Name: Pasif AÇIKLIĞI temizlenmiş Mouse ovarium vasküler mimarisinin üç boyutlu yeniden yapılandırma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Keşfedin pasif CLARITY yöntemiyle fare ovaryum damar yapısının üç boyutlu yeniden yapılandırılmasını. Bu teknik, foliküller arasındaki kapiller dağılımı ve hücre ilişkilerini görselleştirerek üreme biyolojisi araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Postdocs için hibe Çin Özel Fonu tarafından desteklenmiştir (YF için No 2014T70392), Ulusal Doğa Bilimleri Foundation of China (YF için No 81673766), yeni öğretmen Priming Fonu, Bund'a Üniversitesi Zuoxue temeli ve geliştirme Shanghai en yüksek disiplinleri İntegratif tıp (20150407) projesi.

Tüm yordamları hayvan konular içeren hayvan Etik Komitesi Shanghai Medical College, Bund'a Üniversitesi (onay numarası 20160225-013) yönergeleri takip etti.
1. şeffaf Mouse ovarium hazırlanması
<ol><li>
Çözümler hazırlanması
	<ol>
<li>Fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) çözüm (1 M, pH 7,6) % 0.1 ile hazırlamak Triton X-100 (PBST). 10 x PBS hisse senedi çözüm 1 L yapmak, 87 gram NaCl, NaH2PO4 · 3.1 g mix 2H2O ve 28,7 g Na2HPO4 ·12H2O. dH2O 1 L ve heyecan ~ 2 h. ayarlama pH 7.4 için 1 N NaOH ile ekleyin ve oda sıcaklığında saklayın. Bu 10 x hisse senedi çözüm 1/10 tarafından seyreltik dH2O kullanarak ve % 0.1 yapın PBS Triton X-100.</li>
		<li>Mixings % (wt/vol) 4 paraformaldehyde (PFA) çözüm, %4 (wt/vol) Akrilamid, % 0.05 (wt/vol) bisacrylamide ve % 0.25 (wt/vol) VA-044 başlatıcı buz üzerinde çift distile suda hidrojel çözüm (pH 7.5) hazırlayın.</li>
		<li>Takas çözüm (pH 8,5) 200 mM sodyum Borat arabellek içeren %4 (wt/vol) Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) çift distile su karıştırılarak hazır olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transcardial perfüzyon ve yumurtalık hazırlık
	<ol>
<li>Buz üstünde tüm çözümleri tüm işlemler sırasında tutmak.</li>
		<li>Yetişkin kadın vahşi türü C57BL/6 fare mayi enjeksiyonu Fentobarbital (0.35 mg/kg) çözüm ile anestezi. Toe-çimdik yanıt gösterir sonra fare düzgün anestezi.</li>
		<li>Kullanım fare ile bacaklarda düzeltmek için bant bir düz köpük tahta üzerine uzanmış.</li>
		<li>Kalp makas ile bir kesik göğüs, cilt ve kemik xiphoid süreci tarafından ortaya çıkarmak.</li>
		<li>Hayvanın Sağ atrium içine bir kesi yapmak ve buz gibi 1 x PBS 10 mL/dk 20 mL ile sol ventrikül sıvı.</li>
		<li>En az 20 mL hidrojel çözeltisi 10 mL/dk hayvanla sıvı.</li>
		<li>Cilt medioventral hattı boyunca karın üzerinde bütün enterocoelia ortaya koyar, makas ile deşmek ve bağırsak kaldırın. Yumurtalık yumurtalık Morfoloji bütünlüğünü korumak için rahim toplamak.</li>
		<li>Mikroskop altında yumurtalık etrafında yağlı doku kaldırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gaz Giderme
	<ol>
<li>3 gündür fiksasyon için 4 ° C'de 10 mL hidrojel çözüm yumurtalıklar yerleştirin.</li>
		<li>Yumurtalık 5 mL tüp içine aktarmak ve tüp hidrojel çözüm ile doldurun. Parafilm tüp üst üzerinde streç ve sonra parafilm tüp boyun etrafında sarın. Dikkat: hava kabarcığı yok parafilm ve hidrojel çözüm arasında olduğundan emin olun.</li>
		<li>Bir shaker en fazla polimerize hidrojel izin vermek için 3 h 37 ° C'de kuluçka tüpü yerleştirin.</li>
		<li>Yumurtalık bir spatula kullanarak jel kaldır ve yumurtalık etrafında gelen jel aşırı doku kağıt tarafından dikkatli bir şekilde çıkarın. Yumurtalık dört kez 1 x PBS ile yıkayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pasif takas
