Mikroskopi Vitro yara iyileşmesi sırasında epitel hücre göç değerlendirilmesi için yöntemleri temel

Bu epitel hücre kültürü yapay yaralama prosedürlerinin genel amacı, hücre göçünü hem nicel hem de kalitatif bir perspektiften incelemek ve ilgilenilen spesifik tedavilerin yara iyileşmesi üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesine izin vermektir. Bu yöntem, epitel bozulması sırasında belirli göç süreçlerinin rollerinin kesin karakterizasyonuna izin verdiği için yara iyileşmesi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yaklaşımın temel avantajı, hücre göçü ölçümlerinin ilgili moleküler belirteçlerin davranışındaki değişikliklerle korelasyonuna izin vermesidir.

Bu tekniklerin anlamı, erken ilaç testi ve yara kapatma için uygun bir kurulum sunduğu için klinik yaraların tedavisine kadar uzanır. Genellikle bu yönteme başlanacak olan yaralarda bir nesil ile tutarlı bir şekilde çoğaltılabilirlik elde edilmesindeki zorluklar vardır. Yapay bir yara çizik testi için, bir kültür plakasının her bir oyuğunu, tam ortamda iki mililitre epitel hücresi ile tohumlayarak başlayın.

Hücreleri 37 santigrat derecede ve yüzde beş karbondioksitte% 100 birleşene kadar iki ila üç gün boyunca kültürleyin. Hücreler hazır olduğunda, hücreleri iki kez taze serumsuz ortamla yıkayın ve ardından taze serumsuz ortamda 24 saat kültür yapın. Ertesi gün, plakayı steril bir çalışma alanına yerleştirin ve çapraz şekilli bir yara oluşturmak için steril bir mikro pipet ucunun dar ucunu her bir kuyucuğun dibine iki kez sürükleyin.

Ucu epitel yüzeyi boyunca düzgün bir şekilde hareket ettirirken sabit, sıkı bir basınç uygulanarak tutarlı bir yara boşluğu elde edilir. Aşırı basınç ucu deforme ederek düzensiz bir yara yarıçapına neden olur. Ayrılan hücreleri atmak için süpernatanı nazikçe çıkarın ve kuyucuklara dikkatlice taze serumsuz ortam ekleyin.

Şarj bağlantılı bir cihaz kamerasına bağlı ters faz kontrast mikroskobunu kullanarak, her bir kuyucuktaki çizik boşluğunun dört adede kadar ön işlem referans görüntüsünü elde etmek için mikroskop alanının kenarını çiziklerin bitişik kesişimi ile hizalayın. Tüm görüntüler elde edildiğinde, belirlenen tedavi kuyucuklarındaki ortamı, seçilen ilgili tedavilerle desteklenmiş taze ortamla değiştirin ve plakaları hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. En az bir koşul yaklaşık% 90 çizik boşluğu kapanmasına ulaştığında, süpernatanı oda sıcaklığında 15 dakikalık bir inkübasyon için PBS'de bir mililitre yüzde dört formalin ile nazikçe değiştirin.

Daha sonra, fazla formalini çıkarmak için hücreleri en az üç kez PBS ile nazikçe yıkayın ve çizikten sonra yakalanan orijinal referans alanlarında aynı görüntüleme parametrelerini kullanarak, kuyucukları az önce gösterildiği gibi görüntüleyin. Uygun görüntü işleme yazılımını kullanarak görüntüleri analiz etmek için, ilgilenilen kayıtlı, işlem öncesi görüntüyü açın ve Görüntü menüsü altında görüntü türünü 8 bit olarak ayarlayın. İşlem menüsü altında, Filtreler alt menüsünü seçin ve Varyans filtrelemesini uygulayın.

Image (Görüntü) menüsü altında, Adjust (Ayarla) alt menüsünü açın ve Threshold (Eşik) değerini siyah beyaz olarak ayarlayın. İşlem menüsünde, İkili alt menüsünü seçin ve Delikleri Doldur'u uygulayın. Analiz menüsü altında, Ölçümleri Ayarla'yı seçin ve Alan'ı etkinleştirin.

