A-seq2 ile kütüphane hazırlık sıralama 3' ucu

Bu iletişim kuralı için siteleri işleme eşleme pre-mRNA 3' ucu bir yöntemi açıklar.

Bu yöntemin genel amacı, mRNA'nın üç asal ucunu yakalamak ve sıralamaktır, böylece mRNA işleme, özellikle üç asal uç bölünmesi ve poliadenilasyonun yanı sıra gen ekspresyonunun nicelleştirilmesi çalışmalarını mümkün kılmaktır. Burada sunulan A-seq2 protokolü ve veri analiz paketi, farklı hücre tiplerinde ve dokularda transkript izoformlarının üretimi ve işlevi hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. A-seq2 yönteminin temel avantajları, uzun poli(A) gerilmeler yoluyla dizilemeyi önlemesi ve adaptör dimerleri oluşturmamasıdır.

Bu işlem için% 80'e kadar büyütülmüş hücreler kullanılır. Büyüme ortamını çıkarın ve hücreleri bir kez PBS ile yıkayın. Oyuk başına bir mililitre lizis tamponu ekleyerek ve hücre malzemesini plaka yüzeyinden tamamen ayırmak için kauçuk bir spatula kullanarak plaka üzerindeki hücreleri doğrudan parçalayın.

Viskoz lizatı her bir kuyucuktan 15 mililitrelik plastik bir tüpe aktarmak için bir mililitrelik pipet ucu kullanın. DNA'yı 23 gauge hipodermik iğneye bağlı bir mililitrelik şırınga ile paylaşın. Lizat artık viskoz olmayana kadar pistonun birkaç kuvvetli yukarı ve aşağı hareketini gerçekleştirin.

Lizatı 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Kalıntıları temizlemek için beş dakika boyunca 20.000 kez g ve dört santigrat derecede döndürün. Berrak süpernatanı lizattan toplayın.

Oligo d(T)25 manyetik boncuklara ekleyin ve karışımı tekrar süspanse edin. Tüpleri 10 dakika boyunca dönen bir tekerleğe yerleştirin. Ardından, tüpleri iki dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin.

Berrak sıvıyı çıkarın. Her tüpe 0.8 mililitre tampon A ekleyin ve tüpü iki ila üç kez 180 derece çevirin. Tampon A'yı ikinci yıkamadan çıkarın.

Her tüpe 0,8 mililitre tampon B ekleyin ve iki dakika rafta bırakın. Bağlı mRNA'yı boncuklardan çıkarmak için tampon B'yi çıkarın, her tüpe 33 mikrolitre su ekleyin ve boncukları yeniden süspanse edin. Yürekli bir blokta beş dakika boyunca 75 santigrat dereceye ısıtın.

Hemen tüpleri bir saniye döndürün ve manyetik rafa yerleştirin. Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Her tüpe 66 mikrolitre alkali hidroliz tamponu ekleyin, karıştırın ve bir ısıtma bloğunda tam olarak beş dakika boyunca 95 santigrat derecede ısıtın.

Hemen, tüpleri buz üzerinde soğutun. Ardından, metin protokolünde açıklandığı gibi bir RNA temizleme kiti kullanarak RNA izolasyonu gerçekleştirin. Bu prosedüre başlamak için, her RNA örneğine 14 mikrolitre polinükleotid kinaz Master Mix ekleyin.

37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. 30 dakika sonra, kinaz reaksiyonlarını hazırlanan spin kolonlarına yükleyin. Sütunları iki dakika boyunca 735 kez g'de döndürün.

Sütunları atın ve toplanan reaksiyonlara sahip tüpleri buzun üzerine yerleştirin. Sonraki ligasyon reaksiyonlarında birleşmelerini önlemek için RNA fragmanlarının üç asal ucunu bloke etmek için, her numuneye 17.5 mikrolitre bir poli(A)polimeraz Master Karışımı ekleyin. Karıştırın ve bir saniye döndürün.

37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. 30 dakika sonra, her reaksiyona 32.5 mikrolitre su ekleyin ve metin protokolünde açıklandığı gibi RNA'yı saflaştırın. Hacmi altı mikrolitreye düşürmek için reaksiyonları 10 dakika boyunca bir vakum yoğunlaştırıcıya yerleştirerek bu prosedürü başlatın.

Daha sonra her reaksiyona 24 mikrolitre bir RNA ligaz Master Mix ekleyin. Reaksiyonları ısıtılmış bir karıştırıcıda 24 santigrat derecede 16 saat boyunca inkübe edin ve aralıklı olarak bin RPM'de karıştırın. Ertesi gün, her reaksiyona 17 mikrolitre su ekleyin ve karıştırın.

Metin protokolünde açıklandığı gibi RNA'yı saflaştırın. Hacmi 11 mikrolitreye düşürmek için eluitleri üç dakika boyunca bir vakum yoğunlaştırıcıya yerleştirin. Ters transkripsiyon reaksiyonu için reaksiyonları 200 mikrolitrelik PCR tüplerine aktarın.

Bir mikrolitre astar ekleyin. Bir PCR döngüleyicide 70 santigrat derecede beş dakika ısıtın ve ardından oda sıcaklığında beş dakika bekletin. Her tüpe sekiz mikrolitre ters transkripsiyon Master Mix ekleyin ve karıştırın.

Tüpleri bir PCR döngüsüne koyun. 10 dakika boyunca 55 santigrat dereceye ve 10 dakika daha 80 santigrat dereceye ısıtın. Buz üzerinde tutun.