	<ol>
<li>10 ml Temizleme çözüm yumurtalık daldırın. 37 ° C'de temizleme işlemini başlatmak için 80 rpm'de hafifçe sallayın.</li>
		<li>İlk haftasında 3 günde çözüm değiştirin. Bir hafta öncesine kadar yumurtalık açık olur sonra bir hafta sonra takas çözüm yenileyin. Genellikle bu süreç yaklaşık 2-3 hafta sürer. Not: Yumurtalık immunostained olabilir doğrudan veya immunostaining önce birkaç hafta 4 ° C'de PBS içinde saklanabilir sodyum azid (%0.02).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Immunostaining
<ol><li>Yumurtalık bir shaker olarak 37 ° C'de 1 günde iki kez PBST yıkayın.</li>
	<li>Bir shaker gün 2-3 37 ° C'de (Tablo 1) birincil antikorlar/PBST çözümünde tarihinde yumurtalık kuluçkaya İş burada, birincil antikorlar trombosit endotel hücre adezyon molekül 1 (CD31) sunuldu ve tirozin hidroksilaz sırasıyla 1:10 ve 1:50 PBST içinde seyreltilmiş. Dikkat: birincil antikor iki veya daha fazla tür kullandıysanız, farklı hayvan kaynakları olduğundan emin olun.</li>
	<li>PBST arabellek 37 ° C'de ile birincil antikorlar kapalı gün 4 bir shaker tarihinde yıkayın.</li>
	<li>Gün 5-6 bir shaker olarak 37 ° C'de PBST içinde istediğiniz ikincil antikorlar ile yumurtalık kuluçkaya. Burada sunulan çalışma, ikincil antikorlar tirozin hidroksilaz ve Alexa un 594 1:50 PBST de seyreltilmiş CD31 için Alexa un 488 içindi.</li>
	<li>PBST arabellek 37 ° C'de ile ikincil antikorlar kapalı bir shaker üzerinde 7 günü yıkayın.</li>
	<li>Doku Kırılma indisi homojenizasyon günde 8 için Kırılma indisi eşleşen çözüm içine aktarın. Kılavuz çizgilerini kılavuz çizgileri görülebilir olup olmadığını kontrol ederek onun görsel netlik kontrol etmek için bir kağıt doku koymak. Bir kez doku tam olarak açıklık vardır, yansıma.</li>
	<li>Sadece çevreler olabilir bir macun silindir doku yapmak ve bir at nalı Şekil şekil ve dış ridge bir cam slayt üzerine sıkıca kapalı bir yer açmak için tuşuna basın. Macun yüksekliğini yumurtalık biraz daha uzun olmalı.</li>
	<li>Açıklanan yumurtalık dikkatle macun ortasına yerleştirin ve Kırılma indisi çözüm eşleme ekleyin. Cam-alt çanak sıkıca macun koymak ve macun yemek düzeltmek için kullanın.</li>
</ol>3. confocal mikroskobu
<ol><li>Confocal mikroskop ile görüntüleme için uygun çalışma mesafesi (içinde bu durumda 2.0 mm) ile (Bu durumda su daldırma 25 X objektif lens, 1.1-NA, 2 mm-WD) lens "Ni-E" panelinde seçin.</li>
	<li>
"Satın alma" panelinde kanal sayısını seçin. Burada, üç kanal kullanın.
	<ol>
<li>İlk olarak, "göz port" sekmesini ve XY denetleyicisi joystick ile mikroskop göz mercekleri kontrol ederek alanın ortasına doğru doku taşımak için kullanın.</li>
		<li>Çekim ışığı kapatıp açtıktan sonra "lazer gücü", "HV (kazanç)", ayarlamak için "canlı" sekmesini tıklatın ve "ofset ' her biri için ayrı ayrı kanal. Yüksek lazer gücü ve HV daha yüksek sinyalleri açabilir ve daha yüksek ofset arka plan gürültü azaltabilir.</li>
		<li>Uygun "tarama boyutu" ve "Count" seçin. Tarama boyutu 1024 x 1024 µm2 ve 4-8 sayısını kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Doku derinliği panelinde tanımlamak için görüntü kalitesi "Z yoğunluğu düzeltme" ayarladıktan sonra ve sonra Yumurtalık (doku Center'da) en üst tabakası üzerinde objektif bulma ve üst katmanı edinmesinin ayarlama "artı" tıklayın üst katmanı tanımlamak için düğmesine basın.
	<ol>
<li>Lens aşağı taşı ve uygun HV ve lazer güç dokunun alt için ayarlayın ve en düşük katman bilgisi Z-yoğunluk düzeltme tabloya ekleyin. Bu ayar "ND edinme" paneli ile eşitlemek için "için ND" tıklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
