Name: İçinde üç boyutlu Vitro hücre göç karakterize ortamlar yara (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Öğrenin, üç boyutlu fibrin matris içinde hücre göçünü ve yara iyileşmesindeki etkilerini nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem, hücre davranışlarını in vivo ortamda çalışmak için tekrarlanabilir bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu iş için finansman Amerikan Kalp Derneği (16SDG29870005) ve North Carolina Devlet Üniversitesi Araştırma ve yenilik tohum finansman ile sağlandı.

1. gün 1: hücre ve reaktif hazırlık Not: tüm hücre ve reaktif hazırlık biyolojik Emanet örneklerinin kontaminasyonu önlemek için kabine gerçekleştirilmelidir.
<ol><li>Sıcak filtre Dulbecco &#39; s modifiye kartal &#39; s orta (DMEM), fetal sığır serum (FBS), L-glutamine ve penisilin/streptomisin 37 ° C su banyosunda.</li>
	<li>Hazırlama yenidoğan insan dermal fibroblast (HDFn) medya ilave tarafından ısıttı DMEM %10 FBS, % 1 penisilin/streptomisin ve % 1'l-glutamin.</li>
	<li>Donmuş HDFns ve 200 x g de 8 dk santrifüj dondurma orta kaldırmak için bir şişe çözülme. 1 x 10 6 hücre/mL ve tohum yoğunluğu bir T-75 kültür şişesi içine de hazır HDFn medya hücrelerde resuspend.</li>
	<li>(37 ° C, % 5 CO 2) hücre çoğalması izin vermek için bir kuluçka yer şişeye.</li>
	<li>Mağaza HDFn medya 4 ° C.</li>
	<li>Yanlısı ve anti migratory reaktifler gerektiği gibi hazırlayın.</li>
</ol> 2. 3. gün: Küresel hazırlık <ol><li>bir kültür hood örneklerinin kontaminasyonu önlemek için aşağıdakileri gerçekleştirmek.</li>
	Hücrelerin % 80 confluency, geldiğinizde <li>Aspire medya ve % 0.25 5 mL ekleyin tripsin-EDTA. 37 ° C kuluçka tam hücreleri şişesi yüzeyinden ayırmak 5 min için mağaza flask.</li>
	<li>5 mL ılık medya tripsin nötralize etmek için şişe ekleyin.</li>
	<li>Bir microcentrifuge tüp mix 10 μL Trypan mavi ve hücre süspansiyon 10 μL.</li>
	<li>Santrifüj orijinal hücre süspansiyon için 200 x g., 8 dk</li>
	<li>Hücre süspansiyon centrifuged iken, bir hemasitometre için Trypan mavi hücre süspansiyon 10 μL ekleyin ve bir hücre sayısı gerçekleştirmek.</li>
	<li>Hücre Pelet kekii olmadan Santrifüjü, medya Aspire edin. 1,25 10 5 hücre/mL x konsantrasyon, hücre Pelet resuspend.</li>
	<li>5 mL steril fosfat tamponlu tuz (PBS) altına 10 cm küresel büyüme sırasında sulu bir ortam sağlamak için Petri kabına ekleyin.</li>
	<li>Petri kabına kapağını tersine çevirin. Hücre süspansiyon Petri kabına kapak iç yüzeyinin çeşitli 20 μL damla ekleyin.</li>
	<li>Hızlı bir şekilde kapağı tekrar ters çevir ve çanak asılı damla çıkarmak değil dikkatli olmak, altta geri yerleştirin. şekil 1 gösterir başarıyla kurulan asılı damla.</li>
	<li>Dikkatli bir 37 ° C kuluçka makinesine çanak yerleştirin ve pulcuklarının asılı bir büyümeye izin bırakın kültür 72 h. bir süre için</li>
</ol> 3. 6. gün: Pulcuklarının 3D matris gömme <ol><li>bir kültür hood örneklerinin kontaminasyonu önlemek için aşağıdakileri gerçekleştirmek.</li>
	İlk fibrin tabaka oluşumu yaratmak için pıhtı çözüm çok sayıda wells için iyi başına 100 μL eklemek için yeterli hacim bir pıhtı çözüm <li>(iyi başına 1 küresel) gerekli. Pıhtı yüzde 10'u 10 X HEPES tampon hacmi (250 mM HEPES, 1500 mM NaCl, 50 mM CaCl 2, pH 7,4), 2 mg/mL insan fibrinojen ve 0.1 U/mL insan Alfa Trombin tarafından oluşmaktadır. Pıhtı birimin geri kalanını ultrasaf su oluşmaktadır.
