Pasif AÇIKLIĞI temizlenmiş Mouse ovarium vasküler mimarisinin üç boyutlu yeniden yapılandırma

Bu protokolün genel amacı, fare yumurtalık foliküllerindeki kılcal damar dağılımının eksiksiz üç boyutlu bir görünümünü sağlamak ve bunların ilişkilerini göstermektir. Yumurtalık, üreme ve endokrinolojide temel bir organdır. Her bir farklı folikül gelişim evresini ve somatik hücreleri sayın.

Ayrıca, diğer organların aksine, yumurtalık fonksiyonel birimin tekrarlanan dallanmasını göstermez. Yerel vasküler sistem, sinir sistemi ile birlikte, yetişkin dişilerde her adet döngüsünde büyük değişikliklere uğrayabilmektedir. Yumurtalıkta pasif berraklaştırma uygulamak, yumurtalıktaki hücrelerin ve foliküllerin genel dağılımını ve birbirleriyle olan bağlantılarını görmemizi sağlar.

Bu ölçüm yönteminin en önemli özelliği, over üzerinde minimum etki yaratması ve çeşitli markerların temizlenmesine olanak sağlamasıdır. Mikroskobik görüntünün yeniden yapılandırılması yoluyla overin bir haritasını oluşturduk. Damarların, nöronların ve foliküllerin bazı detayları net bir şekilde gözlemlenebilmektedir.

Görüntü analizi için, ovaryum ile yapılar arasındaki ilişkileri değerlendirmek amacıyla Imaris'in bazı seçenekleri kullanılmıştır. Perfüzyon solüsyonlarını makale talimatlarına göre hazırlayın ve buz üzerinde muhafaza edin. Fareleri anestezi altına alın ve farenin ayak parmak sıkıştırma yanıtı vermediğinden emin olun.

Etanol püskürtün, sağ atriumda bir insizyon yapın, ardından kanı temizlemek için sol ventriküle dakikada 10 ml hızla 20 ml buz soğukluğunda PBS ile anında perfüzyon uygulayın. Daha sonra hayvanı aynı hızla soğuk Hidrojel Solüsyonu ile perfüze edin. Ovaryum morfolojisinin bütünlüğünü korumak için uterusla birlikte yumurtalıkları toplayın.

Ayrıştırılan yumurtalıkları soğuk Hidrojel Çözeltisine aktarın. Bir stereo mikroskop altında, yumurtalığın etrafındaki yağ dokularını temizleyin. Daha iyi bir doku fiksasyonu sonucu elde etmek için ovarian bursa'nın çıkarılmasını öneririz.

Overleri üç gün boyunca Hidrojel Solüsyonu içerisinde tutun. Üç gün sonra, overleri bir cam tüpe aktarın ve tüpü taze Hidrojel Solüsyonu ile doldurun. Tüpün üst kısmını parafilm ile kapatın ve ardından tüpün boyun kısmını başka bir parafilm ile sarın.

Parafilm ile Hidrojel Çözeltisi arasında hava kabarcığı kalmadığından emin olun. Jel oluşana kadar cam tüpü 37 °C'de iki saat boyunca çalkalayıcı inkübatöre yerleştirin. Overlerin etrafındaki fazla jeli bir kağıt filtre ile dikkatlice temizleyin.

Overleri 15ml'lik bir tüpe koyun ve tüpü 10ml berraklaştırma solüsyonu ile doldurun. Tüpü, 37 °C'de en az iki ay boyunca çalkalayıcı inkübatöre yerleştirin. Berraklaştırma solüsyonunu ilk üç gün boyunca her gün ve ardından over berraklaşana kadar haftalık olarak değiştirin.

Tüm immün boyama işlemleri, bir çalkalayıcı üzerinde 37 °C'de gerçekleştirilir. İlk olarak, over PBST ile 24 saat boyunca yıkanır. İkinci olarak, over PBST ile seyreltilmiş primer antikor içerisinde iki gün boyunca inkübe edilir.

Üçüncü olarak, primer antikorları PBST tamponu ile yıkayarak uzaklaştırın. Dördüncü olarak, yumurtalığı istenen sekonder antikor ile PBST içerisinde iki gün boyunca inkübe edin. Beşinci olarak, sekonder antikorları PBST ile yıkayarak uzaklaştırın.

Altıncı olarak, RI homojenizasyonu için yumurtalığı kırılma indisi eşleştirme solüsyonuna aktarın. Görsel şeffaflığı kontrol edin; yumurtalık tamamen berraklaştığında görüntüleme yapılabilir. İlk olarak, temiz bir cam tabanlı kap hazırlayın.