İçinde "ND edinme" paneli, ilk seti tarama sayısını adımlar. O zaman, belgili tanımlık tabs "Z" ve "Büyük resmi" kene.
	<ol>
<li>Doku sınır doku görselleştirme yoluyla göz mercekleri yardımıyla göre alanın boyutu tanımlamak için "İnceden inceye gözden geçirmek büyük görüntü" penceresine gidin. Tarama alanının ("alanlar") boyutunu girip % 10 ve % 15 arasında örtüşme seçmek için "ND edinme" paneli geri dön.</li>
		<li>"Run Z düzeltme", "otomatik olarak uygun HV, lazer güç ve ofset her bir katman için ayarlamak ve görüntüyü işlemek beklemek değil çalışma şimdi",'ı tıklatın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 3D imar bireysel köklerinin ve onların Vasculatures
<ol><li>İlk olarak, ImageJ5 özgün NIS dosyasının açmak için kullanın. "Görüntü" düğmesini tıklatın ve "Renk" ve "Bölünmüş Kanallar" seçin. Ardından, "dosya" ve "Kayıt" "Görüntü sıralarını" seçeneğini kullanarak TIFF dosya serisi ayrı ayrı kanallar kaydedin.</li>
	<li>TIFF dosyası dizilerinde birini açmak için Imaris kullanın. "Düzenle" düğmesini tıklayın ve "Ekle Kanallar" Seç gerisi kanalları eklemek için. Kanalın rengini ve adı "Ekran ayarlama" sekmeleri değiştirebilirsiniz. Doku kalınlığı "Düzenle" altında aşağı açılan listesinde "Görüntü özellikleri" panelinde düzeltilmesi gerekebilir.</li>
	<li>3D son görüntüleri ve aşırı bölümleri kaldırılması kırpma için "Düzenle" düğmesini tıklayın ve "Ürün 3D" seçin. Alanın büyüklüğü kenarlığı sürükleyerek ayarlanabilir.</li>
	<li>
Gemi sinyalleri Surpass Masası'ndaki filamentler algoritması ile yeniden oluşturmak için yeni bir Filament oluşturmak ve İleri'yi tıklatın "Filamentler" düğmesini tıklatın.
	<ol>
<li>En büyük ve en ince çapı tanımlamak için "Dilim" Masası'na gidin ve izleme Taşıyıcıyı bulmak. Mesafe, "Ölçü" panelde iki noktada en büyük genişliğe geminin seçerek otomatik olarak gösterilecek.</li>
		<li>Tekrar "Surpass" Masası'na gidin ve ölçülen genişliği girin ve İleri'yi tıklatın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Başlangıç ve tohum noktası eşik ayarlayın. "Kamera" panelinde, "Seç". Bazı otomatik olarak üretilen küreler kaldırılması gerekiyorsa, Shift tuşunu basılı tutun ve üzerinde noktasını tıklatın. "Bul" seçme ve fareyi hareket ettirerek, yapısı doğru noktaları muhafaza edilmiştir ve İleri'yi tıklatın emin olmak için döndürülebilir.</li>
	<li>Yerel kontrast için en yüksek eşik seçin ve İleri'yi tıklatın. Değil "Tespit Spines" seçin ve kan damarı silindir yeniden inşası sonuçlandırmaya devam. Rengi "Renk" sekmesine tıklayarak düzenlenebilir. İstatistik verilerini yeniden oluşturulan Filament "İstatistik" panelinde elde edilebilir. Aşırı parça-ebilmek var olmak çıkarmak "Düzenleme" paneline. Not: Toplam köklerinin veya Folliküler duvarlar ses düzeyini ölçmek için diğer algoritmalar kullanılabilir. Burada sunulan çalışma, yumurtalar her iki ikincil antikorlar autofluorescence tarafından işaretlenen. Büyük miktarda veri nedeniyle bir iş istasyonu sunucu veri analizi için kullanıldı.</li>
</ol>5. istatistiksel analiz
Not: Görüntü analiz veri ± standart hataları aracı olarak sunulmaktadır.
<ol><li>Bağımsız örnek t-testi kullanarak köklerinin arasında karşılaştırmalar yapmak ve Pearson korelasyon testi korelasyon katsayıları foliküler duvar ve kılcal damar uzunluğu karşılaştırmak için kullanın. P değeri < istatistiksel anlamlılık sınırı olarak 0,05.</li>
</ol>

