Pasif AÇIKLIĞI temizlenmiş Mouse ovarium vasküler mimarisinin üç boyutlu yeniden yapılandırma

Bu protokolün genel amacı, fare yumurtalık foliküllerindeki kılcal dağılımın tam bir üç boyutlu görünümünü sağlamak ve ilişkilerini göstermektir. Yumurtalık, üreme ve endokrinolojide önemli bir organdır. Folikülün ve somatik hücrelerin her farklı gelişim aşamasını sayın.

Ek olarak, diğer organlardan farklı olarak, yumurtalık, fonksiyonel birimin tekrarlanan dallanmasını göstermez. Lokal vasküler sistem sinir sistemi ile birlikte olabileceği gibi erişkin kadınlarda da her adet döngüsünde büyük değişiklikler geçirebilir. Yumurtalıktaki pasif berraklığı uygulamak, yumurtalıktaki bu hücreler ve foliküller arasındaki genel dağılımı ve bağlantıyı görmemizi sağlar.

Bu ölçümün en önemli özelliği, yumurtalık üzerinde en az etkiye sahip olması ve çeşitli belirteçlerin temizlenmesini açıklamasıdır. Mikroskobik görüntünün yeniden yapılandırılması yoluyla yumurtalığın bir haritasını sağladık. Damarların, nöronların ve foliküllerin bazı detayları net bir şekilde gözlemlenebilir.

Görüntü analizi için, over ve yapılar arasındaki ilişkileri değerlendirmek için Imaris'in bazı seçenekleri kullanıldı. Makale talimatına göre bolluk çözeltileri hazırlayın ve buz üzerinde tutun. Fareleri uyuşturun ve farenin ayak parmağını sıkıştırma tepkisi olmadığından emin olun.

Etanol püskürtün, sağ atriyumda bir kesi yapın, ardından kanı temizlemek için sol ventrikülü dakikada 10 ml hızında 20 ml buz gibi soğuk PBS ile anında doldurun. Daha sonra hayvanı aynı hızda soğuk hidrojel çözeltisi ile doldurun. Yumurtalık morfolojisinin bütünlüğünü korumak için yumurtalıkları ve uterusu toplayın.

Ayrılan yumurtalıkları soğuk hidrojel çözeltisine aktarın. Stereo mikroskop altında yumurtalık çevresindeki yağ dokularını çıkarın. Doku fiksasyonunun daha iyi sonuç vermesi için yumurtalık bursasının çıkarılmasını öneriyoruz.

Yumurtalıkları üç gün boyunca Hidrojel Solüsyonunda tutun. Üç gün sonra, yumurtalıkları bir cam tüpe aktarın ve tüpü taze Hidrojel Çözeltisi ile doldurun. Parafilmi tüpün üstüne gerin ve ardından tüpün boynuna başka bir parafilm sarın.

Parafilm ile Hidrojel Çözeltisi arasında kabarcık olmadığından emin olun. Cam tüpü, jel oluşana kadar iki saat boyunca 37 derece Santigratta bir çalkalayıcı inkübatöre yerleştirin. Yumurtalıkların etrafındaki fazla jeli bir kağıt filtre ile dikkatlice çıkarın.

Yumurtalıkları 15 ml'lik bir tüpe koyun ve tüpü 10 ml'lik temizleme solüsyonu ile doldurun. Tüpü en az iki ay boyunca 37 derece Santigrat derecede bir çalkalayıcı inkübatöre yerleştirin. Temizleme solüsyonunu ilk üç gün içinde her gün ve daha sonra yumurtalık temizlenene kadar haftada bir değiştirin.

Tüm immün boyama prosedürleri bir çalkalayıcı üzerinde 37 santigrat derecede yapılır. İlk olarak, yumurtalığı 24 saat boyunca PBST'de yıkayın. İkinci inkübe primer antikorda yumurtalık, iki gün boyunca PBST ile seyreltilir.

Üçüncüsü, birincil antikorları PBST tamponu ile yıkayın. Dördüncüsü, yumurtalığı iki gün boyunca PBST'de istenen ikincil antikorla inkübe edin. Beşinci olarak, ikincil antikorları PBST ile yıkayın.

Altıncı olarak, yumurtalığı RI homojenizasyonu için bir kırılma indisi eşleştirme çözeltisine aktarın. Görsel şeffaflığı kontrol edin, yumurtalık tamamen netleştiğinde görüntülenebilir. İlk önce temiz bir cam alt tabak hazırlayın.

