Yordam ve anahtar optimizasyon stratejileri için bir otomatik Kapiler elektroforetik tabanlı Immunoassay yöntemi

Bu prosedürün genel amacı, ticari bir platform kullanarak bir kılcal elektroforez immünolojik testini göstermektir. Bu platform, hücre kültürü dokularından ve biyosıvılarından elde edilebilecek biyolojik bir numuneden protein hedeflerini ayırt edecek ve niceliklendirecektir. İşlem, proteini iki ila 440 kilodalton arasında değişen boyuta göre inceler.

Bu otomatik prosedürün Western blot gibi geleneksel prosedürlere göre avantajı, kılcal elektroforetik immünolojik testlerin jellere, transfer cihazlarına ve manuel yıkamalara olan ihtiyacı ortadan kaldırmasıdır. Ayrıca, gereken mutlak protein miktarı yaklaşık 10 kat daha azdır, bu da prosedürü nadir hücre tipleri veya sınırlı örnekler için ideal hale getirir. Ek olarak, sonuçlar otomatik sistemler kullanılarak üç saat gibi kısa bir sürede elde edilir ve geleneksel Western blot prosedürlerinden daha kantitatif ve tekrarlanabilir olduğu gösterilmiştir.

Numune tamponu, ditiyotreitol, floresan ana karışım ve biyotinillenmiş merdiven dahil olmak üzere kitten numuneleri ve reaktifleri üreticinin ürün ekine göre hazırlayın. En sevdiğiniz yöntemi kullanarak protein örneklerini hazırlayın. Burada BEAS-2B hücre kültürlerinden tam hücre ekstraktını izole ettik.

Protein örneklerini örnek tamponu ile seyreltin. İstenen nihai protein konsantrasyonunu elde etmek için bir kısım beş-X floresan ana karışımını dört kısım seyreltilmiş numune ile karıştırın. Mikrolitre başına 1,2 mikrogramlık bir protein stok konsantrasyonundan başlayarak, mikrolitre başına 70 mikrolitre 0.2 mikrogram nihai protein konsantrasyonu yapmak için örnek bir hesaplama gösterilmiştir.

Ana karışım toplam hacmin 1 / 5'idir, bu durumda 14 mikrolitredir. İhtiyaç duyulan protein stoğu hacmini hesaplamak için, istenen nihai konsantrasyonu toplam hacimle çarpın ve protein stok konsantrasyonuna bölün. Numune tamponunun hacmini hesaplamak için ana karışım ve stok hacimlerini toplam hacimden çıkarın.

Hazırlanan numuneleri ve merdiveni 95 santigrat derecede beş dakika ısıtarak denatüre edin. Bazı proteinlerin daha yumuşak denatüre etme koşulları gerektirebileceğini unutmayın. Örneğin, protein agregasyonunu önlemek ve göçü iyileştirmek için 10 dakika boyunca 70 derece.

Daha yüksek moleküler ağırlıklarda yoğun bulaşma varsa bu seçeneği göz önünde bulundurun. Sağlanan seyrelticide istenen antikor seyreltmelerini hazırlayın. Antikorların genellikle kılcal damar bazlı immünoassay için geleneksel Western blotlamadan daha yüksek konsantrasyonlarda kullanıldığını unutmayın.

Her kullanımda bire bir luminol ve peroksit karışımı taze hazırlayın. Numuneleri ve reaktifleri, şablonda gösterilen hacimleri kullanarak tahlil plakasına pipetleyin. Renk kodlaması, reaktiflerin ve numunelerin tahlil plakasına uygun şekilde yüklenmesini temsil eder.

A1 kuyusuna biyotinile edilmiş merdiven pipetleyin, A2'den A25'e kadar olan kuyulara hazırlanan numuneler. B1'den B25'e kadar olan kuyulara ve C1 kuyusuna sağlanan antikor seyrelticisi. C2'den C25'e kadar olan kuyulara karşı birincil antikor. Streptavidin HRP'den D1 kuyusuna. D2'den D25'e kadar olan kuyulara ikincil antikor.

Ve luminol-peroksit karışımı E1'den E25'e kadar olan kuyulara karışır. Daha büyük orta plaka kuyucuklarının ilk üç sırasına yıkama tamponu ekleyin. Kılcal immünoassay cihazını açın ve beraberindeki yazılımı açın.

Kılcal kartuşu ve tahlil plakasını üreticinin talimatlarına göre makineye yükleyin ve çalıştırmaya başlayın. Çalışma tamamlandığında, floresan standartlarının doğru bir şekilde tanımlandığını ve gerekirse doğru olduğunu kontrol edin. Ek olarak, biyotinile edilmiş merdivenin kullanılan kit için doğru boyutlandırma tepe noktalarını gösterdiğini doğrulayın.

Daha fazla ayrıntı için üreticinin hızlı başvuru kılavuzuna veya ürün kılavuzuna bakın. Maruz kalma süresi, protein konsantrasyonu ve antikor seyreltmesi gibi tahlil koşullarının optimizasyonu, doğru, tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için önemlidir. Bu koşullar, her model sistem antikor kombinasyonuna özgüdür ve bu nedenle, her yeni test için ampirik olarak belirlenmelidir.