Bir macun silindiri hazırlayın ve bunu bir at nalı şekline getirin. Sızdırmaz bir alan oluşturmak için dış kenarı lam üzerine sıkıca bastırın. Macunun yüksekliği, overden biraz daha yüksek olmalıdır.

Overi dikkatlice merkeze taşıyın ve montaj solüsyonu ekleyin. Putty'nin üzerine bir kap bastırın ve sabitlemek için iki adet putty parçası kullanın. Overi görüntülemeye hazır olduğunda, görüntüleme için 16X lensli Nikon konfokal mikroskobu seçilebilir.

Konfokal mikroskop ile görüntüleme yapmak için öncelikle Ni-E panelinden lensi seçin. Görüntüleme (acquisition) panelinde kanal sayısını belirleyin. İlk olarak, dokuyu mikroskop okülerlerinden kontrol ederek alanın merkezine taşımak için Eye Port sekmesini ve XY kontrolcü joystick'ini kullanın.

İkinci olarak, shutter ışığını kapattıktan sonra, her kanal için lazer gücünü, HV ve offset değerlerini ayarlamak için live sekmesine tıklayın. Z Intensity Correction panelinde üst katman için görüntüleme ayarlarını yapın; üst sınırı tanımlamak için artı butonuna tıklayın, lensi aşağı doğru hareket ettirip dokunun altına uygun HV ve lazer gücünü ayarlayın ve en alt katman bilgisini ekleyip ayarları panel ve görüntüleme ile senkronize etmek için To ND seçeneğine tıklayın. Görüntüleme ayarlarında ise öncelikle tarama adımlarının sayısını belirleyin.

Z ve büyük görüntü sekmelerine tıklayın. İkinci olarak, doku sınırına göre alan boyutunu belirlemek için büyük görüntü tarama penceresine gidin. Üçüncü olarak, tarama alanlarının boyutunu girmek ve %10 ile %50 arasında bir örtüşme seçmek için ND kazanım ekranına geri dönün. Ardından Z düzeltmesini çalıştır düğmesine tıklayın ve görüntüleme işleminin tamamlanmasını bekleyin.

İlk olarak, orijinal NIS dosyasını açmak için Imagic programını kullanın. Görüntü butonuna tıklayın, renk ve görüntüleme kanallarını seçin, ardından dosya sekmesine tıklayıp görüntü dizilerini seçin ve bunları ayrı ayrı tiff dosyaları olarak kaydedin. İkinci olarak, tiff dosyalarından birini açmak için Imaris programını kullanın.

Düzenle düğmesine tıklayın ve geri kalanları eklemek için kanalları ekle seçeneğini belirleyin. İsim ve renk, görüntü ayarlarından değiştirilebilir. Dokunun kalınlığı da görüntü özelliklerinden düzeltilmelidir.

Üçüncü olarak, düzenleme düğmesine tıklayın ve fazla kısmı kesmek için Crop 3D seçeneğini belirleyin. İlk olarak, filament düğmesine tıklayın ve ardından sonraki düğmesine basın. Dilimleme paneline gidin, bir izleme kabı ve mesafe belirleyin, ardından Surpass'a geri dönerek statik değeri girin ve sonraki düğmesine tıklayın.

İkinci olarak, başlangıç ve ayar noktası eşiğini düzenleyin. Kamera panelinde seçimi yapın, shift tuşuna basın ve fazla kısmı kaldırmak için noktaya tıklayın. Üçüncü olarak, en yüksek eşiği seçin ve ilerle düğmesine tıklayın.

Algılanan noktaları seçmeyin ve ilerleyin. Fazla olan kısımlar düzenleme panelinden kaldırılabilir. Renk, rengin üzerine tıklanarak düzenlenebilir.

CD31 immünboyama sonrası over damar sisteminin 3D mimarisi incelenmiştir. 3D yapı, diğer kesitler üzerinden dilimler şeklinde veya hacimsel oluşturma yoluyla bütünsel olarak gözlemlenebilir. Yetişkin fare foliküler damar sisteminin CD31 boyaması gerçekleştirilmiştir.

Filamanlar aracılığıyla kılcal damarların yeniden yapılandırılması sayesinde, bireysel foliküller ve bunlara ait kılcal damarlar arasındaki ilişkiyi gösterebildik. Yumurtalık, bir kadın gibi, her zaman aktif ve değişkendir. Ancak, geleneksel histolojik analizlerin sınırlamaları nedeniyle, böylesine karmaşık bileşenler arasındaki ilişkileri tanımlamak oldukça zordur.

Yeni geliştirilen pasif netleştirme yöntemi, optik engellerin aşılmasına yardımcı olabilir, tüm dokuların bütünlüğünü koruyabilir ve fonksiyonel ipuçları sağlayabilir.