Bir macun silindiri yapın ve at nalı şeklinde şekillendirin. Kapalı bir alan oluşturmak için dış kenarı cam sürgünün üzerine sıkıca bastırın. Macunun yüksekliği yumurtalıktan biraz daha yüksek olmalıdır.

Yumurtalığı dikkatlice merkeze doğru hareket ettirin ve montaj solüsyonu ekleyin. Bir tabağı macunun üzerine itin ve sabitlemek için iki macun parçası kullanın. Yumurtalık görüntülenmeye hazır olduğunda, görüntülemek için 16X lensli Nikon konfokal mikroskop seçilebilir.

Konfokal mikroskop ile görüntüleme için öncelikle Ni-E panelindeki lensi seçiniz. Panel alımında kanal sayısını seçin. İlk olarak, mikroskop göz mercekleri ile kontrol ederek dokuyu alanın merkezine hareket ettirmek için Eye Port sekmesini ve XY denetleyici joystick'ini kullanın.

İkinci olarak, deklanşör ışığını kapattıktan sonra, her kanal için lazer gücünü, HV'yi ve ofseti ayarlamak için canlı sekmesine tıklayın. Panelde Z Yoğunluk Düzeltmesi üst katman için alımı ayarlayın, üst kısmı tanımlamak için artı düğmesine tıklayın, lensi aşağı hareket ettirin ve dokunun altına uygun HV ve lazer gücünü ayarlayın ve en düşük katman bilgilerini ekleyin, ayarı panel ve alım ile senkronize etmek için ND'ye tıklayın. Ve edinimde, önce tarama adımlarının sayısını ayarlayın.

Z'nin sekmelerine ve büyük resme tıklayın. İkinci olarak, dokunun sınırına göre alanın boyutunu tanımlamak için büyük görüntüyü tara penceresine gidin. Üçüncüsü, tarama alanlarının boyutunu girmek ve %10 ve %50 içindeki örtüşmeyi seçmek için ND alımına geri dönünArdından Z düzeltmesini çalıştır'a tıklayın ve görüntüleme işlemini bekleyin.

İlk olarak, orijinal NIS dosyasını açmak için imagic'i kullanın. Görüntü düğmesine tıklayın, renk ve görüntüleme kanallarını seçin, ardından dosyaya tıklayın, görüntü dizilerini seçin ve bunları tiff dosyaları olarak ayrı ayrı kaydedin. İkinci olarak, tiff dosyalarından birini açmak için Imaris'i kullanın.

Düzenle düğmesine tıklayın ve geri kalanını eklemek için kanal ekle'yi seçin. İsim ve renk, ekran ayarında değiştirilebilir. Görüntü özelliklerinde doku kalınlığı da düzeltilmelidir.

Üçüncüsü, düzenle düğmesine tıklayın ve fazla kısmı kesmek için 3D'yi Kırp'ı seçin. İlk olarak, filament düğmesine tıklayın ve ileri'ye tıklayın. Dilim paneline gidin, bir izleme gemisi ve mesafesi bulun, ardından Aşma noktasına geri dönün, statik değeri girin ve ileri'ye tıklayın.

İkinci olarak, başlangıç ve ayar noktası eşiğini ayarlayın. Kamera panelinde, seçimi seçin, shift tuşuna basın ve fazla parçayı çıkarmak için noktaya tıklayın. Üçüncüsü, en yüksek eşiği seçin ve ileri'ye tıklayın.

Noktaları algılamayı seçmeyin ve bir sonrakine geçin. Düzenleme panelinde bazı fazla parçalar kaldırılabilir. Renk, renk tıklanarak düzenlenebilir.

Over vaskülatür 3D mimarisi CD31 immün boyamayı takiben araştırıldı. 3B yapı, diğer dilimler aracılığıyla dilimler tarafından veya hacim oluşturma yoluyla tamamen gözlemlenebilir. CD 31 erişkin farede foliküler vaskülatür boyamaları yapıldı.

Kılcal damarların filamentler tarafından yeniden yapılandırılması yoluyla, tek tek foliküller ve kılcal damarları arasındaki ilişkiyi gösterebiliriz. Yumurtalık, bir kadın gibi, her zaman aktif ve değiştirilebilir. Bununla birlikte, geleneksel histolojik analizin sınırlaması nedeniyle, bu tür karmaşık bileşenler arasındaki ilişkileri tanımlamak çok zordur.

Yeni geliştirilen yöntem olan pasif netlik, optik engeli aşmamıza, tüm dokuların bütünlüğünü korumamıza ve fonksiyonel ipuçlarını sağlamamıza yardımcı olabilir.