiTrap SP Sepharose FF (5 ml kolon)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5156-01</td><td>Katyon değişim kromatografisi kolonları</td></tr><tr><td>HiPrep 26/10 Tuzdan arındırma</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5087-01</td><td>Protein Tuzdan Arındırma kolonu</td></tr><tr><td>PD MidiTrap G-25</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9180-08</td><td>Protein Tuz Giderme kolonu</td></tr><tr><td>Tris D11, %97 D</td><td>Cortecnet</td><td>CD4035P5</td><td>Döteryumlu NMR tamponu</td></tr><tr><td>5 mm Simetrik Mikrotüp SHIGEMI D2O (5 iç ve dış boru seti)& nbsp;</td><td>Euriso-top</td><td>BMS-005B</td><td>NMR Shigemi Tüpleri</td></tr><tr><td>eVol kiti-elektronik şırınga başlangıç kiti</td><td>Cortecnet</td><td>2910000</td><td></td></tr><tr><td>Pipetleme Bruker 900 MHz AvanceIII, üçlü rezonans kriyojenik prob kafalı</td><td>Bruker</td><td>NMR spektrometresi Veri toplama için</td>Bruker <td></td> NMR spektrometresi</tr><tr><td>Bruker 600 MHz Avance, üçlü rezonans kriyojenik prob kafalı</td><td>Bruker</td><td></td><td>NMR spektrometresi</td></tr><tr><td>TopSpin 3.1</td><td>NMR deneyleri için</td><td>Bruker</td><td></td> Edinme ve İşleme yazılımı</tr><tr><td>Sparky 3.114</td><td>UCSF (T. D. Goddard ve D. G. Kneller)</td><td></td><td>NMR veri Analiz yazılımı</td></tr></tbody></table>

Özünde düzensiz proteinlerin Çoklu fosforilasyon saptanma nükleer manyetik rezonans spektroskopisi

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Nöronal Tau proteininin agregatları, Alzheimer hastalığı hastalarının nöronlarının içinde bulunur. Hastalığın gelişimine, Tau'nun artmış, anormal fosforilasyonu eşlik eder. Hastalıktaki Tau fonksiyonlarının ve işlev bozukluklarının moleküler araştırması sırasında, Tau'nun çoklu fosforilasyonlarını tanımlamak için nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi kullanılır. Burada, NMR çalışmaları için izotopik zenginleştirme ile bakterilerde Tau'nun rekombinant üretiminin ayrıntılı protokollerini sunuyoruz. Tau'nun ısı kararlılığından ve yüksek izoelektrik noktasından yararlanan saflaştırma adımları açıklanmaktadır. Tau'nun rekombinant aktive edilmiş ERK2 ile in vitro fosforilasyonu için protokol, çoklu fosforilasyonların üretilmesine izin verir. Protein numunesi, bu adımların yayınlanmasında veri toplama için hazırdır. Spektrometrede kayda başlamak için parametre kurulumu daha sonra dikkate alınır. Son olarak, NMR verilerine dayalı olarak modifiye Tau'nun fosforilasyon bölgelerini belirleme stratejisi açıklanmaktadır. Bu metodolojinin, immüno-tespit veya kütle spektrometresi (MS) gibi fosforilasyon bölgelerini tanımlamak için kullanılan diğer tekniklere kıyasla faydası tartışılmaktadır.

Şekil 3A, elüsyon gradyanı gözlenen 280 nm&#39;de büyük bir emilim pik gösterir. kromatogram üzerinde akrilamid jeli üzerinde görüldüğü gibi, bu seviye, saflaştırılmış tau proteininin karşılık gelir. Şekil 3B proteininin tuzsuzlaştırma verimli olmasını sağlamak, 280 nm ve iletkenliği zirvesinde bir iyi ayrılmış emilim pik gösterir. Şekil 4, bir protein, SDS-PAGE analizi ile çok sayıda protein fosforilasyonu 16 karakteristik gözlenen jel shift (kuşak 2 ve 3). Gösterir Şeki...

Burada, Tau proteinini bir vaka çalışması olarak kullanarak, Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi (NMR) ile içsel olarak düzensiz bir proteinin çoklu fosforilasyonlarını tanımlamak için bir yöntem açıklıyoruz. Rekombinant Tau, veri toplama ve analizinden önce bir kinaz ile in vitro olarak izotopik olarak zenginleştirilir ve modifiye edilir.

Özünde Düzensiz Proteinlerin Çoklu fosforilasyon Saptanma Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Bu metodolojinin genel amacı, bir vaka çalışması olarak tau proteini kullanılarak nükleer manyetik rezonans spektroskopisi ile içsel olarak düzensiz bir proteinin çoklu fosforilasyonunu tanımlamaktır. Bu yöntem, fosforilasyonun moleküler ortağı ile protein etkileşimi üzerindeki etkisi gibi hastalıkla ilgili moleküler düzenlemedeki kilit soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, düzensiz bir proteindeki bölgeye özgü fosforilasyonu tanımlayabilmemiz ve bunu yapısal ve fonksiyonel değişikliklerle ilişkilendirebilmemizdir.Bu yöntem, işlev hakkında içgörü sağlayabilir. aPtc virüsünden DNA proteininin düzensiz kalıntıları gibi diğer proteinlere de uygulanabilir Bu tekniğin uygulamaları, protein, protein etkileşim inhibitörlerinin geliştirilmesi yoluyla tedaviye kadar uzanır. Bu yöntem, grubumuzdan doktora öğrencileri olan Clement Danis, Clement Despres, Luiza Bessa ve Hamida Merzougui tarafından gösterilecektir.Başlamak için, 50 mikrolitre yetkin BL21 hücresini 100 nanogram plazmit DNA ile nazikçe karıştırın ve 1.5 mililitrelik bir plastik tüpte mikrogram plazma DNA'sı başına 10 ila 15 milyon koloni oluşturun. Hücre karışımını 30 dakika boyunca buzun üzerine yerle

nuclear-magnetic-resonance-spectroscopy-for-identification-multiple

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu video, bir proteindeki çoklu fosforilasyonları tanımlamak için nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMR) tekniklerinin kullanımını göstermektedir. Bir proteinin spesifik amino asitte fosforilasyonu, komşu amid hidrojenin deshieldasyonuna neden olur ve bu da spektral farkı oluşturur.

