Name: Transgenik bitkiler BIBAC-GW ikili vektör kullanarak tek kopya ekleme ile oluşturma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Keşfedin, BIBAC-Gateway ikili vektör kullanarak tek kopya, bütün T-DNA eklemeli transgenik Arabidopsis bitkileri oluşturma yöntemini. Bu protokol, genetik mühendisliği çalışmalarında stabil gen ifadesi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu araştırma Hollandalı teknoloji Vakfı için bilimsel araştırma (NWO) Hollanda organizasyonun bir parçası olduğu ve hangi kısmen tarafından Ekonomik İşler Bakanlığı (OTP Grant 12385 MS) finanse edilmektedir STW (12385) tarafından desteklenmektedir.  Carol M. Hamilton (Cornell Üniversitesi, Amerika Birleşik Devletleri) pCH20, BIBAC-GW vektörel çizimler omurgası sağlamak için teşekkür ederiz.

<ol><li>Jorgensen, R. A., Cluster, P. D., English, J., Que, Q., Napoli, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chalcone+synthase+cosuppression+phenotypes+in+petunia+flowers%3A+comparison+of+sense+vs.+antisense+constructs+and+single-copy+vs.+complex+T-DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences.</a> Plant Mol Biol. 31 (5), 957-973 (1996).</li>
<li>Stam, M., et al. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1046/j.1365-313X.1997.12010063.x">Post-transcriptional silencing of chalcone synthase in Petunia by inverted transgene repeats.</a> Plant J. 12, 63-82 (1997).</li>
<li>Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N., Kooter, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position-dependent+methylation+and+transcriptional+silencing+of+transgenes+in+inverted+T-DNA+repeats%3A+implications+for+posttranscriptional+silencing+of+homologous+host+genes+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Position-dependent methylation and transcriptional silencing of transgenes in inverted T-DNA repeats: implications for posttranscriptional silencing of homologous host genes in plants.</a> Mol Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).</li>
<li>Jin, Y., Guo, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgene-induced+gene+silencing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgene-induced gene silencing in plants.</a> Methods Mol Biol. 1287, 105-117 (2015).</li>
<li>Oltmanns, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.plantphysiol.org/content/152/3/1158">Generation of Backbone-Free, Low Transgene Copy Plants by Launching T-DNA from the Agrobacterium Chromosome 1[W][OA].</a> Plant Physiol. , (2010).</li>
<li>Ye, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+production+of+single+copy+backbone-free+transgenic+plants+in+multiple+crop+species+using+binary+vectors+with+a+pRi+replication+origin+in+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced production of single copy backbone-free transgenic plants in multiple crop species using binary vectors with a pRi replication origin in Agrobacterium tumefaciens.</a> Transgenic Res. , (2011).</li>
<li>Hamilton, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+binary-BAC+system+for+plant+transformation+with+high-molecular-weight+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular-weight DNA.</a> Gene. 200 (1-2), 107-116 (1997).</li>
<li>Frary, A., Hamilton, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+and+stability+of+high+molecular+weight+DNA+transformation%3A+an+analysis+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato.</a> Transgenic Res. 10 (2), 121-132 (2001).</li>
<li>Vega, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+maize+%28Zea+mays%29+with+Cre-lox+site+specific+recombination+cassettes+in+BIBAC+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of maize (Zea mays) with Cre-lox site specific recombination cassettes in BIBAC vectors.</a> Plant Mol Biol. 66 (6), 587-598 (2008).</li>
<li>Anggoro, D. T., Tark-Dame, M., Walmsley, A., Oka, R., de Sain, M., Stam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BIBAC-GW-based+vectors+for+generating+reporter+lines+for+site-specific+genome+editing+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">BIBAC-GW-based vectors for generating reporter lines for site-specific genome editing in planta.</a> Plasmid. 89, 27-36 (2017).</li>
<li>Hamilton, C. M., Frary, A., Lewis, C., Tanksley, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transfer+of+intact+high+molecular+weight+DNA+into+plant+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9975-9979 (1996).</li>