<ol><li>Brown, H. M., Russell, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+and+lymphatic+vasculature+in+the+ovary%3A+development%2C+function+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Blood and lymphatic vasculature in the ovary: development, function and disease.</a> Hum Reprod Update. 20 (1), 29-39 (2014).</li>
<li>McFee, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+signal+transduction+blocks+follicle+progression+but+does+not+necessarily+disrupt+vascular+development+in+perinatal+rat+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries.</a> Biol Reprod. 81 (5), 966-977 (2009).</li>
<li>Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-dimensional+analysis+of+vascularization+during+primary+development+of+an+organ%2C+the+gonad%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (20), 7212-7217 (2008).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+Open+Source+platform+for+biological+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an Open Source platform for biological image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Cao, G., Fehrenbach, M. L., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Zhu, J. X., Delisser, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+platelet+endothelial+cell+adhesion+molecule-1-null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in platelet endothelial cell adhesion molecule-1-null mice.</a> Am J Pathol. 175 (2), 903-915 (2009).</li>
<li>Manni, L., Holmäng, A., Lundeberg, T., Aloe, L., Stener-Victorin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+expression+of+alpha+%281%29-+and+beta+%282%29-adrenoceptors+and+p75+neurotrophin+receptors+in+rats+with+steroid-induced+polycystic+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Auton+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ovarian expression of alpha (1)- and beta (2)-adrenoceptors and p75 neurotrophin receptors in rats with steroid-induced polycystic ovaries.</a> Auton Neurosci. 118 (1 - 2), 79-87 (2005).</li>
<li>Chourasia, T. K., Chaube, R., Singh, V., Joy, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annual+and+periovulatory+changes+in+tyrosine+hydroxylase+activity+in+the+ovary+of+the+catfish+Heteropneustes+fossilis%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Comp+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Annual and periovulatory changes in tyrosine hydroxylase activity in the ovary of the catfish Heteropneustes fossilis.</a> Gen Comp Endocrinol. 166 (1), 111-116 (2010).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+reveals+dynamics+of+ovarian+follicular+architecture+and+vasculature+in+three-dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions.</a> Sci Rep. 7, 44810(2017).</li>
<li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+principles+in+tissue+clearing+and+staining+protocols+for+whole-body+cell+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 32, 713-741 (2016).</li>
<li>Liang, H., Schofield, E., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Serotonergic+Fibers+in+the+Mouse+Spinal+Cord+Using+the+CLARITY%2FCUBIC+Technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique.</a> J Vis Exp. (108), e53673(2016).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Phillips, J., Laude, A., Lightowlers, R., Morris, C. M., Turnbull, D. M., Lax, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+passive+CLARITY+and+immunofluorescent+labelling+of+multiple+proteins+in+human+cerebellum%3A+understanding+mechanisms+of+neurodegeneration+in+mitochondrial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease.</a> Sci Rep. 6, 26013(2016).</li>
<li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+clearing+of+the+mouse+central+nervous+system+using+passive+CLARITY%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li>
<li>Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+optical+transparency+of+rodent+tissues+by+modified+PACT-based+passive+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing.</a> Exp Mol Med. 48 (12), e274(2016).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Chung, A. S., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+pathological+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental and pathological angiogenesis.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 563-584 (2011).</li>
<li>Rodgers, R. J., Irving-Rodgers, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+ovarian+follicular+antrum+and+follicular+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Formation of the ovarian follicular antrum and follicular fluid.</a> Biol Reprod. 82 (6), 1021-1029 (2010).</li>
<li>Siu, M. K. Y., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-follicle+barrier+%28BFB%29+in+disease+and+in+ovarian+function%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">The blood-follicle barrier (BFB) in disease and in ovarian function.</a> Adv Exp Med Biol. 763, 186-192 (2014).</li>
<li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat Methods. 4, 331-336 (2007).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clear%28T%29%3A+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Clear(T): a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140, 1364-1368 (2013).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/neuro/journal/v16/n8/full/nn.3447.html">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li>
<li>Lai, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rationalisation+and+validation+of+an+acrylamide-free+procedure+in+three-dimensional+histological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Rationalisation and validation of an acrylamide-free procedure in three-dimensional histological imaging.</a> PLOS ONE. 11, e0158628(2016).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li>
<li>Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27627784">Free-of-acrylamide SDS-based tissue clearing (FASTClear): A novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualisation of human brain tissues.</a> Neuropathol Appl Neurobiol. 43, 346-351 (2016).</li>
<li>Xu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+free-of-acrylamide+clearing+tissue+%28FACT%29-an+optimized+new+protocol+for+rapid%2C+high-resolution+imaging+of+three-dimensional+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of three-dimensional brain tissue.</a> Sci Rep. 7, 9895(2017).</li>
<li>Migone, F. F., Cowan, R. G., Williams, R. M., Gorse, K. J., Zipfel, W. R., Quirk, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+reveals+an+essential+role+of+vasoconstriction+in+rupture+of+the+ovarian+follicle+at+ovulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 2294-2299 (2016).</li>
<li>Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-mount+approach+for+accurate+quantitative+and+spatial+assessment+of+fetal+oocyte+dynamics+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice.</a> Biol Reprod. 93 (113), (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Mevcut çalışmada, kılcal damarlar ve bireysel büyüyen köklerinin arasındaki ilişkileri değerlendirmek için görüntüleme 3D tanıtacağız. Önceki çalışmalarda, aynı protokolü 9kullanarak rolleri büyük damarlara, köklerinin ve köklerinin olduğu gibi fare yumurtalık içinde konumunu arasındaki etkileşimler okudu. Pasif NETLİK yaklaşımı mikro ve makro vasculatures, folliculogenesis ve karşılıklı ilişkileri arasında corpora lutea ve köklerinin de yumurtalık mimarisi farklı gelişim dönemleri yeniden olarak ...

