Pasif AÇIKLIĞI temizlenmiş Mouse ovarium vasküler mimarisinin üç boyutlu yeniden yapılandırma
10 Aralık 2017
Burada olduğu gibi fare yumurtalıklarda bir uyum pasif NETLİK ve 3D yeniden yapılanma yöntemi yumurtalık damarlara ve foliküler kılcal görselleştirme için mevcut.
Bu protokolün genel amacı, fare yumurtalık foliküllerindeki kılcal dağılımın tam bir üç boyutlu görünümünü sağlamak ve ilişkilerini göstermektir. Yumurtalık, üreme ve endokrinolojide önemli bir organdır. Folikülün ve somatik hücrelerin her farklı gelişim aşamasını sayın.
Ek olarak, diğer organlardan farklı olarak, yumurtalık, fonksiyonel birimin tekrarlanan dallanmasını göstermez. Lokal vasküler sistem sinir sistemi ile birlikte olabileceği gibi erişkin kadınlarda da her adet döngüsünde büyük değişiklikler geçirebilir. Yumurtalıktaki pasif berraklığı uygulamak, yumurtalıktaki bu hücreler ve foliküller arasındaki genel dağılımı ve bağlantıyı görmemizi sağlar.
Bu ölçümün en önemli özelliği, yumurtalık üzerinde en az etkiye sahip olması ve çeşitli belirteçlerin temizlenmesini açıklamasıdır. Mikroskobik görüntünün yeniden yapılandırılması yoluyla yumurtalığın bir haritasını sağladık. Damarların, nöronların ve foliküllerin bazı detayları net bir şekilde gözlemlenebilir.
Görüntü analizi için, over ve yapılar arasındaki ilişkileri değerlendirmek için Imaris'in bazı seçenekleri kullanıldı. Makale talimatına göre bolluk çözeltileri hazırlayın ve buz üzerinde tutun. Fareleri uyuşturun ve farenin ayak parmağını sıkıştırma tepkisi olmadığından emin olun.
Etanol püskürtün, sağ atriyumda bir kesi yapın, ardından kanı temizlemek için sol ventrikülü dakikada 10 ml hızında 20 ml buz gibi soğuk PBS ile anında doldurun. Daha sonra hayvanı aynı hızda soğuk hidrojel çözeltisi ile doldurun. Yumurtalık morfolojisinin bütünlüğünü korumak için yumurtalıkları ve uterusu toplayın.
Ayrılan yumurtalıkları soğuk hidrojel çözeltisine aktarın. Stereo mikroskop altında yumurtalık çevresindeki yağ dokularını çıkarın. Doku fiksasyonunun daha iyi sonuç vermesi için yumurtalık bursasının çıkarılmasını öneriyoruz.
Yumurtalıkları üç gün boyunca Hidrojel Solüsyonunda tutun. Üç gün sonra, yumurtalıkları bir cam tüpe aktarın ve tüpü taze Hidrojel Çözeltisi ile doldurun. Parafilmi tüpün üstüne gerin ve ardından tüpün boynuna başka bir parafilm sarın.
Parafilm ile Hidrojel Çözeltisi arasında kabarcık olmadığından emin olun. Cam tüpü, jel oluşana kadar iki saat boyunca 37 derece Santigratta bir çalkalayıcı inkübatöre yerleştirin. Yumurtalıkların etrafındaki fazla jeli bir kağıt filtre ile dikkatlice çıkarın.
Yumurtalıkları 15 ml'lik bir tüpe koyun ve tüpü 10 ml'lik temizleme solüsyonu ile doldurun. Tüpü en az iki ay boyunca 37 derece Santigrat derecede bir çalkalayıcı inkübatöre yerleştirin. Temizleme solüsyonunu ilk üç gün içinde her gün ve daha sonra yumurtalık temizlenene kadar haftada bir değiştirin.
Tüm immün boyama prosedürleri bir çalkalayıcı üzerinde 37 santigrat derecede yapılır. İlk olarak, yumurtalığı 24 saat boyunca PBST'de yıkayın. İkinci inkübe primer antikorda yumurtalık, iki gün boyunca PBST ile seyreltilir.
Üçüncüsü, birincil antikorları PBST tamponu ile yıkayın. Dördüncüsü, yumurtalığı iki gün boyunca PBST'de istenen ikincil antikorla inkübe edin. Beşinci olarak, ikincil antikorları PBST ile yıkayın.
Altıncı olarak, yumurtalığı RI homojenizasyonu için bir kırılma indisi eşleştirme çözeltisine aktarın. Görsel şeffaflığı kontrol edin, yumurtalık tamamen netleştiğinde görüntülenebilir. İlk önce temiz bir cam alt tabak hazırlayın.
