Biyoaktif proteinler veya peptidler hidrojel Photochemistry biyolojik uygulamalarda kullanarak üzerinde desenlendirme

Bu metodolojinin genel amacı, hücresel yanıtların incelenmesinde kullanılacak immobilize biyoaktif uzamsal protein desenleri oluşturmaktır. Bu yöntem, biyomalzeme stratejileri kullanılarak in-vivo sinyallerin yeniden canlandırılmasına olanak tanır. Bu teknik; ardışık büyüme faktörleri, hücre-hücre sinyalleşmesi ve uzamsal spesifik biyokimyasal ipuçları gibi standart kültür yöntemleriyle elde edilemeyen belirli sinyal motiflerinin doğru şekilde taklit edilmesini sağlar.

Bu protokol, substrat sertliğini ve protein desenlemesini ayarlamak için basit bir yöntem sunduğundan mevcut yöntemler açısından önem taşımaktadır. Bu yöntem, doku mühendisliği ve rejeneratif tıp teknolojilerini geliştirebileceği gibi, doku gelişimi ve kök hücre kaderi gibi diğer sistemlerin incelenmesinde de uygulanabilir. Başlangıç olarak, beraberindeki metin protokolünde açıklandığı şekilde, temel hidrojel bileşeni olan polietilen glikol diakrilat, foto başlatıcı lityum fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinat ve ECM proteini fibronektin için stok çözeltileri steril koşullar altında hazırlayın.

Bireysel alikotları kullanmadan veya saklamadan önce, her çözeltiyi 0,22 mikronluk bir şırınga filtresi kullanarak steril filtreleyin. Ardından, PEG-DA çözeltisini ışıktan korumak için folyo ile sarın. Foto başlatıcı stok çözeltisini ışıktan korumak için folyoya sarın ve hazırlanan çözeltiyi dört derece celsius'ta birkaç ay boyunca saklayın.

Fibronektin stok çözeltisi donmuşsa, steril alikotu birkaç saat boyunca buz üzerinde veya gece boyunca dört derece celsius sıcaklıkta çözülmeye bırakın. Her jel kalıbı için bir adet polyester sayfayı otoklavlayarak başlayın. Ardından, her jel kalıbı için üç plastik ara parçalı iki cam lamı en az iki saat boyunca %70 etanol içinde bekletin.

Ek olarak, her bir jel kalıbı için beş adet binder klibi %70 ethanol içinde 10 dakika boyunca bekletin. Cam lamelleri, ara parçaları ve binder klipleri, birkaç saat boyunca havada kurumaları için hücre kültürü davlumbazında küçük bir otoklav kağıdının üzerine yerleştirin. Ardından, 0,5 milimetre kalınlığındaki plastik ara parçaları bir cam lamelin kenarlarına yerleştirerek hidrojeller için kalıpları hazırlayın.

İkinci lamı üst kısma yerleştirin ve ardından ara parçaları birbirine yakın şekilde ataçlarla sıkıca sabitleyin. Son olarak, kullanmadan önce kalıbı çekerdeğe yerleştirip UV ışığını 30 dakika boyunca açık tutarak yüzey sterilizasyonunu gerçekleştirin. Sterilizasyon işleminin ortasında, her iki yüzeyin de maruz kaldığından emin olmak için kalıbı ters çevirin.

Eşlik eden metin protokolünün birinci tablosunda açıklandığı şekilde jel öncül çözeltilerini hazırlayın. Ardından, hidrojeli oluşturmak için PEG-DA, fibronektin ve foto başlatıcı hacimlerini birbirleriyle karıştırın. Homojen bir çözelti elde etmek için çözeltiyi pipetle kuvvetlice karıştırın ancak hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin.

Jel öncül çözeltisini, jel kalıbının iki cam lamı arasına dikkatlice pipetleyin. Ardından, kalıbı bir UV ışığı altına yerleştirin ve hidrojeli oluşturmak için bir ila iki dakika boyunca maruz bırakın. Jel oluştuktan sonra, mandalları çıkarın ve iki yan ara parçaya zıt yönde basınç uygulayarak üst cam lamı nazikçe kaldırın.

Ardından, uygun boyutlu bir biyopsi punch'ı kullanarak hidrojel örnekleri kesin. Tekrarlar ve kontrol örnekleri olarak kullanılmak üzere jel dikdörtgeninden birden fazla hidrojeli punch ile çıkarın. Fotomaskeyi 10 dakika boyunca %70 etanol içinde bekleterek sterilize edin.

Ardından, foto maskenin bir hücre kültürü davlumbazında havada kurumasını bekleyin. Sonra, yüzey desenleme için her bir kesilmiş hidrojelin yüzeyine santimetrekare başına bir ila iki µL tiyollü protein çözeltisi pipetleyin. Protein immobilizasyonunun homojen olması için protein çözeltisinin hidrojel yüzeyine eşit şekilde yayılması önemlidir.

