Doku Örneklerinde Cilt Hücresi Fenotiplerini ve Proliferasyon Durumlarını Değerlendirmek için Yüksek Verimli Görüntüleme ve Analiz İş Akışı
31 Ekim 2025
Yinelemeli ağartma-uzatma-çoğullama (IBEX) ve ticari bir nükleotid etiketleme testinin (Click-iT EdU) kombinasyonu, sabit donmuş murin dokusu kesitlerinde oldukça dinamik süreçlerde bölünen hücre tiplerinin saptanmasını ve sınıflandırılmasını sağlar. Ayrıca, yeni bir açık kaynaklı görüntü işleme hattı, yüksek verimli görüntü elde etme ve analiz sağlar.
Bu protokol, cilt onarımı gibi son derece dinamik süreçlerde bölünen hücre tiplerini tespit etmek ve kategorize etmek için multipleks optik görüntüleme yöntemini, IBEX ve Click-iT EDU etiketlemeyi birleştirir. Ayrıca, yüksek verimli görüntü elde etme ve analiz için yeni bir açık kaynaklı görüntüleme işleme hattı sağlıyoruz. 24 oyuklu plakayı 200 mikrolitre krom alüminyum jelatin ile kaplayın ve plakayı bir külbütör çalkalayıcıda 15 dakika inkübe edin.
Daha sonra jelatini tamamen çıkarın ve kaplanmış kuyucukları 40 derecelik bir fırında 60 dakika kurutun. OCT gömülü dokuyu kriyostattan 15 ila 30 mikrometre kalınlığında kesin ve hızlı bir şekilde iki mililitre PBS içeren kaplanmış bir kuyuya aktarın. Doku bölümünü kuyuda ortalanmış halde tutmayı amaçlayan bir mililitrelik bir pipet kullanarak PBS'yi dikkatlice çıkarın.
Bunu etkili bir şekilde yapmak için, PBS'yi kuyunun kenarlarından yavaşça aspire edin ve dokunun kaymasını önlemek için pipet konumunu gerektiği gibi ayarlayın. Doku bölümlerini 37 santigrat derece fırında bir saat kurutun. Beş dakika boyunca bir mililitre PBS ile rehidrate edin.
Dokuyu 500 mikrolitre %0.5 Triton ile oda sıcaklığında 30 dakika geçirgenleştirin. Dokuyu PBS ile iki kez kısa bir süre yıkayın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca Click-iT reaksiyonunu gerçekleştirin. Numuneleri ışıktan koruyun.
Mendili PBS ile iki kez kısa bir süre yıkayın. Oda sıcaklığında bir blokaj tamponu ile bir saat bloke edin. İlk döngü için birincil antikorları ekleyin.
Ve plakayı gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. PBS ile üç kez yıkayın. İkincil antikor boyamasını gerçekleştirin.
İlk döngü için, bağlanmamış birincil antikorlar için ikincil antikorları bir nükleer karşı boyama ile birlikte uygulayın. Numuneleri ışıktan koruyarak oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edin. Mendili oda sıcaklığında beş dakika boyunca bir mililitre PBS ile üç kez yıkayın.
Her oyuğa yaklaşık 500 mikrolitre PBS bırakın ve plakayı mikroskoba getirin. Meta Express yazılımında Filtreleme'ye ve ardından Edinme Kurulumu'na tıklayın. Çıkar düğmesine tıklayın.
Plakanın altını %70etanol ile temizleyin ve plakayı mikroskoba yerleştirin. Plakayı Yükle düğmesini tıklatın. Objektif ve Kamera sekmesinde istediğiniz büyütmeyi seçin.
Toplama modu olarak, konfokal 51 mikrometre yarık modunu seçin. Plaka sekmesinde, plaka modelini seçin. Plaka Siteleri Ziyareti sekmesine gidin.
Site Seçenekleri altında, sabit sayıda siteye tıklayın. Hem sütunların hem de satırların sayısını, kabaca tüm kuyu kaplanacak şekilde ayarlayın. Çakışan sitelere tıklayın %10Plaka haritasında ilgili kuyuya sağ tıklayarak satın almak için yalnızca ilk kuyuyu seçin.
