Name: Mikroskopi Vitro yara iyileşmesi sırasında epitel hücre göç değerlendirilmesi için yöntemleri temel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Öğrenin epitel hücre kültüründe yapay yara oluşturma ve mikroskopi ile hücre göçünü nicel ve nitel olarak değerlendirme yöntemlerini. Bu yaklaşım yara iyileşmesi mekanizmalarını anlamak ve erken ilaç testleri için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz geliştirmek ve fiili duruma bu teknikleri rafine yardımcı eski üyeleri laboratuarının sayesinde vermek istiyorum: Dr Celia Martinez-Mora; Dr Anna Mrowiec, Dr Catalina Ruiz-Canada'da ve Dr Antonia Alcaraz-García. Biz kuvvetle bu tekniklerin gelişimi desteklemek için hastane Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca için borçlu bulunmaktadır. Ayrıca Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias. Estatal planı ben + D + ı ve Instituto de Salud Carlos III-Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación (Grant No: PI13/00794); www.isciii.es. Fondos FEDER "Una manera de hacer Europa". Biz Ayrıca Universidad de Murcia, IMIB-Arrixaca ve FFIS idari destek ve yardım için teşekkür ederiz. Sonunda, biz özel bir Doktor Isabel Martínez-Argudo ve Facultad de Ciencias Ambientales y Bioquímica, kampüs Tecnológico de la Fábrica de Armas, Universidad Castilla la Mancha, Toledo isteyerek sigorta içinde tür destek için teşekkür vermek istiyorum Biyomedikal ve biyoteknoloji filme bu kağıt parçası mümkün kılmak için laboratuvar.

