İçinde üç boyutlu Vitro hücre göç karakterize ortamlar yara

Bu prosedürün genel amacı, üç boyutlu yara ile ilişkili fibrin iskelesinde ilgilenilen spesifik tedavilerin hücre göçü üzerindeki etkisini gözlemlemektir. Bu yöntem, yara iyileşmesi alanındaki, lif ağ yapısındaki değişikliklerin hücre göçünü nasıl etkilediği ve yara bölgelerindeki fibrin pıhtıları ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, bu tekniğin temel avantajı, fibrin pıhtıları içindeki hücre göçünü 3D olarak analiz etmek için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem sağlamasıdır. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir çünkü sferoidleri aktarmak zor olabilir.

37 santigrat derece su banyosunda donmuş bir yenidoğan insan dermal fibroblast şişesini ısıtarak başlayın. Hücreler yeni çözüldüğünde, santrifüjleme ile toplayın ve peleti taze yenidoğan insan dermal fibroblast ortamında 1 x 10 ila mililitre konsantrasyonda 6. hücrelerde yeniden süspanse edin. Daha sonra hücreleri, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 72 saatlik bir inkübasyon için bir T75 kültür şişesine tohumlayın.

Kültür% 80 birleşmeye ulaştığında, hücreleri beş mililitre tripsin EDTA ile ayırın. 37 santigrat derecede beş dakika sonra, tripsini beş mililitre ısıtılmış ortamla nötralize edin ve 40 mikrolitre hücreyi 1: 1 oranında tripan mavisi ile karıştırın. Saymak için 10 mikrolitrelik bir hücre alikotu ayırın.

Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti mililitre konsantrasyonda 1.25 x 10 ila 5. hücrelerde yeniden süspanse edin. Daha sonra, 10 santimetrelik bir petri kabının altını beş mililitre steril PBS ile kaplayın. Ardından petri kabı kapağını ters çevirin ve kapağın iç yüzeyine birden fazla 20 mikrolitrelik hücre süspansiyonu damlası ekleyin.

Tüm damlalar yerleştirildiğinde, asılı damlaları yerinden çıkarmamaya dikkat ederek kapağı tabağın üzerine tekrar ters çevirin ve tabağı 72 saat boyunca 37 santigrat derece inkübatöre nazikçe yerleştirin. İnkübasyonun sonunda, 48 oyuklu bir plakaya oyuk başına sferoid başına 100 mikrolitre pıhtı çözeltisi ekleyin ve fibrin pıhtı karışımının tüm kuyuyu kapladığından emin olmak için plakayı hafifçe sallayın ve hafifçe vurun. Plakayı bir saat boyunca inkübatöre yerleştirin.

Pıhtı tabakası polimerize olduğunda, bir ışık mikroskobu altında asılı damla kültüründe sferoidlerin varlığını doğrulayın ve 48 oyuklu plakayı ve asılı damla kültürü kabını bir hücre kültürü başlığına aktarın. Asılı damla kültürlerine erişmek için petri kabı kapağını dikkatlice ters çevirin ve her fibrin kaplı kuyucuğa bir damla aktarmak için 21 gauge iğne ile donatılmış bir mililitrelik bir şırınga kullanın. Sferoidleri aspire ederken ve kaplarken ekstra özen gösteririm, çünkü süreçteki en zor ve kritik adım, sferoidleri tahrip etmeden transfer etmektir.

Sferoidlerin uygun kuyucuklara düzgün bir şekilde tohumlandığını doğrulamak için plakayı mikroskop altında inceleyin. 100 mikrolitre taze hazırlanmış pıhtı solüsyonunu her bir sferoid içeren damlanın üzerine nazikçe yerleştirin ve sferoidleri mikroskop altında yeniden inceleyin, böylece hala sağlam olduklarını ve her bir kuyucuğun merkezinde olduklarını doğrulayın. Ardından, ikinci fibrin tabakasının polimerize olmasına izin vermek için 48 oyuklu plakayı inkübatöre geri koyun.

Bir saat sonra, her bir kuyucuğu karşılık gelen deneysel sferoid grubu için uygun ortamdan 500 mikrolitre ile tedavi edin ve plakayı 37 santigrat derece inkübatöre geri koyun. 3D hücre kültürünün ardışık kesitlerini görüntülemek için bir z yığını kullanarak, her 24 ila 72 saatte bir parlak alan mikroskobu ile sferoidlerin görüntülerini elde edin. Ardından, uygun görüntü analiz yazılımında, birbirini izleyen her zaman noktasında her bir sferoidin hücre sınırını izleyin ve her bir sferoid için alandaki yüzde artışa erişmek için ölçüm işlevini kullanın.

Kültürlerini takiben, ilgilenilen pro veya anti-göçmen ajanda, sferoidlerin başlangıç alanları parlak alan mikroskobik görüntüleme ile belirlenebilir ve her ardışık zaman noktasında küresel cisimlerden sonraki hücre büyümesinin derecesini belirlemek için bir referans olarak kullanılabilir. Bu temsili deneyde, bir göç önleyici ajana maruz bırakılan sferoidler, bir migrasyon inhibitörü veya kontrol ajanına maruz kalan sferoidlere kıyasla, orijinal sferoid cisimden önemli ölçüde artan bir göç derecesi sergiledi. Tersine, bir anti-migrasyon ajanına maruz kalan sferoidler, kontrol ile tedavi edilen sferoidlere kıyasla, orijinal sferoid cisimden önemli ölçüde azalmış bir göç derecesi sergiledi.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde uygulanırsa, hücre kültürü süresi hariç, iki buçuk saat içinde tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, üç boyutlu in vitro hücre göçü testleri için hücre sferoidlerinin nasıl kültürleneceğini ve gömüleceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü takiben, pıhtı içindeki fibrin ağ yapısının veya sferoid hücrelerdeki aktin hizalamasının artmış veya azalmış hücre göçüne nasıl karşılık geldiği hakkında ek soruları yanıtlamak için histolojik ve immünohistokimya gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Hücre kültürleri ve iğnelerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun koruyucu ekipman giymek ve steril bir kültür başlığında çalışmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.