Alım Otomatik Odaklama sekmesine gidin. Kuyudan kuyuya otomatik odaklama için plaka ve kuyu altı seçeneğini seçin. Site otomatik odaklama için Tüm Siteler seçeneğini belirleyin.
Dalga boyları sekmesine gidin ve mevcut döngüde görüntülenecek boya sayısını seçin. İlk dalga boyu sekmesine gidin. Z konumlandırma için Z ofsetli lazeri seçin ve doğru görüntüleme yüksekliğini ayarlamak için Ofseti Hesapla düğmesini tıklatın.
Numunenin en iyi odaklandığı görüntüyü seçin. Odak düğmesine basın. Dokunun odakta bir görüntüsü gösterilir.
Aydınlatma gücünü %50'ye ayarlayın Hedef maksimum yoğunluğu 2000'e ayarlayın ve Otomatik Açığa Çıkar'a basın. Z serisi için Z serisi ve 2B projeksiyon görüntüsü'nü seçin ve gölgeleme düzeltmesi için yalnızca FL gölgelendirme'yi seçin. Diğer dalga boyları için adımları tekrarlayın, ancak Z-ofsetli lazer yerine W1'den Z-ofsetini seçin ve sıfırı seçin.
Z serisi adımına gidin ve istediğiniz adım boyutunu girin. Odak düğmesini tıklayın. Geçerli konum okunu dokunun alt kısmına ulaşılana kadar sürükleyin ve B Ayarla düğmesine tıklayın.
Konum okunu mendilin üstüne sürükleyin ve T Ayarla düğmesine tıklayın. F2'ye tıklayın, Durdur'a tıklayın, tekrar Canlı Başlat'a basın. Üzerine sol tıklayarak aşamanın ilk kuyuda olduğundan emin olun.
Dokunun sınırını bulun ve doku içeren tüm bölgeleri sağ tıklayarak satın almak için işaretleyin. Çalıştır sekmesine gidin ve plakanın adını yazın. Protokolü Kaydet'e tıklayın.
Diğer tüm kuyular için alım bölgesini ayarlayın. Kontrol, Günlük Tut'u çalıştırın, kaydı başlatın ve ardından hemen Kontrol, Günlüğe Kaydet, kaydı durdurun. Oluşturulan günlüğü kaydedin ve Control, Journal, Edit Journal ile tekrar açın.
Sol panelde, Plaka Alımı'na gidin, protokolü dosyadan yükleyin ve bu adımları günlüğe eklemek için Plaka Alımı'na tıklayın. Plaka Alımını Düzenle'ye çift tıklayın, dosyadan protokolü yükleyin ve ilk kuyu için kaydedilen protokolü seçin. Alınacak her kuyu için adımları tekrarlayın ve her zaman ilgili protokolü yüklediğinizden emin olun.
Satın almayı başlatmak için Günlüğü Çalıştır'a tıklayın. Derginin bitiminden 30 dakika önce ağartma reaktifini hazırlamaya başlayın. 10 miligram lityum borohidriti 10 mililitre çift damıtılmış H2O içinde çözün ve 0,22 mikrometrelik bir filtreden geçirin.
10 dakika bekletin. Çözelti kabarcıklar oluşturmaya başlamalıdır. Etkili ağartma sağlamak için, ağartma reaktifini hazırlandıktan sonraki dört saat içinde kullanın.
Ağartma solüsyonunu numunelere ekleyin ve numuneleri ortam ışığına maruz tutarken 15 dakika inkübe edin. Doku üzerinde küçük kabarcıklar görünmelidir. Ağartılmış numuneleri, her biri oda sıcaklığında beş dakika boyunca bir mililitre PBS ile üç kez yıkayın.
Bir sonraki döngü için birincil antikorları ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Click-iT EDU etiketleme ile birleştirilmiş çoğullanmış IBEX görüntüleme, yaralı derideki farklı yapıları ve çoğalan hücre tiplerini ortaya çıkarır. Dondurularak saklanan numuneler üzerindeki EDU etiketlemesinin, parafine gömülü doku kesitlerinde KI-67 için antikor immünofloresan etiketlemesi yapılırken ve ayrıca akış sitometrisi kullanılarak hücreleri KI 67 ile etiketlerken benzer olduğu görülmektedir.