1. yapay yara karalama tahlil için nicel çalışmalar
<ol>
	<li>Hücre monolayer hazırlık
	<ol>
		<li>Steril koşullarda çalışma, tohum ve kültür şişe serum takıma orta kullanarak Mv1Lu veya HaCaT epitel hücrelerinde büyür. Orta bir kez her 24-48 h yenileyin. Hücrelerin % 80 izdiham ulaştıktan sonra hücreleri kullanarak bir uygun yöntemi, Yani, trypsinization9bağlantısını kesin. Not: Mv1Lu ve epitel hücre hatları EMEM ve DEMEM kültür ortamına kullanarak kültürlü HaCaT sırasıyla, 2 mM L-glutamin ile desteklenmiş ve % 5 CO2kontrollü bir atmosfer ile 37 ° C'de inkübe. Her hücre kültürünü iyice hücre toplama ve zamanlama tam confluency ulaşmak için gerekli belirlemek için denetlesinler gerekir. Genellikle Mv1Lu veya HaCaT hücreler için 2-4 x 104 ya da 4-6 x 104 hücreleri/iyi, sırasıyla, bir 175 cm2 kültür şişeye numaralı seribaşı ve %80 35 x 106 Mv1Lu ya da 1 x 107 HaCaT hücreleri izdiham verir.</li>
		<li>Ya bir 12-şey ya da 24-şey kültür tabağına, her kuyuya hücre 2 mL tohum. Her 24-48 h emin olun cep numaraları sonra 2-3 gün sonra % 100 izdiham ulaşmak için yüksek orta yenileyin.</li>
		<li>Hücreleri izdiham ulaştıktan sonra serum takıma orta kaldırmak ve iki kez taze orta ile serum-Alerjik yıkayın. Hücreler serum-Alerjik orta 24 h için tırmalamak önce tutmak. Not: Mv1Lu veya HaCaT hücreleri özel substrat gereksinimleri yoktur; Ancak, hücre hatlarında serum serbest koşullarda kendiliğinden ayırma için duyarlı, Poli-L-lizin çözüm kullanarak kültür plaka yüzeyi öncesi kaplama10düşünülmelidir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Monolayer tırmalamak
	<ol>
		<li>Steril bir ortamda çalışmaya, kültür monolayer sıkıca 20 µL veya 200 µL steril micropipette uç, bağlı olarak istenilen sıfırdan genişliği dar sonuna sürükleyerek kaşı. İpucu boşluk homojenliği en üst düzeye çıkarmak için kültür yüzeye dik tutun.<ol>
			<li>Kültür plakaları açıkça hücre monolayer izlemek için karanlık bir yüzeye yerleştirin. Gerekirse, iki dikey çizik (çapraz şeklinde) üzerine 4 geçiş alanları kadar çalışmaya her iyi gerçekleştirin.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Müstakil hücreler kültür orta ve yavaşça ekleyerek taze serum-Alerjik orta hafifçe kaldırarak yıkayın. İki kere tekrar edin veya en ekli olmayan hücreleri kaldırıncaya kadar.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Deneysel işlem ve veri toplama
	<ol>
		<li>Her şey bir CCD kamera birleştiren bir ters faz kontrast mikroskobu kullanarak sıfırdan farkı merkezli 4 ön arıtma referans görüntü alabilir. Mikroskop alan çizikler bitişik kesişimine kenarına yerleştirerek ilgi alanları seçin. Not: Genellikle, 10 x büyütme ve 1280 x 1024 piksel görüntü boyutu kullanarak görüntüleri elde edilir. Yardımcı olur kolay Yerelleştirme ve doğrulama şey başına en çok 4 ölçümler için yukarıda açıklandığı gibi ilgi alanları seçme.</li>
		<li>Bir kez tüm görüntüleri elde, tedavi wells belirlemek; Wells orta seçili tedavileri içerir taze orta ile değişimi. Not: Alternatif olarak, kimyasal madde veya kültür orta homojenliği rahatsız etmeyin bileşikler için Tedaviler doğrudan kültür ortamın aşılanmış.</li>
		<li>Gözlem ulaşmak % 90'ı karalama boşluğu kapatma koşullarda kadar çizik plaka (37 ° C de % 5 CO2içeren bir kontrollü atmosfer) kuluçkaya. Tam kapatma kaçının. Not: Toplam boşluğu kapatma tedavi sonrası resim koleksiyonu olarak başvuru alanları algılanabilir değildir ve gap kapanış zaman başvurusunu kurulamıyor kapatıldı. Mv1Lu veya HaCaT hücre söz konusu olduğunda, 16-19 h % 90 izdiham ulaşmak için gereklidir.</li>
		<li>Hücre geçiş hücreleri düzelterek dur; Yavaşça 1 mL % 4 formalin PBS içinde deneysel kültür orta yerine. 15 dakika dik, kuluçkaya</li>
		<li>Aşırı formalin kaldırmak için hücreleri yıkayın; Yavaşça kuyuları çözümde taze PBS ile değiştirin. En az iki kere tekrar edin. Not: Bu aşamada, mühürleme sonra plakaları 4 ° C'de süresiz olarak saklanır.</li>
		<li>Tedavi sonrası referans görüntü her şey çizilmemesi sonra yakalanan başvuru alanlarından alabilir. Aynı ekipman (CCD kamera birleşmeyle ters optik faz kontrast mikroskop) ve eşleşen resim ayarları (büyütme ve dijital çözünürlük/yoğunluğu) kullanın. Not: tek tek geçir ve bağımsız olarak (örneğin, MDA-MB-231 meme kanseri insan hücreleri) tutarlı bir cephe oluşumu boşluğu doldurmak hücreler için tek tek hücre geçiş hızları hesaplanması zaman ders görüntüleri izin verebilir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Görüntü analizi ve miktar göç
	<ol>
		<li>Görüntü işleme yazılımı (örneğin, ImageJ) kullanarak, sıfırdan farkı sınırlarını tanımlamak ve dört ölçüm sonuçları ön arıtma resimler için boşluk yüzey belirlemek. "Ön arıtma boşluğu yüzeyi" olarak veri kaydı (PREGAP). Tedavi sonrası resimler için aynı işlemi tekrarlayın. "Tedavi sonrası boşluğu yüzeyi" olarak veri kaydı (POSTGAP).<ol>
			<li>Kaydedilen görüntü ImageJ kullanarak açın. "Resim" menüsündeki resim türü 8 bit olarak ayarlayın. "İşlem" menüsünden "filtreler" alt menüsüne gidin ve "varyans" filtreleme uygulayın.</li>
			<li>"Resim" menüsündeki "ayarlama" alt menü ve siyah ve beyaz set eşik girin (B &#38; W), "Koyu arka plan" seçilmediğinden emin olun. "İşlem" menüsünden "ikili" alt menüsüne gidin ve "boşluğu doldurman gerek" seçin.</li>
			<li>"Analiz" menüsündeki "ölçümleri Kur" seçeneğini ve "alan" harekete geçirmek. Sonra böylece boşluğu sınırlayan geçirme kenar dağılımı aşağıdaki ölçülebilir alanı çizin.</li>
			<li>"Analiz" menüde "parçacıklar analiz" seçin ve "Toplam alan" değerlerini çizilmiş alan yüzey için kaydedin.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>PREGAP ve POSTGAP Toplam alan değerleri her el bireysel örnekleri için mutlak geçiş boşluğu yüzey ölçümleri fark olarak ölçmek için elektronik tablodaki tanıtmak: PREGAP − POSTGAP [rasgele birimleri]. Ayrıca, mutlak göç veri denetimi örnekleri her durumun normale: (örnek / kontrol) * 100 [%]. Not: tek tek geçir ve tutarlı bir açık, (örneğin, MDA-MB-231 meme kanseri insan hücreleri) oluşumu bağımsız olarak boşluğu doldurmak hücreler için mutlak geçiş merkezi bir istila hücreleri sayarak hesaplanabilir ya da şerit denetimi ya da tedavi örnekleri.</li>
		<li>(Bkz. şekil 1) miktar çıkışlarını arsa. İstatistiksel analizi gerçekleştirin.</li></ol></li></ol>Öğrenci t-Testi ne zaman iki koşul veya koşullar daha fazla sayıda için Varyans analizi testi karşılaştırma düşünün.
	