Fotoğraf maskesini dikkatlice hidrojelin yüzeyine yerleştirin. Maske ile hidrojel yüzeyi arasında oluşan hava kabarcıklarını gidermek için maskenin üzerine nazikçe bastırın. Ardından, hidrojeli UV ışığı altına yerleştirin ve 30 ila 60 saniye boyunca ikinci bir UV ışığı döngüsüne maruz bırakın.

Reaksiyona girmemiş türleri uzaklaştırmak için hidrojelleri PBS ile yıkayın ve her bir hidrojeli, desenli yüzeyi yukarı bakacak şekilde kuyucuk plakasına yerleştirin. Ardından, jelleri gece boyunca 4 °C'de PBS içinde yıkayın. Kuyucuklardaki PBS'yi uzaklaştırın, ardından her kuyucuğa 250 µL bazal EGM2 ekleyin ve jelleri 37 °C'de 5 ila 10 dakika inkübe edin.

İnkübasyon sırasında, standart teknikler kullanarak neredeyse konfluen hale gelmiş HUVEC'lerden oluşan bir plağı tripsin ile sindirerek tek hücre süspansiyonuna dönüştürün. Ardından, hücre süspansiyonunu santrifüjleyin ve süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın. Hücre peletini, büyüme faktörü eklenmemiş bazal EGM2 ile yeniden süspande edin ve hücre süspansiyonundan bir miktarını hemositometreye ekleyin.

Konsantrasyonu belirlemek için hücreleri sayın. Ardından, hidrojellerin kuyucukların dibinde olduğundan ve yüzmediğinden emin olmak için hidrojelleri içeren plakayı 300 x G'de üç dakika boyunca santrifüjleyin. Hidrojellerin kuyucuklar içinde yüzmemesi kritiktir.

Yüzen hidrojeller, hücre ekimindeki başarıyı sınırlayacak ve hidrojel görüntülemede sorunlara yol açacaktır. Jelleri rahatsız etmemek için, her bir hidrojel yüzeyinin merkezine santimetrekare başına 75,000 hücreyi yavaşça pipetleyin. Ardından, plakayı 37 °C'deki bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.

Protein paternine yanıt olarak hücre göçünü gözlemlemek için kabı birkaç gün boyunca periyodik olarak çıkarın. Her iki ila üç günde bir medyanın %50'sini değiştirin. Hidrojeller oluşturulurken, istenen substrat sertliğini elde etmek için çeşitli öncül PEG-diakrilat konsantrasyonları kullanılabilir.

Burada gösterildiği üzere, %20 PEG-DA çözeltisi 100 kilopascal'ın üzerindeki bir sertlik ile ilişkilidir. Ayrıca, hem foto başlatıcı konsantrasyonunun hem de UV maruziyet süresinin dikkate alınması önemlidir; çünkü bu değişkenlerden herhangi birindeki artış, burada lizozom biy Aktivitesi ile temsil edilen, bağlı moleküllerin biyolojik aktivitesini azaltacaktır. Hidrojel oluşumu sırasında UV maruziyetini minimize etmek, sonraki protein immobilizasyon reaksiyonları için serbest akrilat fonksiyonel gruplarının korunması açısından kritiktir.

İki dakikadan daha uzun süre UV ışığına maruz kalan hidrojeller, kırmızıyla gösterilen immobilize protein desenlerini oluşturamazlar. Ayrıca, protein desenine uygulanan UV maruziyeti arttıkça, yüzeye daha fazla protein reaksiyon verir. Doğru şekilde hazırlandığında, hücrelerin davranışlarını manipüle etmek için bu desenli hidrojel substratlar üzerinde kültür yapılabilir.

Burada, endotel hücreler VEGF desenli PEG hidrojellerinin yüzeyine homojen bir şekilde ekilmiştir. Ekimden iki gün sonra, endotel hücrelerin VEGF'nin immobilize edildiği hidrojel bölgelerine doğru göç ettiği gözlemlenmiştir. Bu protokolün geliştirilmesinin ardından, araştırmacılar in-vitro hücre sistemleri için yeni biyoaktif platformları keşfetmek amacıyla herhangi bir proteini veya peptidi immobilize etmek için bu yöntemi kullanabilirler.

Bu prosedürü uygularken, immobilize edilmiş moleküllerin biyolojik aktivitesini korumak için foto başlatıcı konsantrasyonunu ve UV maruziyet süresini minimize etmeyi hatırlamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, biyoaktif proteinlerin ve peptitlerin PEG hidrojelleri üzerine nasıl desenlendiği, hücrelerin hidrojeller üzerine nasıl üniform şekilde ekildiği ve sonucunda ortaya çıkan hücre tepkisinin nasıl gözlemlendiği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.