Folikül temel yapısal ve Fonksiyonel yumurtalık birimidir ve onun gelişme son derece yumurtalık içinde damarlara ilgilidir. Kan damarları beslenme ve hormonlar köklerinin sağlamak ve böylece büyüme ve olgunlaşma köklerinin1önemli rol oynarlar.
Seçici kan damarı işaretleri, transgenik fare modelleri ve ilaç geliştirme teknolojileri kombinasyonu yumurtalık damar ağları, anjiogenez ve kan damarlarının fonksiyonu hakkında bilgimizi artmıştır folliculogenesis. Bu remodels çeşitli doku ve damar ağları folliculogenesis ve yumurtlama sırasında yumurtalık etkin bir organ bilinir. Boyutu ve yapısı damarlarının etkin böyle remodeling geliştirme ve köklerinin işe biyolojik fonksiyonu için gereklidir.
Yumurtalık bölümler ve immunolabeling kan damarlarının kullanarak geleneksel histolojik ve histomorphometric yöntemleri için iki boyutlu (2B) görüntüleri2sınırlıdır. Üç boyutlu (3D) imar teknolojilerinin gelişmesiyle birlikte, dokusu dilimlerin 2D görüntüleri 3D bir yapı yapmak için örtüşen, ancak bu yöntem, hala bazı sınırlamalar vardır — doku kesit microstructures, bazı kısımları yok doku genellikle eksik ve önemli emek dilimleri elde edilen görüntülerden 3B rekonstrüksiyonlar yapımında ilgilenmektedir. Bütün doku 3D görüntüleme confocal mikroskobu ile bu sınırlamaların çoğunu üstesinden gelebilir, ama bu yöntemlerin angiogenez embriyonik Over3değerlendirilmesi ile sınırlıdır. Bütün doku NETLİK4 gibi yöntemleri takas kullanarak doğum sonrası ve yetişkin yumurtalık bu sorunları çözmek için görüntülenmeyecektir birimin artırabilir ve optik izni olmadan herhangi bir yapısal deformasyonlar yumurtalık tür yöntemler sağlar. Sağlam yumurtalık 3D mimari görüntüleme için görüntü analiz yazılımı, bu çalışmada kullanılan Imaris yazılım paketi gibi bir doğru görüntü veritabanı sağlar.
Yumurtalık yetişkinlik boyunca remodeling dinamik bir fizyolojik sistemin ve bu yönetmelik angiogenez soruşturmalar için mükemmel bir model yumurtalık yapar. Ayrıca, polikistik over sendromu veya yumurtalık kanserleri gibi kadın üreme sisteminin patolojik koşullarında yumurtalık kan damarları rolünün değerlendirilmesi tüm yumurtalık dokusu görüntüleme aracılığıyla okudu. Pasif NETLİK yöntem geliştirilmesi ve gelişmiş görüntü analizi yazılımı kullanımı olması koşuluyla detaylı mekansal bilgi kan damarları ve köklerinin gibi yumurtalık yapıları arasındaki ilişkileri.