	

2. yapay geçiş açık tahlil topografik Etüdleri
<ol>
	<li>Hücre monolayer hazırlık
	<ol>
		<li>Plaka'nın yüzeyi tamamen kaplı kadar steril koşullarda çalışma, boş kültür levha sterilize yuvarlak coverslips bir katman yer. Not: 12 ve 33 coverslips kadar 5 cm ve 10 cm Çap Kaplamalar, anılan sıraya göre uygun.</li>
		<li>Kültür plaka üzerinde hafifçe 2-3 gün sonra % 100 izdiham sağlar bir konsantrasyon hücreleri yeterli bir hacmi tohum. Steril micropipette bahşiş ile hafif basınç uygulayarak yüzen coverslips önlemek ve hiçbir coverslip komşu coverslips çakışıyor emin olun. Orta her 24-48 h yenileyin. Not: Her hücre kültürünü iyice hücre toplama ve zamanlama tam confluency ulaşmak için gerekli belirlemek için denetlesinler gerekir. Genellikle Mv1Lu veya HaCaT hücreler için sırasıyla, 2-3 x 106 veya 2.5-4 x 106 hücreler/10 cm-Çap plaka, seribaşı. Küçük tabak için hücre sayıları ölçekli olmalıdır.</li>
		<li>Hücreleri izdiham ulaştıktan sonra serum takıma orta kaldırın ve taze serum-Alerjik orta ile değiştirin. Yapay yara yapılmadan önce hücreleri serum-Alerjik orta 24 saat tutun. Not: Mv1Lu veya HaCaT hücreleri özel substrat gereksinimleri yoktur; Ancak, hücre hatlarında serum serbest koşullarda kendiliğinden ayırma duyarlı, Poli-L-lizin çözüm kullanarak kültür yüzey öncesi kaplama10düşünülmelidir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Monolayer yaralama
	<ol>
		<li>Steril cımbız kullanarak, yavaşça bir coverslip taze serum-Alerjik orta içeren bir temiz 10 cm tabak taşıyın. Coverslip çevre cımbız ile tutarak monolayer zarar vermemek. Coverslip kırılması neden olabilir aşırı basınç kaçının.</li>
		<li>Yapay yaraları sterilize jilet enine bir çizgide coverslips Merkezi sürükleyerek oluşturun. 3-4 mm ve ileri geri, Merkezi monolayer şerit tamamen kaldırmak için sürükleyin. Hiçbir hücre artıkları yaralı kenarlarına bağlı kalır emin olun. Not: üzerinde 12 mm çapında coverslip, belgili tanımlık kesme sırasında yapılan orta coverslip. Hücrelerin coverslip aşağıdaki adımlarda, devirme önlemek için yeterince büyük ana açık karşısında (en az 2 mm genişliğinde) bir çizgi bıraktığınızdan emin olun.</li>
		<li>Yaralı coverslips hücreleri, bir temiz 6-şey plaka içeren en az 2 mL taze serum-Alerjik ortamına karşı karşıya aktarabilirsiniz. 4 yaralı coverslips/iyi uygun.</li>
		<li>Yavaşça iki kez taze kullanarak yıkayın müstakil hücre kaldırma için serum-Alerjik orta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Deneysel bir işlem ve örnekleme
	<ol>
		<li>Yavaşça Wells orta seçili tedavileri içerir taze orta ile değişimi. Not: Alternatif olarak, kimyasal madde veya kültür orta homojenliği rahatsız etmeyin bileşikler için Tedaviler doğrudan kültür ortamın aşılanmış. Herhangi bir potansiyel hücre dekolmanı önlemek için dikkatli olun.</li>
		<li>Bir hücre İnkübatör (37 ° C, % 5 CO2) içinde plaka için istenen deneysel zamanlama tutmak.</li>
		<li>Hücre geçiş hücreleri düzelterek dur; Yavaşça 1 mL % 4 formalin PBS içinde deneysel kültür orta yerine. 15 dakika dik, kuluçkaya Not: Ders deneyler süre örnekleri kültür plaka kaldırın ve bunları diğer, devam eden deneysel koşullar etkileyen formalin duman önlemek için ayrı bir tabak içinde düzeltmek.</li>
		<li>Aşırı formalin kaldırmak için hücreleri yıkayın; Yavaşça kuyuları çözümde taze PBS ile değiştirin. En az iki kere tekrar edin. Not: Bu aşamada, mühürleme sonra plakaları 4 ° C'de süresiz olarak saklanır.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ayirt (Eğer) ve topolojik analizi
	<ol>
		<li>Eğer boyama gerçekleştirmek ve görüntüleme bireysel coverslips üzerinde başka bir3,4,11bölümünde.<ol>
			<li>10 dakikadır coverslips % 0,3 Triton X-100 çözümde PBS çeker tarafından permeabilize.</li>
			<li>Blok 30 dk ertesi gün engelleme eriyik istimal için: %0,3 sığır Serum albümin; % 10 fetal sığır Serum; %5 yağsız süt; %0,3 Triton X-100 PBS çözümde. Not: süt olmadan çözüm engelleme olabilir önceden hazırlanmış ve -20 ° C'de depolanan</li>
			<li>Nemli bir oda içinde oda sıcaklığında 1 h için birincil antikor süt içermeyen engelleme çözümde seyreltilmiş ile kuluçkaya. Coverslips ters uygun dağıtım sağlamak için 15 µL antikor çözümde yerleştirin. Not: Antikor çalışma seyreltme değişkendir ve antikor kullanılıyor bağlı olacaktır. Örneğin, 1/100 seyreltme tavşan anti-c-Jun antikor gerektirir.</li>
			<li>Çözümde bir içinde % 0,1 Triton X-100 PBS coverslips daldırma tarafından üç kez yıkayın.</li>