	<ol><li>Ekle Trombin son ve hızlı bir şekilde çözüm eklemek istediğiniz wells bir 48-şey plaka için kuyu için eklendi önce polymerizing pıhtıları önlemek için.</li>
	</ol></li> <li>Yavaşça shake/fibrin pıhtısı karışımı de tüm kaplama emin olmak için iyi plaka dokunun ve sonra alt pıhtı tabaka polimerize izin vermek 1 h için kuluçka iyi plaka yer. İyi plaka kabarcık oluşumu ikna etmek zor sallama; Sadece rock plaka kuyu tamamı kaplanır kadar gerektiği gibi. Daha büyük pıhtı birimleri kullandıysanız, bu adım gerekli olmayabilir.</li>
	<li>Fibrin katmana aktarmak pulcuklarının.
	<ol><li>Kaldır iyi plaka ve Petri kabına pulcuklarının asılı içinde içeren kültür kuluçka makinesi bırakın ve pulcuklarının mikroskop altında incelemek. Kültür kapağın çanak yerleştirin.</li>
		<li>Dikkatli bir şekilde erişime izin vermek için Petri kabına kapağını ters çevir'i kültürler için asılı bırakın.</li>
		<li>1 mL şırınga için bağlı 21 G iğne kullanarak dikkatli bir kuyunun kaplama polimerli fibrin tabaka delmek değil dikkat çekici damla ters kapağını her şey, merkezi haline gelen transfer. Etkili bir şekilde açılan aktarmak için yavaş yavaş açılan iğne çek. En kısa zamanda tüm açılan içinde iğne döndü pistonu çekmeyi bırak; damla çok ileri geri çekerek etkili küresel transferi veya sonraki görüntüleme bozabilir hava kabarcıkları tanıtmak.</li>
		<li>İyi plaka pulcuklarının düzgün istenen tüm kuyu transfer var emin olmak için mikroskop altında incelemek.</li>
	</ol></li> <li>İkinci fibrin tabaka oluşumu için yukarıdaki gibi ilk fibrin tabaka (Adım 3.2) oluşturulması için aynı hazırlık kullanarak başka bir pıhtı çözüm oluşturun. Dikkatle her küresel içeren açılan üzerine 100 μL pipet ve tekrar pulcuklarının hala tek parça ve kuyular kenarlarına itti değil emin olmak için mikroskop altında incelemek.</li>
	<li>Kuluçka makinesi iyi plakasına dönmek ve ikinci katman için 1 h. polimerize izin</li>
</ol> 4. 6. gün: Pro-göçmen veya inhibitör faktörleri eklenmesi <ol><li>sıcak HDFn medya 37 ° c</li>
	<li>Bir hood kontaminasyonu önlemek için aşağıdaki adımları gerçekleştirin.</li>
	<li>Uygun konsantrasyonlarda değerlendirilmek üzere pro/anti-migratory ajanları dahil olmak üzere her grubu için ortam hazırlamak.</li>
	<li>Kuluçka Gelişim makinesi ve kültür kukuIeta yerde iyi plaka kaldırmak.</li>
	<li>Ekle 500 μL standart medya denetim küresel grubunun her şey için 500 μL geçiş inhibe küresel grubunun her şey için inhibitör medya ve geçiş gelişmiş küresel grubunun her şey için pro-göçmen medya 500 μL.</li>
	<li>İyi plaka da kuluçka için iade.</li>
	<li>Değişim medya her 48 h.</li>
</ol> 5. Gün 6-9: hücre göç değerlendirme ve nükleer silahların yayılmasına karşı <ol><li>görüntü pulcuklarının aydınlık alan mikroskobu hemen medya (0 h) ve sonra her 24 h eklenmesinden sonra 72 h. isteğe bağlı kullanarak: her zaman noktası, z-yığın görüntü almak olup olmadığını belirlemek amacıyla geçiş odak birincil alan dışında uçaklarda meydana gelen. Deneyimlerimize göre bu oluşmaz; Ancak, bu her deneme durumda olduğundan emin olmak yararlıdır.</li>
	<li>Kullanım için her küresel alanda yüzde artış her küresel her her başarılı zaman noktasında için hücre kenarlığı izleme ve kullanarak analiz ederek hücre yapılan her iyi belirlemek için ImageJ &#34; ölçü &#34; alanı elde etmek için işlev.</li>
</ol>