<li>Belele, C. L., Sidorenko, L., Stam, M., Bader, R., Arteaga-Vazquez, M. A., Chandler, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+tandem+repeats+are+sufficient+for+paramutation-induced+trans-generational+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Specific tandem repeats are sufficient for paramutation-induced trans-generational silencing.</a> PLoS Genet. 9 (10), e1003773(2013).</li>
<li>Shizuya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+stable+maintenance+of+300-kilobase-pair+fragments+of+human+DNA+in+Escherichia+coli+using+an+F-factor-based+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).</li>
<li>Shi, X., Zeng, H., Xue, Y., Luo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pair+of+new+BAC+and+BIBAC+vectors+that+facilitate+BAC%2FBIBAC+library+construction+and+intact+large+genomic+DNA+insert+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">A pair of new BAC and BIBAC vectors that facilitate BAC/BIBAC library construction and intact large genomic DNA insert exchange.</a> Plant Methods. 7, 33(2011).</li>
<li>Woodman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+PCR+of+Intact+Bacteria+%28Colony+PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR).</a> Curr Protoc Microbiol. , A.3D.1-A.3D.7 (2016).</li>
<li>Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mol+Biol%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mol Biol.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 1, (2003).</li>
<li>Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+rapid+method+for+the+preparation+of+plant+genomic+DNA+for+PCR+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis.</a> Nucleic Acids Res. 19 (6), 1349(1991).</li>
<li>Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cetyltrimethyl+ammonium+bromide+%28CTAB%29+DNA+miniprep+for+plant+DNA+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) DNA miniprep for plant DNA isolation.</a> Cold Spring Harb Protoc. (3), (2009).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923 (2012).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="https://www.cshlpress.com/default.tpl?cart=1522085010728111106&fromlink=T&linkaction=full&linksortby=oop_title&--eqSKUdatarq=934">Molecular Cloning</a>. , CSH Press. (2012).</li>
<li>Sosa, J. M. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac50056a031?journalCode=ancham">Chromatography with Sephadex Gels.</a> Anal Chem. 52 (6), 910-912 (1980).</li>
<li>Depicker, A., Stachel, S., Dhaese, P., Zambryski, P., Goodman, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nopaline+synthase%3A+transcript+mapping+and+DNA+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Appl+Genet%22%5BJournal%5D)">Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence.</a> J Mol Appl Genet. 1 (6), 561-573 (1982).</li>
<li>Feng, J., Vick, B. A., Lee, M. K., Zhang, H. B., Jan, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+BAC+and+BIBAC+libraries+from+sunflower+and+identification+of+linkage+group-specific+clones+by+overgo+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Theor+Appl+Genet%22%5BJournal%5D)">Construction of BAC and BIBAC libraries from sunflower and identification of linkage group-specific clones by overgo hybridization.</a> Theor Appl Genet. 113 (1), 23-32 (2006).</li>
<li>Lee, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+plant-transformation-competent+BIBAC+library+and+genome+sequence+analysis+of+polyploid+Upland+cotton+%28Gossypium+hirsutum+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Construction of a plant-transformation-competent BIBAC library and genome sequence analysis of polyploid Upland cotton (Gossypium hirsutum L).</a> BMC Genomics. 14, 208(2013).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+insert+Thellungiella+halophila+BIBAC+library+for+genomics+and+identification+of+stress+tolerance+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A large insert Thellungiella halophila BIBAC library for genomics and identification of stress tolerance genes.</a> Plant Mol Biol. 72 (1-2), 91-99 (2010).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+BAC-+and+BIBAC-based+physical+map+of+the+soybean+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A BAC- and BIBAC-based physical map of the soybean genome.</a> Genome Res. 14 (2), 319-326 (2004).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+physical+mapping+from+large-insert+clones+by+fingerprint+analysis+with+capillary+electrophoresis%3A+a+robust+physical+map+of+Penicillium+chrysogenum%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Genome physical mapping from large-insert clones by fingerprint analysis with capillary electrophoresis: a robust physical map of Penicillium chrysogenum.</a> Nucleic Acids Res. 33 (5), e50(2005).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+physical+mapping+of+polyploids%3A+a+BIBAC+physical+map+of+cultivated+tetraploid+cotton%2C+Gossypium+hirsutum+L%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genome physical mapping of polyploids: a BIBAC physical map of cultivated tetraploid cotton, Gossypium hirsutum L.</a> PLoS One. 7 (3), e33644(2012).</li>