Bir macun silindiri yapın ve at nalı şeklinde şekillendirin. Kapalı bir alan oluşturmak için dış kenarı cam sürgünün üzerine sıkıca bastırın. Macunun yüksekliği yumurtalıktan biraz daha yüksek olmalıdır.
Yumurtalığı dikkatlice merkeze doğru hareket ettirin ve montaj solüsyonu ekleyin. Bir tabağı macunun üzerine itin ve sabitlemek için iki macun parçası kullanın. Yumurtalık görüntülenmeye hazır olduğunda, görüntülemek için 16X lensli Nikon konfokal mikroskop seçilebilir.
Konfokal mikroskop ile görüntüleme için öncelikle Ni-E panelindeki lensi seçiniz. Panel alımında kanal sayısını seçin. İlk olarak, mikroskop göz mercekleri ile kontrol ederek dokuyu alanın merkezine hareket ettirmek için Eye Port sekmesini ve XY denetleyici joystick'ini kullanın.
İkinci olarak, deklanşör ışığını kapattıktan sonra, her kanal için lazer gücünü, HV'yi ve ofseti ayarlamak için canlı sekmesine tıklayın. Panelde Z Yoğunluk Düzeltmesi üst katman için alımı ayarlayın, üst kısmı tanımlamak için artı düğmesine tıklayın, lensi aşağı hareket ettirin ve dokunun altına uygun HV ve lazer gücünü ayarlayın ve en düşük katman bilgilerini ekleyin, ayarı panel ve alım ile senkronize etmek için ND'ye tıklayın. Ve edinimde, önce tarama adımlarının sayısını ayarlayın.
Z'nin sekmelerine ve büyük resme tıklayın. İkinci olarak, dokunun sınırına göre alanın boyutunu tanımlamak için büyük görüntüyü tara penceresine gidin. Üçüncüsü, tarama alanlarının boyutunu girmek ve %10 ve %50 içindeki örtüşmeyi seçmek için ND alımına geri dönünArdından Z düzeltmesini çalıştır'a tıklayın ve görüntüleme işlemini bekleyin.
İlk olarak, orijinal NIS dosyasını açmak için imagic'i kullanın. Görüntü düğmesine tıklayın, renk ve görüntüleme kanallarını seçin, ardından dosyaya tıklayın, görüntü dizilerini seçin ve bunları tiff dosyaları olarak ayrı ayrı kaydedin. İkinci olarak, tiff dosyalarından birini açmak için Imaris'i kullanın.
Düzenle düğmesine tıklayın ve geri kalanını eklemek için kanal ekle'yi seçin. İsim ve renk, ekran ayarında değiştirilebilir. Görüntü özelliklerinde doku kalınlığı da düzeltilmelidir.
Üçüncüsü, düzenle düğmesine tıklayın ve fazla kısmı kesmek için 3D'yi Kırp'ı seçin. İlk olarak, filament düğmesine tıklayın ve ileri'ye tıklayın. Dilim paneline gidin, bir izleme gemisi ve mesafesi bulun, ardından Aşma noktasına geri dönün, statik değeri girin ve ileri'ye tıklayın.
İkinci olarak, başlangıç ve ayar noktası eşiğini ayarlayın. Kamera panelinde, seçimi seçin, shift tuşuna basın ve fazla parçayı çıkarmak için noktaya tıklayın. Üçüncüsü, en yüksek eşiği seçin ve ileri'ye tıklayın.
Noktaları algılamayı seçmeyin ve bir sonrakine geçin. Düzenleme panelinde bazı fazla parçalar kaldırılabilir. Renk, renk tıklanarak düzenlenebilir.
Over vaskülatür 3D mimarisi CD31 immün boyamayı takiben araştırıldı. 3B yapı, diğer dilimler aracılığıyla dilimler tarafından veya hacim oluşturma yoluyla tamamen gözlemlenebilir. CD 31 erişkin farede foliküler vaskülatür boyamaları yapıldı.
Kılcal damarların filamentler tarafından yeniden yapılandırılması yoluyla, tek tek foliküller ve kılcal damarları arasındaki ilişkiyi gösterebiliriz. Yumurtalık, bir kadın gibi, her zaman aktif ve değiştirilebilir. Bununla birlikte, geleneksel histolojik analizin sınırlaması nedeniyle, bu tür karmaşık bileşenler arasındaki ilişkileri tanımlamak çok zordur.
Yeni geliştirilen yöntem olan pasif netlik, optik engeli aşmamıza, tüm dokuların bütünlüğünü korumamıza ve fonksiyonel ipuçlarını sağlamamıza yardımcı olabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, pasif CLARITY yönteminin, sağnam fare yumurtalıklarındaki yumurtalık vaskülatürü ve foliküler kılcal damarları görselleştirmek için bir adaptasyonunu sunar. Protokol, yumurtalık folikülleri içindeki kılcal damar dağılımının kapsamlı üç boyutlu bir görünümünü sağlamayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Önemli Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Üreme Biyolojisi
- Vasküler Biyoloji
Arka Plan
- Yumurtalık, üreme ve endokrinoloji açısından kritik bir rol oynar.