			<li>İkincil antikor engelleme arabelleği süt ücretsiz 30 min için seyreltilmiş coverslips kuluçkaya. Not: Antikor çalışma seyreltme değişkendir ve antikor kullanılıyor bağlı olacaktır. Örneğin, keçiyi-anti-tavşan (488) 1/400 seyreltme için en iyi çözünürlük gerektirir. Phalloidin ve Höchst 33258 gibi diğer etiketleme reaktifler kuluçka arabelleğe bu aşamada eklenebilir.</li>
			<li>Üç kez PBS % 0,1 Triton X-100 çözümde coverslips daldırma tarafından yıkayın.</li>
			<li>Coverslips ters içinde mikroskop slayt üzerinde yerleştirilen bir 10 µL montaj medya damla (örneğin, Vectashield) bağlayın. Slaytları gecede montaj orta sertleştirme için oda sıcaklığında karanlıkta bırakın. Daha sonra karanlıkta 4 ° C'de süresiz olarak depolar.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ya epifluorescence ya da yapısal değişiklikler geçirme ön kenarında meydana gelen confocal mikroskobu görüntüleri elde edilir. Not: Topolojik çalışmalar iç monolayer geçirme açık resimler fayans tarafından gerçekleştirilir. Yarı nicel çalışmalar yerel Floresans yoğunluklarda yazılım tabanlı analiz tarafından yapılır.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Singer, A. J., Clark, R. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10471461">Cutaneous wound healing.</a> N Engl J Med. 341 (10), 738-746 (1999).</li>
<li>Davidson, J. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9710378">Animal models for wound repair.</a> Arch Dermatol Res. 290, Suppl . S1-S11 (1998).</li>
<li>Alcaraz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+Membrane+Modifies+the+Genetic+Program+Induced+by+TGFss%2C+Stimulating+Keratinocyte+Proliferation+and+Migration+in+Chronic+Wounds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Amniotic Membrane Modifies the Genetic Program Induced by TGFss, Stimulating Keratinocyte Proliferation and Migration in Chronic Wounds.</a> PLoS One. 10 (8), e0135324(2015).</li>
<li>Ruiz-Canada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+membrane+stimulates+cell+migration+by+modulating+Transforming+Growth+Factor-beta+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating Transforming Growth Factor-beta signaling.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2017).</li>
<li>Schmierer, B., Hill, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta-SMAD+signal+transduction%3A+molecular+specificity+and+functional+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TGFbeta-SMAD signal transduction: molecular specificity and functional flexibility.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 970-982 (2007).</li>
<li>Hu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAK+and+paxillin+dynamics+at+focal+adhesions+in+the+protrusions+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">FAK and paxillin dynamics at focal adhesions in the protrusions of migrating cells.</a> Sci Rep. 4, 6024(2014).</li>
<li>Martinez-Mora, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroin+and+sericin+from+Bombyx+mori+silk+stimulate+cell+migration+through+upregulation+and+phosphorylation+of+c-Jun%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Fibroin and sericin from Bombyx mori silk stimulate cell migration through upregulation and phosphorylation of c-Jun.</a> PloS one. 7 (7), e42271(2012).</li>
<li>Bernabe-Garcia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oleanolic+acid+induces+migration+in+Mv1Lu+and+MDA-MB-231+epithelial+cells+involving+EGF+receptor+and+MAP+kinases+activation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oleanolic acid induces migration in Mv1Lu and MDA-MB-231 epithelial cells involving EGF receptor and MAP kinases activation.</a> PLoS One. 12 (2), e0172574(2017).</li>
<li>Huang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin-induced+proteome+alteration+during+cell+subculture+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Sci%22%5BJournal%5D)">Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells.</a> J Biomed Sci. 17, 36(2010).</li>
<li>Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+tissue+culture+coating+substrates+on+prostate+cancer+cell+adherence%2C+morphology+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differential effects of tissue culture coating substrates on prostate cancer cell adherence, morphology and behavior.</a> PLoS One. 9 (11), e112122(2014).</li>
