İçinde üç boyutlu Vitro hücre göç karakterize ortamlar yara

Bu prosedürün genel amacı, üç boyutlu yarayla ilişkili bir fibrin iskelesindeki hücre göçü üzerinde ilgilenilen spesifik tedavilerin etkisini gözlemlemektir. Bu yöntem, yara iyileşmesi alanındaki temel soruların, özellikle fiber ağ yapısındaki değişikliklerin hücre göçünü ve yara bölgelerindeki fibrin pıhtılarını nasıl etkilediğinin yanıtlanmasına yardımcı olabilir; bu tekniğin temel avantajı, 3D fibrin pıhtıları içindeki hücre göçünü analiz etmek için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem sunmasıdır. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, sferoidlerin transferi zor olabildiği için güçlük çekebilirler.

Dondurulmuş yenidoğan insan dermal fibroblastı içeren bir tüpün 37 °C su banyosunda ısıtılmasıyla başlayın. Hücreler henüz çözüldüğünde, santrifüjleme ile toplayın ve peleti taze yenidoğan insan dermal fibroblast ortamında 1 x 10⁶ hücre/mL konsantrasyonunda yeniden süspanse edin. Ardından hücreleri, 37 °C ve %5 CO2 koşullarında 72 saatlik inkübasyon için bir T75 kültür flaskına ekleyin.

Kültür %80 konfluensli hale geldiğinde, hücreleri beş mililitre tripsin EDTA ile ayırın. 37 °C'de beş dakika bekledikten sonra, tripsini beş mililitre ısıtılmış besiyeri ile nötralize edin ve 40 µL hücreyi 1:1 oranında trypan blue ile karıştırın. Sayım için 10 µL'lik bir hücre alikotunu ayırın.

Hücreleri santrifüjle toplayın ve pelletini 1.25 x 10⁵ hücre/ml konsantrasyonunda yeniden süspande edin. Ardından, 10 cm'lik bir petri kabının tabanına beş ml steril PBS ekleyin. Daha sonra petri kabı kapağını ters çevirin ve kapağın iç yüzeyine hücre süspansiyonundan birden fazla 20 µl damla ekleyin.

Tüm damlalar yerleştirildikten sonra, asılı damlaları yerinden oynatmamaya dikkat ederek kapağı tekrar plağın üzerine kapatın ve plağı nazikçe 37 °C'lik bir inkübatöre 72 saatliğine yerleştirin. İnkübasyonun sonunda, 48 kuyucuklu bir plağa, kuyucuk başına ve sferoid başına 100 µL pıhtı solüsyonu ekleyin; ardından fibrin pıhtı karışımının tüm kuyucuğu kapladığından emin olmak için plağı nazikçe sallayın ve hafifçe vurun. Plağı bir saat boyunca inkübatörde bekletin.

Pıhtı tabakası polimerize olduğunda, bir ışık mikroskobu altında asılı damla kültüründe sferoidlerin varlığını doğrulayın ve 48 kuyucuklu plakayı ve asılı damla kültür kabını bir hücre kültürü davlumbazına aktarın. Asılı damla kültürlerine erişmek için petri kabı kapağını dikkatlice ters çevirin ve her bir fibrin kaplı kuyucuğa bir damla aktarmak için 21 gauge iğne takılmış bir mililitrelik şırınga kullanın. Sferoidleri aspire ederken ve ekimini yaparken ekstra özen gösteriyorum, çünkü sürecin en zor ve kritik adımı, sferoidleri tahrip etmeden aktarmaktır.

Sferoidlerin uygun kuyucuklara düzgün bir şekilde ekildiğini doğrulamak için plakayı mikroskop altında inceleyin. Sferoid içeren her bir damlanın üzerine nazikçe 100 µL taze hazırlanmış pıhtı solüsyonu ekleyin ve sferoidlerin hala bütün olduğunu ve her kuyucuğun merkezinde bulunduğunu doğrulamak için mikroskop altında yeniden inceleyin. Ardından, ikinci fibrin tabakasının polimerize olmasına izin vermek için 48 kuyucuklu plakayı inkübatöre geri yerleştirin.

Bir saat sonra, her kuyucuğa ilgili deneysel sferoid grubuna uygun ortamdan 500 µL ekleyin ve plakayı 37 °C'lik inkübatöre geri yerleştirin. 3D hücre kültürünün ardışık kesitlerini görüntülemek için z-yığını (z-stack) kullanarak, her 24 ila 72 saatte bir parlak alan mikroskopisi ile sferoidlerin görüntülerini alın. Ardından, uygun görüntü analiz yazılımında, her bir ardışık zaman noktasında her sferoidin hücre sınırlarını çizin ve her sferoid için alandaki yüzde artışa erişmek için ölçüm işlevini kullanın.

Sferoidlerin, ilgilenilen pro-migratuar veya anti-migratuar ajan içerisinde kültüre edilmesinin ardından, sferoidlerin başlangıç alanları parlak alan mikroskobik görüntüleme ile belirlenebilir ve her bir ardışık zaman noktasında sferoid gövdelerinden gerçekleşen sonraki hücre çıkış derecesini belirlemek için referans olarak kullanılabilir. Bu temsili deneyde, pro-migratuar bir ajana maruz bırakılan sferoidler, migrasyon inhibitörü veya kontrol ajanına maruz bırakılan sferoidlere kıyasla, orijinal sferoid gövdesinden uzaklaşan migrasyon derecesinde anlamlı bir artış göstermiştir. Aksine, anti-migratuar bir ajana maruz bırakılan sferoidler, kontrol grubuyla tedavi edilen sferoidlere kıyasla, orijinal sferoid gövdesinden uzaklaşan migrasyon derecesinde anlamlı bir azalma göstermiştir.

Doğru şekilde uygulandığında, bu teknik, hücre kültürü süresi hariç olmak üzere iki buçuk saatte tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, üç boyutlu in vitro hücre göçü analizleri için hücre sferoidlerinin nasıl kültüre edileceği ve gömüleceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmanız gerekir. Bu prosedürün ardından, pıhtı içerisindeki fibrin ağ yapısının veya sferoid hücrelerindeki aktin diziliminin artan veya azalan hücre göçüyle nasıl ilişkili olduğuna dair ek soruları yanıtlamak için histolojik ve immünohistokimya gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Hücre kültürleri ve iğnelerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedür uygulanırken uygun koruyucu ekipman giymek ve steril bir kültür kabininde çalışmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.