<table><tbody><tr><td>Akrilamit</td><td>Vetec</td><td>v900845</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845</td></tr><tr><td>Alexa Unu 488 (Seyreltme 1:50)&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A11039</td><td>https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039</td></tr><tr><td>Alexa Un 594 (Seyreltme 1:50)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A11012</td><td>https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012</td></tr><tr><td>Bisakrilamid</td><td>Amresco</td><td>172</td><td>http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx</td></tr><tr><td>Siyah duvar cam alt tabağı (Willco-Dish)</td><td>Ted Pella</td><td>14032</td><td>http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall</td></tr><tr><td>Borik asit</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif</td><td>10004818</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818</td></tr><tr><td>Disodyum hidrojen fosfat dodekahidrat (Na2HPO4 12H < alt > 2 O)</td> <td>Sinopharm Kimyasal Reaktif</td><td>10020318</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318</td></tr><tr><td>FocusClear</td><td>Celexplorer</td><td>FC-102</td><td>http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td>http://www.parafilm.com/products</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif</td><td>80096618</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618</td></tr><tr><td>PECAM1/CD31, trombosit-endotel hücre adezyon molekülü 1 (Seyreltme 1:10)</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html</td></tr><tr><td>Foto başlatıcı VA044</td><td>Wako</td><td>va-044/225-02111</td><td>http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm</td></tr><tr><td>Sodyum azid</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif</td><td>10019318</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318</td></tr><tr><td>Sodyum dihidrojen fosfat dihidrat (NaH<alt>2</alt>PO4</alt> 2H<alt>2</alt>O)</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif</td><td>20040718</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718</td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif</td><td>30166428</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428</td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit (NaOH)</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif</td><td>10019718</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif</td><td>30188928</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928</td></tr><tr><td>Tirozin hidroksilaz (TH, Seyreltme 1:50)</td><td>Abcam</td><td>ab76442</td><td>http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html</td></tr></tbody></table>