- Foliküller, her biri farklı somatik hücreler içeren çeşitli gelişim aşamalarından geçer.
- Diğer organlardan farklı olarak, yumurtalık fonksiyonel birimlerin tekrarlanan dallanmasını göstermez.
- Yumurtalıktaki vasküler sistem, her menstrüel döngü sırasında önemli ölçüde değişebilir.
Çalışmanın Amacı
- Fare yumurtalık foliküllerindeki kılcal damarların genel dağılımını görselleştirmek.
- Yumurtalık içindeki hücreler ve foliküller arasındaki ilişkileri göstermektedir.
- Yumurtalık vaskülatürünü ve üreme sağlığı üzerindeki etkilerini anlamamızı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Pasif CLARITY tekniğinin uygulanması.
- Yumurtalık vaskülatürünün üç boyutlu yeniden yapılandırılması.
- Sağnam fare yumurtalıklarındaki foliküler kılcal damarların görselleştirilmesi.
- Foliküllerin ve somatik hücrelerin farklı gelişim aşamalarının sayımı.
Ana Sonuçlar
- Yumurtalık foliküllerindeki kılcal ağların başarılı görselleştirilmesi.
- Foliküller arasındaki vasküler bağlantıların detaylı haritalandırılması.
- Yumurtalık vaskülatüründeki dinamik değişiklikler hakkında içgörüler.
- Yumurtalık biyolojisi üzerine gelecekteki çalışmalar için bir çerçeve oluşturulması.
Sonuçlar
- Pasif CLARITY yöntemi, yumurtalık vasküler mimarisini etkili bir şekilde ortaya koymaktadır.
- Bu yaklaşım, yumurtalık fonksiyonu ve sağlığı hakkındaki anlayışımızı geliştirebilir.
- Gelecekteki araştırmalar bu bulgulara dayanarak üreme endokrinolojisini araştırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Visualizing intact ovarian vasculature in 3D enables mechanistic de-risking of reproductive target hypotheses by clarifying structural relationships between follicles and their capillary networks. This approach supports predictive confidence in early discovery by providing quantitative, reproducible readouts of vascular architecture that can inform target validation and phenotypic screening workflows. The method addresses a key discovery-stage challenge: linking anatomical context to functional ovarian biology without tissue distortion.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping follicular capillary length to follicular wall volume, supporting functional target validation.
- Operational Value: Provides a standardized, shrinkage-minimized clearing protocol that preserves tissue integrity for reproducible vascular analysis.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking through quantitative correlation data (P<0.01) between capillary extent and follicular development.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated 3D vascular maps that serve as disease-relevant systems for assessing compound effects on ovarian microstructure.
- Operational Value: Enables assay standardization via consistent immunostaining (CD31), clearing, and imaging parameters across follicles.
- Scalability: Supports platform reuse through adaptable clearing and reconstruction workflows applicable to other endocrine tissues.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links discovery-stage vascular phenotypes to preclinical models by preserving native ovarian architecture for longitudinal study.
- Mechanistic De-risking: Clarifies neurovascular interactions in the ovary, reducing ambiguity in endocrine target pathways.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides structural biomarkers (e.g., capillary length, follicular volume) to inform go/no-go decisions in follicle-modulating programs.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling hypothesis-driven analysis of vascular contributions to follicle maturation, supporting lead identification through phenotypic vascular profiling, and informing preclinical validation via intact tissue phenotyping.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of vascular regulators in follicle development through direct 3D visualization of capillary networks.
- Screening: Delivers assay-ready, cleared ovarian tissue with quantitative vascular outputs for compound screening campaigns.
- Analytics: Provides morphometric measurements (capillary length, follicular volume) and correlation statistics to enable comparative condition analysis.
- Translational Research: Maintains histological fidelity from discovery through preclinical stages by avoiding tissue sectioning artifacts.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable vascular mapping capability for endocrine and reproductive tissue atlases across discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity in ovarian vascular biology.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across labs via passive CLARITY’s minimal tissue perturbation.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of vascular-related follicle phenotypes, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on vascular-structural phenotypes in follicle cohorts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hydrogel-based tissue clearing, immunostaining, and multiphoton confocal microscopy.
- Depends on specialized instrumentation including shaker incubators, refractive index matching systems, and 3D reconstruction software (e.g., Imaris).
- Necessitates cross-team standardization of clearing duration, antibody validation, and imaging parameters for reproducible vascular quantification.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to non-ovarian tissues due to differences in density and lipid content.
- Limited by extended clearing timelines (up to two months) and the need for optimized antibody penetration in dense stromal regions.