<ol><li>Chester, D., Brown, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+biophysical+properties+of+provisional+matrix+proteins+in+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of biophysical properties of provisional matrix proteins in wound repair.</a> Matrix Biol. , (2016).</li>
<li>Martin, P., Leibovich, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cells+during+wound+repair%3A+the+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).</li>
<li>Lin, B., Yin, T., Wu, Y. I., Inoue, T., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+chemotaxis+and+contact+inhibition+of+locomotion+determines+exploratory+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Interplay between chemotaxis and contact inhibition of locomotion determines exploratory cell migration.</a> Nat Commun. 6, 6619(2015).</li>
<li>Ngalim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+Adhesive+and+Soluble+Gradients+for+Imaging+Cell+Migration+with+Fluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li>
<li>Charras, G., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+influences+of+the+extracellular+environment+on+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev.+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Physical influences of the extracellular environment on cell migration.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 15 (12), 813-824 (2014).</li>
<li>Petrie, R. J., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+Lead+the+Way%3A+A+Unified+View+of+3D+Cell+Motility%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts Lead the Way: A Unified View of 3D Cell Motility.</a> Trends Cell Biol. 25 (11), 666-674 (2015).</li>
<li>Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonpolarized+signaling+reveals+two+distinct+modes+of+3D+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration.</a> J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).</li>
<li>Carlson, M. W., Dong, S., Garlick, J. A., Egles, C. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/chapter/10.1007%2F978-3-642-00534-3_12">Tissue-Engineered Models for the Study of Cutaneous Wound-Healing.</a> Bioengineering Research of Chronic Wounds. , http://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-642-00534-3_12 263-280 (2009).</li>
<li>Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-dimensional+topography+underlies+three-dimensional+fibrillar+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration.</a> J Cell Bio. 184 (4), 481-490 (2009).</li>
<li>Fraley, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinctive+role+for+focal+adhesion+proteins+in+three-dimensional+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility.</a> Nat Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).</li>
<li>Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+versus+directionally+persistent+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev.+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Random versus directionally persistent cell migration.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).</li>
<li>Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zänker, K. S., Dittmar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Cell+Migration+within+a+Three-dimensional+Collagen+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix.</a> J Vis Exp. (92), (2014).</li>
<li>Jonkman, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).</li>
<li>Lämmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li>
<li>Chen, Z., Yang, J., Wu, B., Tawil, B. <a target="_blank" href="http://www.mdpi.com/2221-3759/2/4/198">A Novel Three-Dimensional Wound Healing Model.</a> J Dev Biol. 2 (4), 198-209 (2014).</li>
<li>Ross, R., Benditt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+and+collagen+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Wound healing and collagen formation.</a> The J Cell Biol. 12 (3), 533-551 (1962).</li>
<li>Sproul, E. P., Argraves, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytokine+axis+regulates+elastin+formation+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">A cytokine axis regulates elastin formation and degradation.</a> Matrix Biol. 32 (2), 86-94 (2013).</li>
<li>Almine, J. F., Wise, S. G., Weiss, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin+signaling+in+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+REs+C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Elastin signaling in wound repair.</a> Birth Defects REs C Embryo Today. 96 (3), 248-257 (2012).</li>
<li>Tracy, L. E., Minasian, R. A., Caterson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Matrix+and+Dermal+Fibroblast+Function+in+the+Healing+Wound%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Extracellular Matrix and Dermal Fibroblast Function in the Healing Wound.</a> Adv Wound Care. 5 (3), 119-136 (2016).</li>
<li>Cox, S., Cole, M., Tawil, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+of+Human+Dermal+Fibroblasts+in+Three-Dimensional+Fibrin+Clots%3A+Dependence+on+Fibrinogen+and+Thrombin+Concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Behavior of Human Dermal Fibroblasts in Three-Dimensional Fibrin Clots: Dependence on Fibrinogen and Thrombin Concentration.</a> Tissue Eng. 10 (5-6), 942-954 (2004).</li>
<li>Brown, A. C., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin-based+biomaterials%3A+Modulation+of+macroscopic+properties+through+rational+design+at+the+molecular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Fibrin-based biomaterials: Modulation of macroscopic properties through rational design at the molecular level.</a> Acta Biomaterialia. 10 (4), 1502-1514 (2014).</li>
<li>Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+anti-inflammatory+mesenchymal+stem%2Fprecursor+cells+%28MSCs%29+through+sphere+formation+using+hanging+drop+culture+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of anti-inflammatory mesenchymal stem/precursor cells (MSCs) through sphere formation using hanging drop culture technique.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 28, Unit-2B.6 (2014).</li>
<li>Bainbridge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+and+the+role+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Wound healing and the role of fibroblasts.</a> J Wound Care. 22 (8), 410-412 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Yara iyileşmesinde hücre göç incelenmesi ECMs bir vitro 3D modeli ile ilişkili bu iletişim kuralı sağlar. Çok önemli bir adım olarak uygun yordam yürütülmesini fibroblast pulcuklarının uygun gelişmedir; hücre toplama hazırlık sırasında 2.500 hücreler/damla, ilk bir konsantrasyon vermek için optimize edilmiş pulcuklarının formu için güvenilir bir 72 h kuluçka döneminde izin. Hücreleri yetersiz sayıda kullandıysanız, pulcuklarının etkili toplamak değil ve transfer ve fibrin katmanları içine gömülü varlık üzerine a...

