Doku Örneklerinde Cilt Hücresi Fenotiplerini ve Proliferasyon Durumlarını Değerlendirmek için Yüksek Verimli Görüntüleme ve Analiz İş Akışı

Bu protokol, cilt onarımı gibi son derece dinamik süreçlerde bölünen hücre tiplerini tespit etmek ve kategorize etmek için multipleks optik görüntüleme yöntemini, IBEX ve Click-iT EDU etiketlemeyi birleştirir. Ayrıca, yüksek verimli görüntü elde etme ve analiz için yeni bir açık kaynaklı görüntüleme işleme hattı sağlıyoruz. 24 oyuklu plakayı 200 mikrolitre krom alüminyum jelatin ile kaplayın ve plakayı bir külbütör çalkalayıcıda 15 dakika inkübe edin.

Daha sonra jelatini tamamen çıkarın ve kaplanmış kuyucukları 40 derecelik bir fırında 60 dakika kurutun. OCT gömülü dokuyu kriyostattan 15 ila 30 mikrometre kalınlığında kesin ve hızlı bir şekilde iki mililitre PBS içeren kaplanmış bir kuyuya aktarın. Doku bölümünü kuyuda ortalanmış halde tutmayı amaçlayan bir mililitrelik bir pipet kullanarak PBS'yi dikkatlice çıkarın.

Bunu etkili bir şekilde yapmak için, PBS'yi kuyunun kenarlarından yavaşça aspire edin ve dokunun kaymasını önlemek için pipet konumunu gerektiği gibi ayarlayın. Doku bölümlerini 37 santigrat derece fırında bir saat kurutun. Beş dakika boyunca bir mililitre PBS ile rehidrate edin.

Dokuyu 500 mikrolitre %0.5 Triton ile oda sıcaklığında 30 dakika geçirgenleştirin. Dokuyu PBS ile iki kez kısa bir süre yıkayın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca Click-iT reaksiyonunu gerçekleştirin. Numuneleri ışıktan koruyun.

Mendili PBS ile iki kez kısa bir süre yıkayın. Oda sıcaklığında bir blokaj tamponu ile bir saat bloke edin. İlk döngü için birincil antikorları ekleyin.

Ve plakayı gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. PBS ile üç kez yıkayın. İkincil antikor boyamasını gerçekleştirin.

İlk döngü için, bağlanmamış birincil antikorlar için ikincil antikorları bir nükleer karşı boyama ile birlikte uygulayın. Numuneleri ışıktan koruyarak oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edin. Mendili oda sıcaklığında beş dakika boyunca bir mililitre PBS ile üç kez yıkayın.

Her oyuğa yaklaşık 500 mikrolitre PBS bırakın ve plakayı mikroskoba getirin. Meta Express yazılımında Filtreleme'ye ve ardından Edinme Kurulumu'na tıklayın. Çıkar düğmesine tıklayın.

Plakanın altını %70etanol ile temizleyin ve plakayı mikroskoba yerleştirin. Plakayı Yükle düğmesini tıklatın. Objektif ve Kamera sekmesinde istediğiniz büyütmeyi seçin.

Toplama modu olarak, konfokal 51 mikrometre yarık modunu seçin. Plaka sekmesinde, plaka modelini seçin. Plaka Siteleri Ziyareti sekmesine gidin.

Site Seçenekleri altında, sabit sayıda siteye tıklayın. Hem sütunların hem de satırların sayısını, kabaca tüm kuyu kaplanacak şekilde ayarlayın. Çakışan sitelere tıklayın %10Plaka haritasında ilgili kuyuya sağ tıklayarak satın almak için yalnızca ilk kuyuyu seçin.

Alım Otomatik Odaklama sekmesine gidin. Kuyudan kuyuya otomatik odaklama için plaka ve kuyu altı seçeneğini seçin. Site otomatik odaklama için Tüm Siteler seçeneğini belirleyin.

Dalga boyları sekmesine gidin ve mevcut döngüde görüntülenecek boya sayısını seçin. İlk dalga boyu sekmesine gidin. Z konumlandırma için Z ofsetli lazeri seçin ve doğru görüntüleme yüksekliğini ayarlamak için Ofseti Hesapla düğmesini tıklatın.