<li>Pierreux, C. E., Nicolas, F. J., Hill, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor+beta-independent+shuttling+of+Smad4+between+the+cytoplasm+and+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor beta-independent shuttling of Smad4 between the cytoplasm and nucleus.</a> Mol Cell Biol. 20 (23), 9041-9054 (2000).</li>
<li>Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factors+and+cytokines+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+repair+and+regeneration%3A+official+publication+of+the+Wound+Healing+Society+%5Band%5D+the+European+Tissue+Repair+Society%22%5BJournal%5D)">Growth factors and cytokines in wound healing.</a> Wound repair and regeneration: official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 16 (5), 585-601 (2008).</li>
<li>Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+wound+repair%3A+Are+they+cutting+it%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Animal models of wound repair: Are they cutting it?</a> Exp Dermatol. 21 (8), 581-585 (2012).</li>
<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="https://search.proquest.com/openview/50d2937ff21b6f438b4d7d0ce03f4186/1?pq-origsite=gscholar&cbl=40569">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).</li>
<li>Insausti, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+membrane+induces+epithelialization+in+massive+posttraumatic+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Amniotic membrane induces epithelialization in massive posttraumatic wounds.</a> Wound Repair Regen. 18 (4), 368-377 (2010).</li>
<li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+arrest+in+G0%2FG1+phase+by+contact+inhibition+and+TGF-beta+1+in+mink+Mv1Lu+lung+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cell cycle arrest in G0/G1 phase by contact inhibition and TGF-beta 1 in mink Mv1Lu lung epithelial cells.</a> Am J Physiol. 270 (5 Pt 1), L879-L888 (1996).</li>
<li>Boukamp, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+keratinization+in+a+spontaneously+immortalized+aneuploid+human+keratinocyte+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line.</a> J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).</li>
<li>Marshall, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarshall%2C+J+%22Cell+Migration%3A+Developmental+Methods+and+Protocols%22">Cell Migration: Developmental Methods and Protocols</a>. Wells, C. M., Parsons, M. , Humana Press. 97-110 (2011).</li>
<li>Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2214030116300074">An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells.</a> Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).</li>
<li>Szybalski, W., Iyer, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosslinking+of+DNA+by+Enzymatically+or+Chemically+Activated+Mitomycins+and+Porfiromycins%2C+Bifunctionally+%22Alkylating%22+Antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Fed+Proc%22%5BJournal%5D)">Crosslinking of DNA by Enzymatically or Chemically Activated Mitomycins and Porfiromycins, Bifunctionally "Alkylating" Antibiotics.</a> Fed Proc. 23, 946-957 (1964).</li>
<li>Tomasz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitomycin+C%3A+small%2C+fast+and+deadly+%28but+very+selective%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective).</a> Chem Biol. 2 (9), 575-579 (1995).</li>
<li>Sherry, D. M., Parks, E. E., Bullen, E. C., Updike, D. L., Howard, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+using+silicone+elastomer+masks+for+quantitative+analysis+of+cell+migration+without+cellular+damage+or+substrate+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">A simple method for using silicone elastomer masks for quantitative analysis of cell migration without cellular damage or substrate disruption.</a> Cell Adh Migr. 7 (6), 469-475 (2013).</li>
<li>Dennis, E. A., Rhee, S. G., Billah, M. M., Hannun, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+phospholipase+in+generating+lipid+second+messengers+in+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Role of phospholipase in generating lipid second messengers in signal transduction.</a> FASEB J. 5 (7), 2068-2077 (1991).</li>
<li>Lampugnani, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+into+a+wounded+area+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell migration into a wounded area in vitro.</a> Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması olduğunu ilan eder.