Yara iyileşmesi yaralanma takip doku bütünlüğü restorasyon sonuçları karmaşık bir süreçtir. Bu işlem içine hemostazın, inflamasyon, yayılması ve remodeling, tarafından çevrelenmiş dört örtüşen aşamaları olan her düzenlenmektedir çözünür cues, hücre-matris etkileşimleri ve hücre-hücre iletişim karmaşık bir kombinasyonu tarafından bozuldu. 1 , 2 bu cues orkestrasyon hücresel yanıt-e doğru dahil, önemlisi, hücre göç yara iyileşmesinde çok sayıda kontrol eder. 3 , 4 hücre geçiş bağımlı hücresel fenotipleri ve hücre dışı matriks ortamın Biyokimya ve biyofizik özelliklerini üzerinde son derece dinamik bir süreç değil. 5 hücreler sürekli hücre dışı matriks çevreleri integrin aracılı yollar aracılığıyla araştırma; Bu süreci hücreleri matris özellikleri topografya, sertlik ve hapsi de dahil olmak üzere geniş bir anlamda verir. İki boyutlu (2D) analizi hücre göç göç öncü aktin filaman demetleri nesil aracılığıyla, lamellipodia formasyonu tarafından tahrik edilmektedir gösterir. Öncü kasılma ve retraksiyon firar kenarında tahrik actomyosin ile birlikte, odak yapışıklıklar sonraki oluşumunu hücrenin ileri sürüyor. 6 boyutlu üç (3D) hücresel geçiş şu anda iyi anlaşılamamıştır, ancak, son yıllarda yapılan çalışmalarda 3D geçiş daha belirgin farklı olduğunu ispat yukarıda adı geçen mekanizması 2D açıklanan ve büyük olasılıkla değiştirici mekanizma ile tahrik edilmektedir. Örneğin, son yıllarda yapılan çalışmalarda Petrie ve arktarafından. ECM özelliklerine bağlı olarak, 3D Matris hücrelerinde lamellipodium geçiş mekanizmalarının tahrik lobopodium arasında geçiş yapabilirsiniz, gösterdi. 7 hücre geçiş yanıt şifa yara, kritik bir bileşeni olduğundan hücre göç 3D modelleri yara iyileşmesi sırasında çeşitli uyaranlara fizyolojik yanıtlarını anlamak için kritik önem taşımaktadır. 2D yüzeylerde hücre göç davranışı büyük ölçüde göç 3D matrisler farklı olduğu gösterilmiştir, ancak en güncel vitro modelleri hücre göç sırasında köklü sıfırdan tahlil dahil olmak üzere işlem, şifa yara 2D kullanmak monolayer kültürler. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 deneyleri daha son zamanlarda geliştirilen 3D matris kullanılan, ama hala böylece yeteneği gerçekten hücre çevre three-dimensionality özetlemek için sınırlama monolayer matrix, üstüne hücrelerde kültür içinde vivo. 15
Burada açıklanan yöntemin amacı ile uygulanan uyaranlara ilişkili geçiş yanıt daha sağlam bir anlayış kazanmak için hücre göç fizyolojik ilgili bir 3D modeli yerine bir 2D yüzey incelemektir. Bu yöntem, hücre geçiş etkinleştirmek veya hücre geçiş ile ilişkili yollar engelleyen faktörleri varlığında bir 3D fibrin pıhtısı matris içinde değerlendirilmesi için sağlar. Fibrin matris nedeniyle kritik rol fibrin yara iyileşmesi erken aşamalarında, bu yöntem için seçildi; Aşağıdaki yaralanma, fibrin pıhtısı yara ortamlar içinde kan kaybı kök oluşturduğu ve ilk hücre infiltrasyonu sırasında doku onarım ve tadilat için bir iskele olarak hizmet vermektedir. 2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 Ayrıca, fibrin cerrahi bir mastik olarak klinik olarak kullanılır ve Mastikler bileşimi hücre göç ve nihai sonuçları şifa için bağlı olmuştur. Cox ve arktarafından önceki bir çalışma. fibroblast geçiş değişen fibrin ve fibrin dolgu macunu en iyi duruma getirme amacıyla Trombin konsantrasyonları oluşan fibrin pıhtısı ile araştırıldı. Bu çalışmalarda, plastik yemekleri üzerine fibrin pıhtısı hücreleri geçirilmesi sayısal. 20 burada miktar göç 3D fibrin ortamı içindeki hücreleri için izin veren bir yöntem mevcut. Bu protokol için özel olarak açıklanan yöntemi fibrin kullanırken, bu model alternatif matris malzeme kullanmak istediğiniz gibi kollajen veya diğer 3B matrisleri gibi için kolayca değiştirilebilir. Ayrıca, biz fibroblast geçiş yara yatağına büyük önem hücre dışı matriks sentezi ve doku onarım/tadilat olduğundan bu tahlil fibroblast pulcuklarının kullanımı mevcut. Ancak, onarım sırasında süreç nötrofiller makrofajlar tarafından takip yara yatağa geçirmek için ilk hücre tipi vardır. Fibroblastlar sonra yaklaşık 48 saat sonra ilk yaralanma, yara iyileşme süreci proliferatif faz başında yara ortamı sızmaya başlar. 19 bu tahlil kolayca nötrofil, makrofajlar veya fibrin pıhtısı yapısındaki değişiklikler geçiş bu hücre tiplerinin nasıl etkiler değerlendirmek için diğer hücre tipleri eklemek için değiştirilmiş olabilir. 21
Bu tahlil uygulamak için ilk olarak, fibroblast küresel bir değişiklik kök hücre kültürü için daha önce açıklanan teknikleri kullanarak oluşturulur. 22 fibroblast küresel daha sonra 3D fibrin matris aktarılır ve sonucu sonra kolayca izlenebilir ve birkaç gün içinde sayılabilir. Bu iletişim kuralı dikkate fizyolojik sistemleri 3D 3D cep pulcuklarının fibrin matris içinde katıştırma tarafından alır böylece sınırlamaları hakkında getirdiği bir 2D büyüme yüzeyi ile bir hücre monolayer model göç davranışı için kullanarak alaka içinde kaçınarak, süre hala hücre davranışı son derece kontrollü vitro ortamda değerlendirilmesi için izin.