Bu protokolün kullanılması, karmaşık biyolojik süreçlerde hücre çoğalmasının doğru bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Ayrıca, açık kaynaklı görüntüleme işleme hattı herhangi bir programlama deneyimi gerektirmez ve Fiji ve quPath gibi ticari olmayan yazılımlarla işlenebilen dosyalar üretir. Ayrıca, bu protokol herhangi bir pahalı ekipman gerektirmez ve bu nedenle çoğu araştırma ortamında gerçekleştirilebilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, yineleyici-ağartma-çoğaltma-çokluk (IBEX) ve Click-iT EdU etiketlemenin kombinasyonunu, özellikle murin cilt onarımında, dinamik süreçlerde bölünme yapan hücre tiplerini tespit etmek ve kategorize etmek için araştırmaktadır. Geliştirilen açık kaynak görüntü işleme yöntemi, yüksek verimli görüntü elde etme ve analizini kolaylaştırmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Hücre bölünmesi ve kategorizasyonu
- Dinamik biyolojik süreçler
- Yüksek verimli görüntüleme teknikleri
Arka Plan
- Hücre çoğalmasını anlamadaki görüntülemenin önemi
- Etkili doku işleme yöntemlerine duyulan ihtiyaç
- Çoklu görüntüleme yaklaşımlarındaki önceki sınırlamalar
Kullanılan Yöntemler
- Çoklu optik görüntüleme yöntemi ve Click-iT EdU etiketleme
- Sabit donmuş murin doku kesitleri
- Yüksek verimli görüntü elde etme teknolojisi
Ana Sonuçlar
- Cilt onarımında yer alan farklılaşan hücre tiplerinin başarılı bir şekilde tespiti
- Yeni teknikler kullanılarak hücresel çoğalmaların doğru görüntülenmesi
- Geleneksel antikor immünfloresan yöntemleriyle karşılaştırma
Sonuçlar
- Karmaşık biyolojik bağlamlarda hücre çoğalmasının incelenmesi için etkili bir yaklaşımı gösterir
- Biyoloji araştırmaları için programlama becerisi gerektirmeden değerli bir araç sunar
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
High-throughput multiplexed imaging of skin tissue enables precise evaluation of cell phenotypes and proliferation states, addressing a critical gap in regenerative biology and tissue repair research. The integration of IBEX with Click-iT EdU chemistry and automated confocal imaging enhances predictive confidence in cell state characterization and supports robust target validation in early discovery. This workflow positions biopharma teams to make informed, risk-adjusted decisions in regenerative medicine and tissue engineering portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables detailed interrogation of regenerative cell populations and their proliferation dynamics.
- Supports functional target validation by distinguishing actively dividing cell types in situ.
- Improves predictive confidence for pathway analysis in tissue repair models.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated tissue sections for multiplexed imaging assays.
- Standardizes quantitative assessment of proliferation markers across multiple cell types.
- Enables scalable, reproducible imaging workflows suitable for high-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant regenerative processes in preclinical models.
- Provides continuity from discovery-stage cell state analysis to preclinical validation of therapeutic hypotheses.
- Supports risk-adjusted advancement of regenerative medicine candidates.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow integrates from early discovery through preclinical research, enabling iterative hypothesis testing and robust cell state quantification in tissue samples.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by clarifying cell proliferation and phenotype changes during tissue repair.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides high-content, multiplexed readouts for comparative analysis of experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by enabling biomarker alignment in disease-relevant tissue contexts.
- Enterprise Reuse: Offers an open-source, adaptable imaging and analysis pipeline for broad R&D deployment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in regenerative cell state analysis.
- Operational Value: Standardizes imaging and analysis workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management in regenerative medicine.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of tissue repair and cell therapy programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multiplexed immunofluorescence and tissue handling.
- Needs access to automated spinning disk confocal microscopy and compatible imaging software.
- Demands cross-team standardization of imaging protocols and data analysis pipelines.
- Adaptable to various tissue types and regenerative models with protocol optimization.
- Limited by the need for careful reagent handling and iterative imaging cycles.
