Yalıtım endotelyal Progenitor Hücre insan göbek kordon kanı

Bu prosedürün genel amacı, endotelyal progenitör hücreleri insan göbek kordonu kanından izole etmektir. Bu yöntem, endotelyal progenitör hücrelerin, vasküler greftlerin doku mühendisliği için otolog hücreler olarak potansiyel kullanımları için kordon kanından izolasyonunu tanımlar. Bu tekniğin temel avantajı, izolasyon işleminin herhangi bir amino ayıklamasına gerek kalmadan özel ortamlarda yapılabilmesidir.

İzole edilmiş endotelyal progenitör hücreler neovaskülarizasyonu incelemek için kullanılabilir ve raporlar ayrıca bu hücrelerin kardiyovasküler hastalık riski olan hastaları tanımlamak için biyobelirteç olarak kullanılabileceğini önermiştir. İzolasyon prosedürüne başlamadan önce, altı kuyucuklu plakayı iki mililitre taze hazırlanmış sıçan kuyruğu ve her oyuk için bir kollajen çözeltisi ile önceden kaplayın. Plakayı 37 santigrat derece ve% 5 CO2 inkübatörde en az bir saat dengeleyin.

Daha sonra yaklaşık 25 mililitre kordon kanını bire bir konsantrasyonda HBSS ile seyreltin. Daha sonra, 50 mililitrelik konik bir tüpe 20 mililitre yoğunluk gradyan orta reaktifi ekleyin ve kanı ortama katmanlamak için tüpün duvarından 20 mililitre seyreltilmiş kordon kanını dikkatlice dağıtın. Hücreleri santrifüjleme ile ayırın, ardından plazma tabakasının dikkatli bir şekilde çıkarılması.

18 gauge iğne ile donatılmış bir şırınga kullanarak, buffy coat içeren mononükleer hücreyi 50 mililitrelik yeni bir tüpe toplayın. Ve hücrelere eşit miktarda endotelyal bazal ortam ekleyin. Hücreleri santrifüjleme ile yıkayın ve elde edilen damaktaki kırmızı kan hücrelerini buz üzerinde beş mililitre amonyum klorür çözeltisi ile parçalayın.

Ara sıra çalkalamadan beş ila 10 dakika sonra, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve beyaz peleti taze endotelyal büyüme ortamında yeniden süspanse edin. Saydıktan sonra, altı oyuklu plakanın her bir oyuğundan kollajeni aspire edin ve kuyucukları PBS'de üç kez yıkayın. Mononükleer hücreleri, kuyu konsantrasyonu başına iki mililitre ortam başına bir kez 10 ila yedinci hücrelerde tohumlayın.

Ve plakayı 24 saat boyunca inkübatöre geri koyun. Ertesi gün, hücreleri taze endotelyal büyüme ortamı ile bir kez durulayın. Daha sonra yıkamayı üç mililitre taze endotelyal büyüme ortamı ile değiştirin ve hücreleri hücre kültürü inkübatörüne geri koyun.

Parlak bir alan mikroskobu kullanarak, endotel hücre kolonilerinin ilerlemesini izlemek için hücrelerin günlük görüntülerini elde edin ve büyümelerini izlemek için kolonilerin ortaya çıktığı plakaları işaretleyin. Endotel hücre kolonileri yaklaşık üç milimetre boyuta ulaştığında, hücre kültürü inkübatöründe en az bir saat boyunca bir T25 kültür şişesini taze sıçan kuyruğu bir kollajen ile kaplayın. Daha sonra hücreleri, hücre kültürü inkübatöründe iki ila üç dakika boyunca oyuk başına 150 mikrolitre% 0.05 Tripsin-EDTA ile hasat edin.

Bağlı hücreleri yerinden çıkarmak için plakaya hafifçe vurun. Hücreler ayrılmaya başladığında, hemen iki mililitre taze endotelyal büyüme ortamı ekleyin ve hücreleri tek bir 15 mililitrelik konik tüpe çekin. Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti taze endotelyal büyüme ortamında yeniden süspanse edin.

Saydıktan sonra, kollajen kaplı şişedeki hücreleri, şişe yoğunluğu başına üç mililitre ortamda beş kez 10 ila beşinci hücrelere tohumlayın ve şişeyi bir geçiş olarak işaretleyin. Daha sonra şişeyi inkübatöre geri koyun ve koloni% 90'a ulaştığında hücreleri yeniden tohumlayın. Kollajen ile muamele edilmiş plakalara tohumlandıktan sonra, ilk koloni büyümesi tipik olarak beş ila dokuzuncu günler arasında gözlenir.

Koloniler, kültürün erken aşamalarında büyümeye ve iğ şeklinde bir hücre morfolojisi elde etmeye devam eder, bu daha sonra parke taşı benzeri bir morfolojiye ilerler. Her pasajda hasat edilen toplam hücre sayısı, kültürdeki toplam gün sayısı ile doğrudan ilişkili olarak artar. Western blot analizi, kültürlenmiş endotel hücreleri tarafından CD 31 ve CD 34'ün erken bir ekspresyonunu ortaya koymaktadır ve bu, sonraki geçişlerle azalmış gibi görünmektedir.

Bununla birlikte, vasküler endotelyal büyüme faktörü reseptörü ikisinin ekspresyonu, ilk geçişten sonra gözlemlenenden biraz daha düşük bir ekspresyon seviyesinde olmasına rağmen, zaman içinde korunur. Dikkat çekici bir şekilde, endotelyal progenitör hücreler, örneğin pozitif bir kontrol olarak dahil edilebilen kapak interstisyel hücre lizatlarının aksine, mezenkimal hücre markörü alfa düz kas aktini için pozitif değildir. Tüm izolasyon işlemi, elde edilen kordon kanı ünitesine bağlı olarak beş saatten daha kısa sürede tamamlanabilir.

Mononükleer hücrelerin endotelyal büyüme ortamında izole edilmesinden ve tohumlanmasından sonra, EPC kolonilerinin kültürde ortaya çıkması genellikle beş ila dokuz gün sürer. Önerilen izolasyon yöntemi, endotelyal progenitör hücrelerin kültürlenmesi için özel ortamlar kullanır ve endotel belirteçlerine sahip olma gerekliliği kadar bir akış sitometresinin kullanımından kaçınır. Bu yöntem aynı zamanda kısa bir süre içinde yüksek miktarlarda endotelyal progenitör hücreler elde etmek için etkili bir protokol sağlar.

Bu videoyu izledikten sonra, endotelyal progenitör hücrelerin insan göbek kordonu kanı ünitelerinden nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız. İnsan göbek kordonu kanının tehlikeli olabileceğini ve atık kan ve hücre kültürü ürünlerinin uygun şekilde atılmasının takip edilmesi gerektiğini unutmayın.