<table><tbody><tr><td> Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium, 4.5 g / L Glikoz, Sodyum Pirüvatlı, L-Glutamin</td><td>VWR</td><td>VWRL0148-0500</td><td>DMEM olmadan zaten L-glutamin içeren</td></tr><tr><td>100mm Doku Kültürü Kabı</td><td></td><td></td> <td>da kullanılabilirDamla kültürünü asmak için her boyutta tabak kullanılabilir&nbsp;</td></tr><tr><td>USDA onaylı ülkelerden Fetal Sığır Serumu , ısı ile inaktive edilmiş, steril filtrelenmiş, hücre kültürü test edilmiş</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12306C-500ML</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN1680149</td><td>Zaten L-glutamin içeren DMEM kullanılıyorsa gerekli değildir&nbsp;</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin Çözeltisi stabilize, steril filtreli, 10.000 ünite penisilin ve 10 mg streptomisin / mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Dermal Fibroblastları, yenidoğan</td><td>Thermo Fisher</td><td>C0045C</td><td>İlgilenilen diğer hücre tipi ile değiştirilebilir</td></tr><tr><td>21 G x 1 1/2 'iğne</td><td>BD&nbsp;</td><td>305167</td><td>22 G x 1 1/2 iğne de işe yarayacaktır</td></tr><tr><td>1 mL şırınga</td><td>VWR</td><td>89174-491</td><td>Herhangi bir hacimde şırınga kullanılabilir</td></tr><tr><td>Hücre Kültürü Multiwell Plakaları, Polistiren, Greiner Bio-One (Bireysel Olarak Sarılmış) (48 kuyu)</td> <td>VWR</td><td>82051-004&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Fibrinojen - Plazminojen, von Willebrand Faktör ve Fibronektin Tükenmiş</td><td>Enzim Araştırma Laboratuvarları</td><td>FIB 3</td><td>İlgilenilen matris proteini ile değiştirilebilir</td></tr><tr><td>İnsan Alfa Trombin</td><td>Enzimi Araştırma Laboratuvarları</td><td>HT 1002a</td>, <td>ilgilenilen matris proteinine bağlı olarak gerekli olmayabilir</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSL2 hücre kültürü başlığı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü inkübatörü</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X objektifli</td><td></td><td></td><td></td>ters mikroskop</tr><tr><td>15 mL tüplerle</td><td></td><td></td><td></td> uyumlu</tr></tbody></table> santrifüj