Kantitatif sonuçlar üretme yeteneği, luminol substratının hızlı bir şekilde tükenmediği bir maruz kalma süresinin analizine bağlıdır, çünkü substrat tükenmesi sinyal kaybına veya sinyal yanmasına neden olur. Bu, şekil ikide gösterildiği gibi farklı kemilüminesans maruz kalma sürelerinde verilerin incelenmesiyle belirlenebilir. Kullanılan aletle maruz kalma süreleri beş ila 480 saniye arasında değişmektedir.

Şerit görünümleri, bir ila 500 seyreltmede p53 DO-1 antikoru ile incelenen BEAS-2B ekstraktları için azalan protein konsantrasyonlarını gösterdi. Cihaz yazılımında tepe yükseklikleri olarak bildirilen kemilüminesans sinyal katsayıları üst üste bindirilir. Görsel bantların yoğunlukları cihaz tarafından otomatik olarak ayarlanır ve bir panelden diğerine karşılaştırılamaz.

Burada görüldüğü gibi, luminol tükenirse, sıralı olarak daha uzun pozlamalarla sinyal katsayısı azalır. Sinyal kaybolmaya başlar ve tepe noktası en uzun iki pozlamada bölünür. Bu nedenle, veri analizi için 15 saniyelik kısa bir pozlama süresi seçilmiştir.

Toplam protein girdisi de her bir test ve model sistemi için optimize edilmelidir. Kantitatif değerlendirme için, ölçümler her bir testin doğrusal dinamik aralığı içinde alınmalıdır. Tepe alanı ile ölçülen sinyaldeki değişikliklerin, numunedeki protein miktarındaki değişikliklerle orantılı olduğu durumlarda.

Lizat titrasyonu, bir ila 500 p53 DO-1 veya bir ila 50 alfa-Tubulin antikoru ile problandığında BEAS-2B lizatının şerit görünümlerini gösterir. Doğrusal regresyon analizi, tahlillerin test edilen tüm aralık boyunca doğrusal olduğunu doğrular. Doğrusal aralığın ortasındaki toplam protein konsantrasyonları, her iki yönde de potansiyel hedef protein varyasyonunu barındıracak şekilde seçildi.

Son bir optimizasyon değerlendirmesi olarak, uygun primer antikor seyreltmesi değerlendirilmelidir. Sütürasyon konsantrasyonlarında antikorların kullanılması, ölçülen herhangi bir sinyal değişikliğinin yalnızca protein miktarındaki değişikliklerden kaynaklandığından emin olmaya yardımcı olur. Mavi ve turuncu noktalarla temsil edilen iki BEAS-2B protein örneği, seri olarak seyreltilmiş alfa-Tubulin antikoru ile incelendi.

Tepe alanı olarak ölçülen kemilüminesans sinyali, antikor seyreltmesine karşı çizildi. Doygunluk, eğrinin gözle görülür bir platoya başladığı bir ila 50 seyreltme yakınında gözlendi. Bu nedenle, bu antikor için optimal seyreltme olarak bir ila 50 seçildi.

Bu videoyu izledikten sonra, ProteinSimple Wes kılcal damar bazlı immünoassay cihazında numune hazırlama, numune yükleme ve analiz yapma konusunda kendinizi rahat hissetmelisiniz. Bu prosedüre hakim olduktan sonra, tüm çalışma 25 örnekle üç saat içinde gerçekleştirilebilir. Bir çalışmayı analiz ederken, her kılcal damar ve numune için kalite kontrolü yapmak önemlidir.

Bu, biyotinile edilmiş bir merdivende floresan standartlarının doğrulanmasını içerir. Tepe noktaları yanlış tanımlanırsa, analiz yazılımı esas olarak doğru tepe noktalarını belirlemek ve yanlış tanımlanan tepe noktalarını ortadan kaldırmak için kullanılmalıdır. Laboratuvardaki tüm moleküler biyoloji tekniklerinde olduğu gibi, kendinizi ve numunelerinizi korumak için uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın.

Buna laboratuvar önlüğü, eldivenler, koruyucu gözlükler ve kapalı ayakkabılar dahildir. Ölçülen her yeni hedef için veya farklı numune kaynakları kullanıldığında optimizasyonun yapılması gerektiğini akılda tutmak önemlidir. Doğrulama ve takip adımları, saflaştırılmış protein veya epitop kullanılarak antikor özgüllüğünün ve sinyalinin değerlendirilmesini içerir.

Bir dizi numune seyreltmesi kullanılarak testin dinamik aralığının test edilmesi ve bir antikor konsantrasyon aralığı üzerinde sinyal doygunluğunu değerlendirerek antikor seyreltmesinin optimize edilmesi. Optimize edildikten sonra, bu kılcal immün prosedür, Western blot gibi geleneksel yöntemlere kıyasla biyolojik örneklerin hedef proteinini ölçmek için daha hızlı, daha kantitatif bir yöntem sağlamalıdır.