Ardından, boşluğu sınırlamak için göç eden kenar konturunu takip ederek ölçülebilir alanı çizin. Analiz menüsü altında, Parçacıkları Analiz Et'i seçin ve çizilen alan yüzeyi için toplam alan değerlerini kaydedin. Her bir numune seti için mutlak göçü, boşluk yüzeyi ölçümleri arasındaki fark olarak ölçmek için, işlem öncesi ve sonrası toplam boşluk yüzey alanı değerlerini bir elektronik tabloya aktarın ve niceleme çıktılarını çizin.

Yapay bir migrasyon cephesi tahlili için, steril koşullar altında, boş 10 santimetrelik kültür plakalarına 33 adede kadar sterilize edilmiş yuvarlak lamelden oluşan bir tabaka ekleyin. Plaka yüzeyi tamamen kaplandığında, ilgilenilen epitel hücrelerini, iki veya üç günlük kültürden sonra% 100 birleşmeye izin veren bir konsantrasyonda nazikçe tohumlayın. Gerekirse, yüzmeyi önlemek için kapaklara steril bir mikropipet ucuyla hafifçe bastırın.

Hücreler birleştiğinde, süpernatanı 24 saatlik bir kültür için serumsuz ortamla değiştirin. Ardından, bir lameli taze serumsuz ortam içeren 10 santimetrelik yeni bir plakaya dikkatlice aktarmak için steril aralayıcılar kullanın ve lameli çevresi boyunca tutmaya özen gösterin. Yapay yaraları oluşturmak için, merkezi tek tabaka şeridini tamamen çıkarmak için her hücre kültürünün merkezi üzerinde üç ila dört milimetre enine bir çizgi oluşturmak için sterilize edilmiş bir tıraş bıçağını her lamel boyunca ileri geri sürükleyin.

Düzensiz bir kenar şekline ve sarkık epitel kısımlarının oluşmasına karşı koruma sağlamak için yarayı yaparken tıraş bıçağı kenarını lamel yüzeyine yoğun bir şekilde yerleştirmeye dikkat edin. En az iki mililitre serumsuz ortam içeren altı oyuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına hücre tarafı yukarı bakacak şekilde dört adede kadar yara lamelini aktarın ve ayrılmış hücreleri çıkarmak için her bir kuyucuğu iki kez taze serumsuz ortamla nazikçe yıkayın. Ayrılan hücrelerin tümü atıldığında, yıkama ortamını, ilgilenilen işlemlerle desteklenmiş taze ortamla nazikçe değiştirin ve plakayı hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.

Uygun deney süresinin sonunda, hücreleri az önce gösterildiği gibi PBS'de yüzde dört formalin ile sabitleyin ve hücreleri uygun floresan konjuge antikorlarla boyayın. Ardından, ilgilenilen deneysel parametrelere göre floresan mikroskobu ile göç eden ön kenarda meydana gelen yapısal değişiklikleri görüntüleyin. Bu deneyde, yara boşlukları, epitel hücre proliferasyonu ve göçünün iyi bilinen bir indükleyicisi olan epidermal büyüme faktörü ile tedaviden önce ve sonra ölçüldü.

Mutlak migrasyon daha sonra işlem öncesi ve sonrası boşluk yüzey alanları arasındaki fark olarak hesaplandı. Epidermal büyüme faktörü ile tedavi, kontrol ve büyüme faktörü ile uyarılan hücrelerin F-Aktin boyamasının bu lazer tarama mikroskobu görüntülerinde gözlemlendiği gibi hücre hücre iskelet dinamiklerini güçlendirir. Ayrıca, c-Jun aşırı ekspresyonu, göç eden cepheye bitişik hücrelerde görülen proteinin artan ekspresyonu ile gözlenir.

Bu prosedürü denerken, migrasyon miktarını bozabilecek epitel hücre fleplerinin varlığı için yara kenarlarının bütünlüğünü kontrol etmeyi unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, göç davranışını hem nicel hem de nitel olarak nasıl değerlendireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.