İçinde üç boyutlu vitro hücre göç karakterize ortamlar yara

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Şu anda, en vitro model, iyileşmesi gibi köklü sıfırdan deneyleri, hücre göç ve yara kapatma iki boyutlu yüzeyler eğitim içerir. Ancak, yer alır şifa hangi vivo içinde yara fizyolojik ortamında üç boyutlu tercihan--dan iki boyutlu. Hücre davranışı büyük ölçüde olarak farklı olduğunu giderek daha açık hale geliyor iki boyutlu ve üç boyutlu ortamlarda; Bu nedenle, yara kapatma hücre geçiş davranışları eğitim için daha fizyolojik ilgili vitro modelleri için bir ihtiyaç vardır. Burada açıklanan yöntemi daha iyi daha önce kurulan iki boyutlu sıfırdan deneyleri fizyolojik şartlarda yansıtan bir üç boyutlu model hücre göç çalışmanın olanak sağlar. Hücre akıbet hücre göç pro veya anti migratory faktörlerin varlığında fibrin matris içinde gömülü bir küresel gövdesinden çekin incelenmesi yoluyla değerlendirmek için bu model amacı budur. Bu yöntemi kullanarak, hücre yapılan üç boyutlu bir matris küresel vücuttan gözlenen ve aydınlık alan mikroskobu ve küresel gövde alanı analizi ile zaman içinde kolayca ölçülebilir. Pro-göçmen ve/veya inhibitör faktörleri etkisi hücre göç de bu sistem içinde değerlendirilebilir. Bu yöntem araştırmacılar hücre göç ilişkili üç boyutlu yara matrisler vitroanaliz basit bir yöntem sağlar, böylece artan alaka içinde in vitro hücre önceden in vivo hayvan kullanımı için çalışmalar modelleri.

Küresel kültür başarıyla fibroblast geçiş tüp bebek yanlısı ve anti-göçmen aracıları etkisini değerlendirmek için kullanılması gereken 3D fibroblast pulcuklarının açılan kültür 72 h (şekil 1) bir süre içinde asılı yolu ile oluşturulabilir. Kültür dönemi pulcuklarının pıhtı matris içinde gömülü ve aydınlık alan mikroskobu (Şekil 2) kullanarak yansıma. (Resimde beyaz Kenarlıklar tarafından sınırlı alanlarda tasv...

Bu iletişim kuralı yanlısı ve anti migratory faktörlerin etkisi hücre geçiş bir üç boyutlu fibrin matris içinde değerlendirmek için hedeftir.