Cilt veya mukoz kesintileri bariyer fonksiyonu fibroblastlar veya epitel ve bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere çok sayıda hücre tipleri eylemleri ile geri yüklenir. Manivela, tabi bu hücreler karmaşık bir işlem apoptosis, nükleer silahların yayılmasına karşı farklılaşma ve önemlisi, fibroblast ve epitel hücre göç, son mekanizması kesintiye dokusunun restorasyonu için sorumlu olan ve Tam da yara tedavisi düzenleyici potansiyelini belirlenirken epitel hücreleri, fizyolojik davranışını tanımlayan kapatma yüzeysel epi...

Epitel boşluğu son kapatılması ve kesintiye yüzey1restorasyonu için sorumlu olduğu gibi hücre göç yara iyileşmesi için gereklidir. Hayvan modellerinde yapay yaraları yapmadan karmaşık bu süreçte fizyolojik şartlarda2yakınındaki çoğaltma olanağı sağlar. Ancak, bu yaklaşım genellikle potansiyel olarak farklı süreçler, yara iyileşme süreci karmaşık doğası gereği incelenmesi için duyarlık eksikliği pahalı ve karmaşık deneysel prosedürler, sonuç.
Vitro kültür epitel hücre hatları bu hücreler yara iyileşmesi ve hücre göç davranışı üzerinde tedavinin etkilerini oynamak rol araştırma için hayvan modelleri için yararlı bir alternatif sağlar. Epitel hücrelerinin fizyolojisi tarafından Moleküler teknikleri kullanarak birleşmesi kültürler3,4,5,6kez okudu; Ancak, epitel bütünlüğünü bozulma genellikle iyi mekanik insizyon tarafından sağlanır. Hücre kültüründe bu ihmal edilebilir hücre sayısı için yara boşluğu maruz kalabileceğinizi ve moleküler biyoloji teknikleri için çok küçük bir örnek temsil ettikleri anlamına gelir. Ancak, bu lezyonlar vizon akciğer epitel hücre (Mv1Lu) veya kendiliğinden ölümsüzleştirdi insan keratinosit (HaCaT) hücre gibi bazı epitel hücre hatları doğuştan gelen göçmen özelliklerini yararlanarak mikroskobik ölçek okudu olabilir satırları.
Burada nicel veriler üzerinde geçiş3,4,7,8şifa yara bağlamında epitel hücrelerinin elde etmek uygundur mikroskopi için bir yöntem açıklanmıştır. Ayrıca, biz niteliksel moleküler ve morfolojik değişiklikler üzerinde epitel monolayers geçiş sırasında meydana gelen eğitim yararlı ek yöntemler mevcut. Genel olarak, bu yöntemleri yara iyileşmesi sırasında dinamikleri ve morfolojik değişiklikler epitel hücre davranış ve yanıt-e doğru tedaviler ile ilgili çalışma için bir çerçeve sağlar.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Modifiye Eagle Medium (DMEM)</td><td>Biowest, Nuaill&eacute;, Fransa</td><td>L0102-500</td><td>İsteğe bağlı %10 FBS takviyesi</td></tr><tr><td>Eagles' s Minimum Esansiyel Orta (EMEM)</td><td>Lonza</td><td>BE12 -662F</td><td>İsteğe bağlı %10 FBS takviyesi</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td>2 mM'de kullanın</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA ABD</td><td>DE17603A</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ABD</td><td>T4049</td><td>Uygun şekilde seyreltin</td></tr><tr><td>Poli-L-Lizin</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ABD</td><td>P9155</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu (DPBS) (10x)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>14200-067</td><td>1x</td></tr><tr><td>24 oyuklu kültür plakalarına</td> seyreltin <td>BD FALCON//SARSTED</td><td>734-0020</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu kültür plakaları</td><td>SARSTEDT</td><td>83-3920</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal Büyüme Faktörü (EGF)</td> <td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ABD</td><td>E9644</td><td>Kullanılan 10 ng / mL</td></tr><tr><td>Yuvarlak kapak camı</td><td>MENZEL-GL & Auml; SER</td><td>MENZCB00120RA020</td><td>KISA ALAN DERİNLİĞİ</td></tr><tr><td>Takviyeli tıraş bıçağı no. 743</td><td>Martor (VWR aracılığıyla)</td><td>MARO743.50</td><td></td></tr><tr><td>200 & mikro; l steril aerosol pipet uçları</td><td>VWR</td><td>732-0541</td><td></td></tr><tr><td>20 & mikro; l steril aerosol pipet uçları</td><td>VWR</td><td>732-0528</td><td></td></tr><tr><td>Dijital kamera birleştirilmiş faz kontrast mikroskobu</td><td>Motic İspanya</td><td>Moticam kamera 2300 3.0 M Piksel USB 2.0; Motic Optik AE31</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>ZEISS Microimaging, Almanya</td><td>LSM 510 META</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Kültür kabı</td><td>BD FALCON</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan poliklonal anti c-Jun antikoru</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-1694</td><td>Kullanılmış 1:100</td></tr><tr><td>Anti-tavşan IgG (poliklonal keçi) AF 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>Kullanılmış 1:400</td></tr><tr><td>Hoechst-33258</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ABD</td><td>14530</td><td>Kullanılmış 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 phalloidin (metanol içinde) (kırmızı)</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td>Kullanılmış 1:100</td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>SC-2323</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ABD</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Yağsız süt</td><td>BD DIFCO</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Ulusal Sağlık Enstitüleri, ABD</td><td>Sürüm 1.50i</td><td></td></tr><tr><td>Zen LSM 510 görüntü işleme yazılımı</td><td>ZEISS Microimaging, Almanya</td><td>Sürüm 5.0 SP 1.1</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroskopi vitro yara iyileşmesi sırasında epitel hücre göç değerlendirilmesi için yöntemleri temel