pasif aÇikliĞi temizlenmiş mouse ovarium vasküler mimarisinin üç boyutlu yeniden yapılandırma

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

Yumurtalık kadın üreme sisteminin ana organ ve kadın gamet üretim için ve endokrin sistem, karmaşık yapısal ilişkiler ve üç boyutlu (3D) damarlara mimarileri, ama kontrol etmek için önemlidir Yumurtalık de açıklanan değildir. 3D bağlantıları ve bozulmamış yumurtalık kan damarlarının mimarisini görselleştirmek için ilk önemli adım yumurtalık optik açık hale getirmektir. Doku büzülme önlemek amacıyla, biz hidrojel kullanılan pasif NETLİK fiksasyon tabanlı (Akrilamid melezleşmiştir Rigid temizleyin Lipid değiş tokuş görüntüleme / Immunostaining/In situ hibridizasyon-uyumlu doku hidrojel) protokol yöntemi sağlam bir yumurtalık temizlemek için . Immunostaining, Gelişmiş multiphoton confocal mikroskobu ve 3D görüntü rekonstrüksiyonu yumurtalık damarlarının ve foliküler kılcal görselleştirme için kullanılmıştır. Bu yaklaşımı kullanarak, önemli bir pozitif korelasyon gösterdi (P < 0,01) foliküler kılcal damarlar ve foliküler duvar hacmi uzunluğu arasında.

Biz pasif yumurtalık foliküler ve vasküler mimari koruma ve damarları ve köklerinin etiketli işaretleri en yüksek floresan sinyal alma sırasında takas için hızlı ve basit bir yöntem pasif NETLİK yöntemi uyarlanmış. Foliküler damarlara 3D mimari CD31, endotel hücreleri6avans için immunostaining tarafından tespit edilmiştir. Yetişkin fareler yumurtalıklarda CD31 boyama Filament algoritmasıyla ve foliküler kılcal damarlar ve birincil ve ikincil foliküller (<strong cla...

Burada olduğu gibi fare yumurtalıklarda bir uyum pasif NETLİK ve 3D yeniden yapılanma yöntemi yumurtalık damarlara ve foliküler kılcal görselleştirme için mevcut.

Pasif AÇIKLIĞI temizlenmiş Mouse ovarium vasküler mimarisinin üç boyutlu yeniden yapılandırma

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Bu protokolün genel amacı, fare yumurtalık foliküllerindeki kılcal damar dağılımının eksiksiz üç boyutlu bir görünümünü sağlamak ve bunların ilişkilerini göstermektir. Yumurtalık, üreme ve endokrinolojide temel bir organdır. Her bir farklı folikül gelişim evresini ve somatik hücreleri sayın.Ayrıca, diğer organların aksine, yumurtalık fonksiyonel birimin tekrarlanan dallanmasını göstermez. Yerel vasküler sistem, sinir sistemi ile birlikte, yetişkin dişilerde her adet döngüsünde büyük değişikliklere uğrayabilmektedir. Yumurtalıkta pasif berraklaştırma uygulamak, yumurtalıktaki hücrelerin ve foliküllerin genel dağılımını ve birbirleriyle olan bağlantılarını görmemizi sağlar.Bu ölçüm yönteminin en önemli özelliği, over üzerinde minimum etki yaratması ve çeşitli markerların temizlenmesine olanak sağlamasıdır. Mikroskobik görüntünün yeniden yapılandırılması yoluyla overin bir haritasını oluşturduk. Damarların, nöronların ve foliküllerin bazı detayları net bir şekilde gözlemlenebilmektedir.Görüntü analizi için, ovaryum ile yapılar arasındaki ilişkileri değerlendirmek amacıyla Imaris'in bazı seçenekleri kullanılmıştır. Perfüzyon solüsyonlarını makale talimatlarına göre hazırlayın ve buz üz

three-dimensional-reconstruction-vascular-architecture-passive

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu çalışmada tersinir doku takas, immunostaining, 3D işleme ve analiz insan plasenta villus örneklerinde sırasına 1-2 mm3damar ağları için bir protokol sunar.

Üç boyutlu görüntü oluşturma ve çözümleme-in Immunolabeled, açıklık insan plasental Villous damar ağları

Burada, köklerinin genç farelerin kültürlü yumurtalık içinde seri kesit olmadan ölçmek için bir protokol mevcut. Ayirt bütün organ ve doku takas kullanarak, fiziksel kesit optik kesit ile değiştirilir. Bu yöntem örnek hazırlama ve görselleştirme organ bütünlüğü korur ve belirli hücre otomatik miktar kolaylaştırır.

Bütün Dağı ayirt ve kültürlü fare yumurtalıklarda folikül miktar

Yumurtalık dokusu kültürler folikül gelişim, yumurtlama ve folikül atrezi modelleri olarak kullanılabilir ve düzenleyici mekanizmaları dinamik yumurtalık işlemleri gösterir.