İçinde üç boyutlu Vitro hücre göç karakterize ortamlar yara

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Bu prosedürün genel amacı, üç boyutlu yarayla ilişkili bir fibrin iskelesindeki hücre göçü üzerinde ilgilenilen spesifik tedavilerin etkisini gözlemlemektir. Bu yöntem, yara iyileşmesi alanındaki temel soruların, özellikle fiber ağ yapısındaki değişikliklerin hücre göçünü ve yara bölgelerindeki fibrin pıhtılarını nasıl etkilediğinin yanıtlanmasına yardımcı olabilir; bu tekniğin temel avantajı, 3D fibrin pıhtıları içindeki hücre göçünü analiz etmek için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem sunmasıdır. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, sferoidlerin transferi zor olabildiği için güçlük çekebilirler.Dondurulmuş yenidoğan insan dermal fibroblastı içeren bir tüpün 37 °C su banyosunda ısıtılmasıyla başlayın. Hücreler henüz çözüldüğünde, santrifüjleme ile toplayın ve peleti taze yenidoğan insan dermal fibroblast ortamında 1 x 10⁶ hücre/mL konsantrasyonunda yeniden süspanse edin. Ardından hücreleri, 37 °C ve %5 CO2 koşullarında 72 saatlik inkübasyon için bir T75 kültür flaskına ekleyin.Kültür %80 konfluensli hale geldiğinde, hücreleri beş mililitre tripsin EDTA ile ayırın. 37 °C'de beş dakika bekledikten sonra, tripsini beş mililitre ısıtılmış besiyeri ile nötralize edin ve 40 µL hücreyi 1:1 oranında trypan blue ile karıştırın. Sayım için 10 µL'lik bir hücre alikotunu ayırın.Hücreleri santrifüjle toplayın ve pelletini 1.25 x 10⁵ hücre/ml konsantrasyonunda yeniden süspande edin. Ardından, 10 cm'lik bir petri kabının tabanına beş ml steril PBS ekleyin. Daha sonra petri kabı kapağını ters çevirin ve kapağın iç yüzeyine hücre süspansiyonundan birden fazla 20 µl damla ekleyin.Tüm damlalar yerleştirildikten sonra, asılı damlaları yerinden oynatmamaya dikkat ederek kapağı tekrar plağın üzerine kapatın ve plağı nazikçe 37 °C'lik bir inkübatöre 72 saatliğine yerleştirin. İnkübasyonun sonunda, 48 kuyucuklu bir plağa, kuyucuk başına ve sferoid başına 100 µL pıhtı solüsyonu ekleyin; ardından fibrin pıhtı karışımının tüm kuyucuğu kapladığından emin olmak için plağı nazikçe sallayın ve hafifçe vurun. Plağı bir saat boyunca inkübatörde bekletin.Pıhtı tabakası polimerize olduğunda, bir ışık mikroskobu altında asılı damla kültüründe sferoidlerin varlığını doğrulayın ve 48 kuyucuklu plakayı ve asılı damla kültür kabını bir hücre kültürü davlumbazına aktarın. Asılı damla kültürlerine erişmek için petri kabı kapağını dikkatlice ters çevirin ve her bir fibrin kaplı kuyucuğa bir damla aktarmak için 21 gauge iğne takılmış bir mililitrelik şırınga kullanın. Sferoidleri aspire ederken ve ekimini yaparken ekstra özen gösteriyorum, çünkü sürecin en zor ve kritik adımı, sferoidleri tahrip etmeden aktarmaktır.Sferoidlerin uygun kuyucuklara düzgün bir şekilde ekildiğini doğrulamak için plakayı mikroskop altında inceleyin. Sferoid içeren her bir damlanın üzerine nazikçe 100 µL taze hazırlanmış pıhtı solüsyonu ekleyin ve sferoidlerin hala bütün olduğunu ve her kuyucuğun merkezinde bulunduğunu doğrulamak için mikroskop altında yeniden inceleyin. Ardından, ikinci fibrin tabakasının polimerize olmasına izin vermek için 48 kuyucuklu plakayı inkübatöre geri yerleştirin.Bir saat sonra, her kuyucuğa ilgili deneysel sferoid grubuna uygun ortamdan 500 µL ekleyin ve plakayı 37 °C'lik inkübatöre geri yerleştirin. 3D hücre kültürünün ardışık kesitlerini görüntülemek için z-yığını (z-stack) kullanarak, her 24 ila 72 saatte bir parlak alan mikroskopisi ile sferoidlerin görüntülerini alın. Ardından, uygun görüntü analiz yazılımında, her bir ardışık zaman noktasında her sferoidin hücre sınırlarını çizin ve her sferoid için alandaki yüzde artışa erişmek için ölçüm işlevini kullanın.Sferoidlerin, ilgilenilen pro-migratuar veya anti-migratuar ajan içerisinde kültüre edilmesinin ardından, sferoidlerin başlangıç alanları parlak alan mikroskobik görüntüleme ile belirlenebilir ve her bir ardışık zaman noktasında sferoid gövdelerinden gerçekleşen sonraki hücre çıkış derecesini belirlemek için referans olarak kullanılabilir. Bu temsili deneyde, pro-migratuar bir ajana maruz bırakılan sferoidler, migrasyon inhibitörü veya kontrol ajanına maruz bırakılan sferoidlere kıyasla, orijinal sferoid gövdesinden uzaklaşan migrasyon derecesinde anlamlı bir artış göstermiştir. Aksine, anti-migratuar bir ajana maruz bırakılan sferoidler, kontrol grubuyla tedavi edilen sferoidlere kıyasla, orijinal sferoid gövdesinden uzaklaşan migrasyon derecesinde anlamlı bir azalma göstermiştir.Doğru şekilde uygulandığında, bu teknik, hücre kültürü süresi hariç olmak üzere iki buçuk saatte tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, üç boyutlu in vitro hücre göçü analizleri için hücre sferoidlerinin nasıl kültüre edileceği ve gömüleceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmanız gerekir. Bu prosedürün ardından, pıhtı içerisindeki fibrin ağ yapısının veya sferoid hücrelerindeki aktin diziliminin artan veya azalan hücre göçüyle nasıl ilişkili olduğuna dair ek soruları yanıtlamak için histolojik ve immünohistokimya gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Hücre kültürleri ve iğnelerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedür uygulanırken uygun koruyucu ekipman giymek ve steril bir kültür kabininde çalışmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

characterizing-cell-migration-within-three-dimensional-vitro-wound

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu makalede, floresan daha düzeltme ve 3D-hücre kültürleri canlı görüntüleme için kullanılabilir kollajen etiketlemek için bir yöntem sunar. Ayrıca 3D ortamlarda kültür hücrelerinin endojen iskelet proteinleri görselleştirmek için optimize edilmiş bir protokol sağlar.

3D İnvaziv Kanser Hücrelerinin Sitoskeletal Örgütü ortaya

Yaygın olarak kullanılan, in vitro olarak hücre göçü ve işgali incelenmesi için oldukça erişilebilir yöntemler tarif edilmiştir. Birinci yöntem, hücre motilitesini büyüklüğüne hücre yara kapatma deneyidir. İkinci yöntem kemotaktik ve hücrelerin invaziv kapasitesini değerlendirir transwell göç ve istila testtir.