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Hücre göç yara iyileşmesi için zorunlu bir yönüdür. Yapay oluşturma araştırma hayvan modellerinde genellikle pahalı ve karmaşık deneysel prosedürler sonuçlarında potansiyel hassas eksik ise yaralar. Vitro kültür epitel hücre hatları yara iyileşmesi ve tedaviler bu hücrelerde etkisini hücre göç davranışlara araştırma için uygun bir platform sağlar. Epitel hücrelerinin fizyolojisi kez birleşmesi olmayan koşullarda okudu; Ancak, bu yaklaşım koşulları şifa doğal yara benzemeyebilir. Mekanik yollarla epitel bütünlüğünü bozan gerçekçi bir model oluşturur, ancak moleküler tekniklerin uygulanması engelleyebilir. Sonuç olarak, temel mikroskobu teknikleri epitel hücre geçiş eğitimi için en iyi durumda tüp bebek. Burada iki belirli yöntemleri, yapay yara karalama tahlil ve nicel ve nitel veri, sırasıyla, epitel hücreleri göçmen performansı üzerinde elde edebilirsiniz yapay geçiş açık tahlil, ayrıntılı.

Yapay yara karalama tahlil için nicel çalışmalar: Epidermal büyüme faktörü (EGF) promosyon göç değerlendirilmesi:
EGF epitel hücre çoğalması ve geçiş ve böylece olumlu bir denetim geçiş promosyon miktarının için iyi bilinen bir uyarıcı olduğunu. Mv1Lu ve HaCaT hücre monolayers yara karalama deneyleri içinde kullanılan ve ön arıtma resimler elde edilmiştir. 10 ng/mL EGF ile aşı sonra hücreleri için 19 h fiksasyon ve tedavi sonrası r...

Bu el yazması kültürlü epitel hücre monolayers üzerinde yapılan nasıl kesi benzeri lezyonlar elverişli bir konuma sahip modeli şifa vitrogörüntüleme için tarafından confocal sağlayan, yarası. açıklar veya lazer tarama mikroskobu ve yüksek kaliteli sağlayabilir nicel ve nitel veri hücre davranış ve mekanizmaları geçişinde dahil çalışmak için.

Mikroskopi Vitro yara iyileşmesi sırasında epitel hücre göç değerlendirilmesi için yöntemleri temel

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Bu epitel hücre kültürü yapay yaralama prosedürlerinin genel amacı, hücre göçünü hem nicel hem de kalitatif bir perspektiften incelemek ve ilgilenilen spesifik tedavilerin yara iyileşmesi üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesine izin vermektir. Bu yöntem, epitel bozulması sırasında belirli göç süreçlerinin rollerinin kesin karakterizasyonuna izin verdiği için yara iyileşmesi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yaklaşımın temel avantajı, hücre göçü ölçümlerinin ilgili moleküler belirteçlerin davranışındaki değişikliklerle korelasyonuna izin vermesidir.Bu tekniklerin anlamı, erken ilaç testi ve yara kapatma için uygun bir kurulum sunduğu için klinik yaraların tedavisine kadar uzanır. Genellikle bu yönteme başlanacak olan yaralarda bir nesil ile tutarlı bir şekilde çoğaltılabilirlik elde edilmesindeki zorluklar vardır. Yapay bir yara çizik testi için, bir kültür plakasının her bir oyuğunu, tam ortamda iki mililitre epitel hücresi ile tohumlayarak başlayın.Hücreleri 37 santigrat derecede ve yüzde beş karbondioksitte% 100 birleşene kadar iki ila üç gün boyunca kültürleyin. Hücreler hazır olduğunda, hücreleri iki kez taze serumsuz ortamla yıkayın ve ardından

microscopy-based-methods-for-assessment-epithelial-cell-migration

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Yaygın olarak kullanılan, in vitro olarak hücre göçü ve işgali incelenmesi için oldukça erişilebilir yöntemler tarif edilmiştir. Birinci yöntem, hücre motilitesini büyüklüğüne hücre yara kapatma deneyidir. İkinci yöntem kemotaktik ve hücrelerin invaziv kapasitesini değerlendirir transwell göç ve istila testtir.