Metin protokolünde açıklandığı gibi streptavidin boncukları hazırlayın. Boncuk çözeltisine ters transkripsiyon reaksiyonunu ekleyin ve dönen bir tekerlek üzerinde dört santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. Manyetik bir raf kullanarak, boncukları iki kez biyotin bağlama tamponu ile ve iki kez TEN tamponu ile yıkayın.

Boncukları 50 mikrolitre TEN tamponunda tekrar süspanse edin. İki mikrolitre urasil DNA glikozilaz enzim karışımı ekleyin ve aralıklı karıştırma ile bir mikserde bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Her reaksiyona 50 mikrolitre su, 11 mikrolitre RNase H tamponu ve bir mikrolitre Rnase H ekleyin.

37 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. Tüpleri manyetik rafa yerleştirin ve parçalanmış cDNA'yı içeren sıvıyı yeni bir tüpe aktarın. Metin protokolünde açıklandığı gibi bir PCR saflaştırma kiti kullanarak parçalanmış cDNA'yı saflaştırın.

Saflaştırılmış cDNA'yı, yedi mikrolitrelik bir hacme konsantre olmak için sekiz dakika boyunca bir vakum yoğunlaştırıcıya yerleştirin. İzole edilmiş cDNA'nın beş ana ucuna beş ana adaptör bağlamak için, her numuneye 23 mikrolitre bir RNA ligaz Master Mix ekleyin ve 24 santigrat derecede 20 saat inkübe edin. Son olarak, her reaksiyona 70 mikrolitre su ekleyin.

Üstel faz içinde kütüphane amplifikasyonuna ulaşmak için en uygun PCR döngüsü sayısını belirlemek için bir pilot PCR gerçekleştirilir. Aşağıdakileri 200 mikrolitrelik bir PCR tüpüne pipetleyin: 25 mikrolitre DNA polimeraz karışımı, 20 mikrolitre ligasyon reaksiyonu, iki mikrolitre su, 1.5 mikrolitre ileri PCR astarı ve 1.5 mikrolitre ters PCR indeksi astarı. Döngüleyiciyi aşağıdaki programla çalıştırın: 95 santigrat derecede üç dakika, ardından 98 santigrat derecede 20 saniye, 67 santigrat derecede 20 saniye ve 72 santigrat derecede 30 saniye 20 döngü.

Belirtilen döngülerden sonra yedi mikrolitrelik alikotu doğrudan döngüleyiciden toplayın. Ürünleri %2'lik bir agaroz jel üzerinde ayırın ve PCR ürünlerinin migrasyonunu görselleştirin. Üstel amplifikasyonun başlangıcındaki döngü sayısını, bu örnekte 12 döngü belirleyin ve bu döngü sayısını büyük ölçekli bir PCR reaksiyonu için kullanın.

Ürünleri %2'lik bir agaroz jel üzerindeki büyük ölçekli PCR reaksiyonundan ayırın ve 200 ila 350 nükleotid DNA ürünü içeren jel dilimlerini kesin. Daha sonra, metin protokolünde açıklandığı gibi jel ekstraksiyon kiti ile jel dilimlerinden DNA'yı çıkarın. Bu videoda yalnızca en önemli hesaplama adımları gösterilecektir.

Metin protokolünde daha fazla ayrıntı mevcuttur. Git deposunu klonlayarak ve yeni oluşturulan dizine geçerek başlayın. Yazılımı içeren bir ortam oluşturun ve bu ortamı etkinleştirin.

A-seq2 verilerinin elde edildiği organizmanın genom dizisini indirin. Konfigürasyonu açın file ve metin protokolünde belirtildiği gibi giriş parametrelerini ayarlayın. Analizi başlatın.

Spesifik bir gen olan NUP214'ün HNRNPC proteininin yıkılmasına tepkisi, ya bir kontrol küçük enterferans yapan RNA ile ya da bir HNRNPC küçük enterferans yapan RNA ile tedavi edilen iki HEK-293 hücresi örneğinden a-seq2 okumaları analiz edilerek incelendi. Analiz boru hattı tarafından açıklama eklenen poli(A) siteleri belgeleyen okumalar, IGD genom tarayıcısına girdi olarak kullanılan BAM formatında kaydedildi. Okuma zirvelerinin üç asal ucu, mMRNA'da eşlenmiş, toplulukta açıklamalı üç asal uç.

Profiller, HNRNCR yıkımı üzerine uzun üç asal UTR izoformunun artan bir kullanımını göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, A-seq protokolü, hücre kültürü ve gece ligasyonları için gereken süreyi saymadan, sekiz saatlik uygulamalı zaman veya yaklaşık iki ila üç gün sürer. Protokolü denerken, öncelikle bulunduğunuz yerde kullanılan sıralama platformuna uygun bir ilkel set tasarlamak önemlidir.

mMRA üç asal uç elde ettikten sonra, pre-mRNA üç asal uç işlemenin düzenleyicilerini tanımlamak için çapraz bağlama ve immünopresipitasyon gibi diğer yöntemler önceden oluşturulabilir. A-seq2, RNA işleme alanındaki araştırmacıların, bireysel hücre tiplerinde alternatif poliadenilasyonun düzenlenmesini ve sonuçlarını keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, üç asal uçlu mRNA kitaplıklarının nasıl oluşturulacağı, sıralama verilerinizin nasıl analiz edileceği, yeni poli(A) sitelerin nasıl tanımlanacağı ve kullanımınızın nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

A-seq2'nin mRNA işlemenin düzenlenmesine başlama konusundaki işinizi kolaylaştıracağını ve birçok yeni anlayışa yol açacağını umuyoruz.