Mouse ovarium olayları görselleştirmek için yumurtalık doku kültürü

Burada, sabit fare yumurtalık dokularının doğru folikül sayımı için iki farklı tekniği açıklıyor, karşılaştırıyor ve karşılaştırıyoruz.

Yetişkin Fare Yumurtalıklarında Doğru Folikül Numaralandırması

Burada, tam montajlı immünoboyama, çoklu foton mikroskobu ve 3D görselleştirme ve analiz kullanarak kantitatif ve kalitatif analizler için tüm yumurtalıkları görüntülemek için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, toksikoloji, klinik teşhis ve yumurtalık fonksiyonunun genomik tahlilleri için geçerli olan yüksek verimli, güvenilir ve tekrarlanabilir işlemeyi kapsar.

Farede Gelişmekte Olan Yumurtalık Rezervinin Kantitatif 3D Analizi için Tüm Yumurtalık İmmünofloresansı, Temizleme ve Multifoton Mikroskobu

Retinal vasküler sistemdeki perisitler, retroorbital floresan domates lektin enjeksiyonu sonrası trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü β ile immünofloresan boyama ile incelendi. Etiketli retina, doku temizleme yöntemi ile daha fazla tedavi edildi ve retina vaskülatürünü çevreleyen perisitlerin üç boyutlu görünümlerini konfokal mikroskop altında görselleştirmek için tamamen monte edildi.

Farelerde Retinal Vasküler Perisitlerin İmmün Boyama ile 3D Görüntülenmesi 

Yumurtlama öncesi dönemde yumurtalık kan akışındaki değişiklikler yumurtlama için gereklidir. Doppler ultrasonografi insanlarda ve büyük hayvanlarda over hemodinamiği ve perfüzyonunu değerlendirmek için kullanılmıştır. Farelerde yumurtlama öncesi ve periovulatuar fazlarda yumurtalık hemodinamisini değerlendirmek için Doppler ultrasonografi uygulamak için bir protokol sunulmuştur.

Farelerde Canlı Görüntüleme ve Ovaryan Vasküler Fonksiyonun Ölçülmesi için Doppler Ultrasonografi

Hi-C yöntemi kromatin etkileşimler (1) tarafsız, genom kimlik sağlar. Hi-C çiftler yakınlık ligasyonu ve güçlü paralel sıralama. Ortaya çıkan veriler farklı ölçeklerde genomik mimarlık eğitimi için kullanılabilir: ilk sonuçlar, kromozom toprakları, segregasyon, açık ve kapalı kromatin ve megabase ölçekte kromatin yapısı gibi özellikleri tespit.

Hi-C: genomların Üç boyutlu Mimari Eğitim Bir Yöntem.

Onlar pluripotency için standart testleri geçmek bile oluşturuluyor indüklenen pluripotent kök hücre (IPSC) hatları gelişim potansiyeli birbirinden farklı çizgiler üretir. Burada sahip tam olarak pluripotency IPSC hattı tanımlayan iPSCs, tamamen edilen fareler üretmek için bir protokol...

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

Biz tek hücrelerin üç boyutlu konfokal floresans alınan tanımsız bir şekil morfolojisi değişiklikleri ölçmek için Imaris Nörobilim, ImarisXT ve MATLAB kullanan bir yazılım platformu geliştirdi. Bu yeni yaklaşım, reseptör aktivasyonunu takiben hücre şekli değişiklikleri ölçmek için kullanılır ve bu nedenle ilaç keşfi için olası ek bir araç temsil edilebilir.

Üç boyutlu Floresans Images Hücresel Morfoloji Değişiklikleri rakamlarla Analitik Aracı

Keşfedin pasif CLARITY yöntemiyle fare ovaryum damar yapısının üç boyutlu yeniden yapılandırılmasını. Bu teknik, foliküller arasındaki kapiller dağılımı ve hücre ilişkilerini görselleştirerek üreme biyolojisi araştırmalarına katkı sağlar.

Pasif AÇIKLIĞI temizlenmiş Mouse ovarium vasküler mimarisinin üç boyutlu yeniden yapılandırma

Daha fazla video keşfet