Numunenin en iyi odaklandığı görüntüyü seçin. Odak düğmesine basın. Dokunun odakta bir görüntüsü gösterilir.

Aydınlatma gücünü %50'ye ayarlayın Hedef maksimum yoğunluğu 2000'e ayarlayın ve Otomatik Açığa Çıkar'a basın. Z serisi için Z serisi ve 2B projeksiyon görüntüsü'nü seçin ve gölgeleme düzeltmesi için yalnızca FL gölgelendirme'yi seçin. Diğer dalga boyları için adımları tekrarlayın, ancak Z-ofsetli lazer yerine W1'den Z-ofsetini seçin ve sıfırı seçin.

Z serisi adımına gidin ve istediğiniz adım boyutunu girin. Odak düğmesini tıklayın. Geçerli konum okunu dokunun alt kısmına ulaşılana kadar sürükleyin ve B Ayarla düğmesine tıklayın.

Konum okunu mendilin üstüne sürükleyin ve T Ayarla düğmesine tıklayın. F2'ye tıklayın, Durdur'a tıklayın, tekrar Canlı Başlat'a basın. Üzerine sol tıklayarak aşamanın ilk kuyuda olduğundan emin olun.

Dokunun sınırını bulun ve doku içeren tüm bölgeleri sağ tıklayarak satın almak için işaretleyin. Çalıştır sekmesine gidin ve plakanın adını yazın. Protokolü Kaydet'e tıklayın.

Diğer tüm kuyular için alım bölgesini ayarlayın. Kontrol, Günlük Tut'u çalıştırın, kaydı başlatın ve ardından hemen Kontrol, Günlüğe Kaydet, kaydı durdurun. Oluşturulan günlüğü kaydedin ve Control, Journal, Edit Journal ile tekrar açın.

Sol panelde, Plaka Alımı'na gidin, protokolü dosyadan yükleyin ve bu adımları günlüğe eklemek için Plaka Alımı'na tıklayın. Plaka Alımını Düzenle'ye çift tıklayın, dosyadan protokolü yükleyin ve ilk kuyu için kaydedilen protokolü seçin. Alınacak her kuyu için adımları tekrarlayın ve her zaman ilgili protokolü yüklediğinizden emin olun.

Satın almayı başlatmak için Günlüğü Çalıştır'a tıklayın. Derginin bitiminden 30 dakika önce ağartma reaktifini hazırlamaya başlayın. 10 miligram lityum borohidriti 10 mililitre çift damıtılmış H2O içinde çözün ve 0,22 mikrometrelik bir filtreden geçirin.

10 dakika bekletin. Çözelti kabarcıklar oluşturmaya başlamalıdır. Etkili ağartma sağlamak için, ağartma reaktifini hazırlandıktan sonraki dört saat içinde kullanın.

Ağartma solüsyonunu numunelere ekleyin ve numuneleri ortam ışığına maruz tutarken 15 dakika inkübe edin. Doku üzerinde küçük kabarcıklar görünmelidir. Ağartılmış numuneleri, her biri oda sıcaklığında beş dakika boyunca bir mililitre PBS ile üç kez yıkayın.

Bir sonraki döngü için birincil antikorları ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Click-iT EDU etiketleme ile birleştirilmiş çoğullanmış IBEX görüntüleme, yaralı derideki farklı yapıları ve çoğalan hücre tiplerini ortaya çıkarır. Dondurularak saklanan numuneler üzerindeki EDU etiketlemesinin, parafine gömülü doku kesitlerinde KI-67 için antikor immünofloresan etiketlemesi yapılırken ve ayrıca akış sitometrisi kullanılarak hücreleri KI 67 ile etiketlerken benzer olduğu görülmektedir.

Bu protokolün kullanılması, karmaşık biyolojik süreçlerde hücre çoğalmasının doğru bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Ayrıca, açık kaynaklı görüntüleme işleme hattı herhangi bir programlama deneyimi gerektirmez ve Fiji ve quPath gibi ticari olmayan yazılımlarla işlenebilen dosyalar üretir. Ayrıca, bu protokol herhangi bir pahalı ekipman gerektirmez ve bu nedenle çoğu araştırma ortamında gerçekleştirilebilir.