Proteinlerdeki Çoklu Fosforilasyonları Tanımlamak için Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi

Burada bitki protein komplekslerinin saflaştırılması ve karakterizasyonu için bir protokol açıklar. Biz bir kompleks içinde bir tek proteini imüno tarafından, bu yüzden onun translasyon sonrası modifikasyonlar ve etkileşim ortakları belirlemek olduğunu göstermektedir.

Plant protein kompleksleri, çevirim sonrası değişikliklerin belirlenmesi

Protein fosforilasyonu, hücrelerin hücre dışı ortamlarındaki bilgileri nasıl yorumladığının ve ona nasıl yanıt verdiğinin merkezi bir özelliğidir. Burada, ilgilenilen bir substratı (substratları) fosforile eden kinazları hızlı bir şekilde tanımlamak için memeli hücrelerinden saflaştırılmış kinazları kullanan yüksek verimli bir tarama protokolü sunuyoruz.

Yüksek Verimli Tarama kullanma Kinaz-substrat Çiftlerinin Kimlik

Peptid rekabet testleri, çeşitli moleküler ve immünolojik deneylerde yaygın olarak kullanılır. Bu makale , in vitro oligopeptitle rekabet eden kinaz testi için ayrıntılı bir yöntem ve ilgili fosforilasyon sitelerini bulmak için yararlı olabilen ilişkili validasyon prosedürlerini açıklamaktadır.

Fosforilasyon Saha Tespiti İçin Oligopeptide Rekabet Testi

Supramolecular protein derlemeler atomik çözünürlükte yüksek alaka nedeniyle çok önemli rolleri biyolojik olayları çeşitli yapılardır. Burada, biz bir protokol tarafından magic-açı katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (MAS SSNMR) iplik çözünmez ve kristal makromoleküllerin protein derlemeler üzerinde yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmalar gerçekleştirmek için mevcut.

Atomik yapısal çalışmaların makromoleküllerin meclisleri tarafından katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi

Siklin bağımlı kinaz 1 (Cdk1) hücre döngüsünün G2 aşamasında aktif ve birçok hücresel yolları düzenler. Burada, bir vitro kinaz tahlil için bir protokol ile bu önemli kinaz hücresel hedefleri oluşturmak üzere Cdk1 özgü fosforilasyon siteler tanımlaması sağlar Cdk1 mevcut.

Siklin bağımlı kinaz 1 tanımlaması belirli fosforilasyon siteleri bir Vitro kinaz tarafından tahlil

Doğası gereği düzensiz proteinlerde zayıf ve geçici moleküller arası ve moleküller arası etkileşimleri tespit etmek için paramanyetik gevşeme geliştirme NMR spektroskopisinin uygulanması için bir protokol sunulmaktadır.

İçsel Olarak Düzensiz Proteinlerin Kendi Kendine İlişkilerini Tespit Etmek ve Karakterize Etmek için Paramanyetik Gevşeme Geliştirmesi

Mevcut protokol, geliştirilmiş bir tek moleküllü pull-down (SiMPull) testi kullanarak protein fosforilasyonunu ölçmek için numune hazırlama ve veri analizini açıklamaktadır.

Protein Fosforilasyonunun Miktarının Belirlenmesi için Optimize Edilmiş Tek Moleküllü Bir Pull-Down Testi

Burada, endojen fosfoprotein fosfatazların ve bunların hücre ve dokulardan etkileşen proteinlerinin zenginleştirilmesi ve kütle spektrometrisine dayalı proteomiklerle tanımlanması ve nicelleştirilmesi için bir protokol sunuyoruz.

Fosfoprotein fosfatazları ve bunların interaktörlerini tanımlamak için kütle spektrometrisine dayalı bir yaklaşım

Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi, yapısal protein dinamiklerini kalıntıya özgü bir şekilde karakterize edebilir. NMR 15N R1 ve R2 gevşeme ve {1H}-15N heteronükleer Overhauser etkisi (hetNOE) deneylerini kaydetmek için pikosaniye ila nanosaniye zaman ölçeğine duyarlı uygulamalı bir protokol sunuyoruz.

NMR 15N Proteinlerin Pikosaniye ve Nanosaniye Yapısal Dinamiğinin İncelenmesi için Gevşeme Deneyleri

Öğrenin, Tau proteininde çoklu fosforilasyon sitelerini NMR spektroskopisi ile belirleme yöntemini. Bu teknik, yapısal ve fonksiyonel değişiklikleri moleküler düzeyde inceleyerek nörodejeneratif hastalıklara yönelik tedavi stratejileri geliştirmeye katkı sağlar.

Özünde Düzensiz Proteinlerin Çoklu fosforilasyon Saptanma Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi

Daha fazla video keşfet