Vitro Hücre Göç ve Invasion Tahliller

Bu makalede, meme kanseri hücre istilasını ölçmek için üç boyutlu (3D) tahlillerin kullanımı için ayrıntılı yöntemler sağlar. Özellikle, biz hücreleri istila oluşur membran bütünlüğünün kaybı incelemek için bu tür deneyleri kurmak için gerekli prosedürleri, ölçümlerini ve veri analizi gibi yöntemleri tartışmak.

Üç boyutlu (3D) Modeli Kullanılarak Meme Kanseri Hücre invazivliğinin Kantitasyonu

Hücre göçü, bir kanser gibi yara iyileşmesi ve bağışıklık tepkilerinin ve patofizyolojik süreçler gibi, fizyolojik bir bolluk dahil bir biyolojik bir olgudur. 3D-kollajen matris göç deneyi 3D fizyolojik gibi bir ortamda içinde farklı hücre tipleri göç özelliklerini analiz etmek için çok yönlü bir araçtır.

Bir Üç boyutlu Kollajen Matrix içindeki Hücre Göç Analizi

Mekanik özellikler ve hücre dışı matris mikro güçlü hücre 3D göç etkiler. In vitro bir yöntem, nüfus ve tek tek hücre düzeylerde biyofiziksel değişken ortamlarda uzaysal hücre göçü davranışı incelemek için, tarif edilmektedir.

Konsantrik Jel Sistemi 3D Hücre Göç Matrix mikroçevresinin biyofiziksel Rolü Eğitim için

Bu çalışmada cep işgali ve geçiş analizi için iki farklı yöntem raporları: Boyden odası tahlil ve vitro video mikroskobu tabanlı yara iyileşmesi tahlil. Bu iki deney protokollerde açıklanmış ve kendi yararları ve dezavantajları karşılaştırılır.

Cep işgali ve geçiş işlemi değerlendirilmesi: Video mikroskop esaslı çizik karşılaştırılması tahlil ve Boyden odası tahlil yara

Bu iletişim kuralı hücreleri hücre microenvironment koruma sırasında bir üç boyutlu ortamda göç ve işgal yeteneklerini ölçmek için kullanılabilir bir ters dikey işgali tahlil açıklar. Bu tahlil nadir ve/veya hassas hücreler için uygundur.

Yukarı doğru hareket: Bir basit ve esnek Vitro üç boyutlu işgali tahlil iletişim kuralı

Bu el yazması kültürlü epitel hücre monolayers üzerinde yapılan nasıl kesi benzeri lezyonlar elverişli bir konuma sahip modeli şifa vitrogörüntüleme için tarafından confocal sağlayan, yarası. açıklar veya lazer tarama mikroskobu ve yüksek kaliteli sağlayabilir nicel ve nitel veri hücre davranış ve mekanizmaları geçişinde dahil çalışmak için.

Mikroskopi Vitro yara iyileşmesi sırasında epitel hücre göç değerlendirilmesi için yöntemleri temel

Burada, peptidler etkisi bronş epitel hücrelerinin geçiş değerlendirmek için bir protokol mevcut. Bu yöntemi Nicel veri hücre göç ve yara kapatma hızı üzerinde hızlı ve son derece tekrarlanabilir elde olanak sağlar.

Roman Vitro hücre göç değerlendirmek için şifa tahlil yara

Bu yazıda, canlı bir Clytia hemisphaerica medusa'nın epitelinde yara oluşturmak ve in vivo olarak yüksek çözünürlükte yara iyileşmesini görüntülemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Ek olarak, yara iyileşmesi sırasında epitel hücrelerinde ve hücre dışı matrikste sinyal süreçlerini bozmak için boyalar ve ilaçlar tanıtmak için bir teknik sunulmaktadır.

Cnidarian Model Organizma Clytia hemisphaerica'yı Kullanarak İn Vivo Epitelyal Yara İyileşmesini Karakterize Etmek

Granül hidrojellerin arayüzü içinde ve içine 3D hücre göçünün kantitatif değerlendirmesi için bir protokol burada sunulmaktadır.

Granül Hidrojel Biyomalzemeler İçinde ve İçine Üç Boyutlu Hücre Migrasyonunun Ölçülmesi

Öğrenin, üç boyutlu fibrin matris içinde hücre göçünü ve yara iyileşmesindeki etkilerini nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem, hücre davranışlarını in vivo ortamda çalışmak için tekrarlanabilir bir protokol sunar.

İçinde üç boyutlu Vitro hücre göç karakterize ortamlar yara

Daha fazla video keşfet