Vitro Hücre Göç ve Invasion Tahliller

Hücre göçü, bir kanser gibi yara iyileşmesi ve bağışıklık tepkilerinin ve patofizyolojik süreçler gibi, fizyolojik bir bolluk dahil bir biyolojik bir olgudur. 3D-kollajen matris göç deneyi 3D fizyolojik gibi bir ortamda içinde farklı hücre tipleri göç özelliklerini analiz etmek için çok yönlü bir araçtır.

Bir Üç boyutlu Kollajen Matrix içindeki Hücre Göç Analizi

Erken endotel hücre (EEC) göçünün araştırılması, bazı hastalıkların patofizyolojisini anlamak ve terapötik müdahale için potansiyel olarak yeni stratejiler belirlemek için önemlidir. Aşağıdaki protokol, EEC'nin araştırılması için uyarlanmış hücre göçünü değerlendirmek için teknikleri açıklamaktadır.

Toksik Kimyasalların Maruz sonra Endotel Hücre Göç Değerlendirilmesi

Bu iletişim kuralı yanlısı ve anti migratory faktörlerin etkisi hücre geçiş bir üç boyutlu fibrin matris içinde değerlendirmek için hedeftir.

İçinde üç boyutlu Vitro hücre göç karakterize ortamlar yara

Burada, hücre göç TIP60 tükenmiş MCF10A meme epitel hücreleri kullanarak bir yara iyileşmesi tahlil gerçek zamanlı izleme mevcut. Canlı hücre görüntüleme teknikleri bizim protokolündeki uygulanması bize analiz ve tek hücreli hareket içinde gerçek zaman ve zaman içinde görmenize olanak sağlar.

Meme epitel hücre göç TIP60 geçici tükenmesi sonra canlı görüntüleme

Bu çalışmada cep işgali ve geçiş analizi için iki farklı yöntem raporları: Boyden odası tahlil ve vitro video mikroskobu tabanlı yara iyileşmesi tahlil. Bu iki deney protokollerde açıklanmış ve kendi yararları ve dezavantajları karşılaştırılır.

Cep işgali ve geçiş işlemi değerlendirilmesi: Video mikroskop esaslı çizik karşılaştırılması tahlil ve Boyden odası tahlil yara

Burada, peptidler etkisi bronş epitel hücrelerinin geçiş değerlendirmek için bir protokol mevcut. Bu yöntemi Nicel veri hücre göç ve yara kapatma hızı üzerinde hızlı ve son derece tekrarlanabilir elde olanak sağlar.

Roman Vitro hücre göç değerlendirmek için şifa tahlil yara

Burada bir otomatik optik kamera mikroskopla hücre göç vitro test etmek için bir yordam açıklanmaktadır. Kazı-kazan tahlil nerede çizik kapatılması için bir süre takip yaygın olarak kullanılmış. Optik mikroskop hücre göç güvenilir ve ucuz tespiti sağlar.

Kazı-kazan tahlil Vitro hücre göç bir otomatik optik kamera ile test etmek için en iyi duruma getirilmiş

Geçerli protokol kanser hücre göç ve gerçek zamanlı olarak tek bir platformda işgali araştırma, kolayca tekrarlanabilir ve zamanı verimli bir seçenek hücre hareketlilik ve morfoloji çalışmaya sağlayan entegre bir yöntemini açıklar.

Otomatik bir canlı hücre Imager kullanarak basit geçiş/işgali iş akışı

Burada, primer fibroblastlar kullanarak in vitro çizik testve farelerde in vivo deri yara iyileşmesi test için bir protokol salıyoruz. Her iki tahliller in vitro ve in vivo yara iyileşmesini değerlendirmek için basit yöntemlerdir.

In Vitro ve In Vivo In Vivo Analizi Yara İyileşmesi için Scratch Migration Tahlil ve Dorsal Skinfold Odası

Bu yazıda, canlı bir Clytia hemisphaerica medusa'nın epitelinde yara oluşturmak ve in vivo olarak yüksek çözünürlükte yara iyileşmesini görüntülemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Ek olarak, yara iyileşmesi sırasında epitel hücrelerinde ve hücre dışı matrikste sinyal süreçlerini bozmak için boyalar ve ilaçlar tanıtmak için bir teknik sunulmaktadır.

Cnidarian Model Organizma Clytia hemisphaerica'yı Kullanarak İn Vivo Epitelyal Yara İyileşmesini Karakterize Etmek

Öğrenin epitel hücre kültüründe yapay yara oluşturma ve mikroskopi ile hücre göçünü nicel ve nitel olarak değerlendirme yöntemlerini. Bu yaklaşım yara iyileşmesi mekanizmalarını anlamak ve erken ilaç testleri için kullanılır.

Mikroskopi Vitro yara iyileşmesi sırasında epitel hücre göç değerlendirilmesi için yöntemleri temel

Daha fazla video keşfet