<li>Frary, A., Hamilton, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+and+stability+of+high+molecular+weight+DNA+transformation%3A+An+analysis+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: An analysis in tomato.</a> Transgenic Res. , (2001).</li>
<li>Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N. M., Kooter, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position-Dependent+Methylation+and+Transcriptional+Silencing+of+Transgenes+in+Inverted+T-DNA+Repeats%3A+Implications+for+Posttranscriptional+Silencing+of+Homologous+Host+Genes+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Position-Dependent Methylation and Transcriptional Silencing of Transgenes in Inverted T-DNA Repeats: Implications for Posttranscriptional Silencing of Homologous Host Genes in Plants.</a> Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).</li>
<li>Głowacka, K., Kromdijk, J., Leonelli, L., Niyogi, K. K., Clemente, T. E., Long, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+new+and+established+methods+to+determine+T-DNA+copy+number+and+homozygosity+in+transgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Environ%22%5BJournal%5D)">An evaluation of new and established methods to determine T-DNA copy number and homozygosity in transgenic plants.</a> Plant Cell Environ. 39 (4), 908-917 (2016).</li>
<li>Stefano, B., Patrizia, B., Matteo, C., Massimo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverse+PCR+and+Quantitative+PCR+as+Alternative+Methods+to+Southern+Blotting+Analysis+to+Assess+Transgene+Copy+Number+and+Characterize+the+Integration+Site+in+Transgenic+Woody+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Genet%22%5BJournal%5D)">Inverse PCR and Quantitative PCR as Alternative Methods to Southern Blotting Analysis to Assess Transgene Copy Number and Characterize the Integration Site in Transgenic Woody Plants.</a> Biochem Genet. 54 (3), 291-305 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının veya diğer çatışmaları bildirin.

Üreten transgenics bir transgene tek, bozulmamış entegrasyonlar ile kullanılan ikili vektör seçimi çok önemlidir. BIBAC aile vektörel çizimler dizileri çıkarlarının birçok bitki türü23için,24,25,26,27,28teslim etmek için kullanılmaktadır. BIBAC Vektörler, BIBAC-GW, dahil olmak üzere verim tek kopya entegrasyonlar ile yüksek v...

Transgenik bitkiler oluştururken, genellikle nesnel stabil ifade entegre transgene(s) sahip olmaktır. Bu bir transgene sağlam tek kopya entegrasyonlar tarafından sağlanabilir. Birden çok entegrasyonlar bir transgene artan ifade, aynı zamanda gen susturmak için yol açabilir. Eklenen dizileri tandem veya ters tekrarlar1,2,3,4düzenlenmiştir Eğer transgenes susturmak daha yüksektir. İkili vektörel çizimler mekikler Agrobacteriumiçinde sınırlayıcı olarak kullanılır-faiz dizileri bitki genleri içine sunmak için dönüştürme deneyler aracılı. Tümleştirmeleri bitki genom içine sayısı Agrobacterium tumefaciens5,6. ikili vektör kopya sayısına bağlıdır Birçok sık kullanılan ikili vektörel çizimler vektör yüksek Kopyala vardır ve bu nedenle yüksek ortalama transgene kopya numarası verim: 3.3-4,9 kopya Arabidopsis5.
T-DNA entegrasyonlar sayısı BIBAC7gibi veya bir T-DNA A. tumefaciens kromozom5başlatarak A. tumefaciensiçinde düşük-kopya numarası olan ikili vektörel çizimler kullanarak indirdi. Ortalama transgene entegrasyonlar bu gibi durumlarda 25,8,9,10aşağıda sayısıdır. Olması sebebiyle tek-kopya A. tumefaciens ve aynı zamanda Escherichia coli, BIBAC türevleri korumak ve yapıları 150 kb11büyüklüğünde teslim.
GW-uyumlu BIBAC vektörler10,12 genler ilgi kolay başlangıç ağ geçidi klonlama kullanarak vektör içine izin verir. Ağ Geçidi teknoloji kullanımı büyük ölçüde kolaylaştırır klonlama yordamı, ama aynı zamanda büyük düşük-kopya-sayı vektörel çizimler13,14, düşük bir DNA verim ve benzersiz kısıtlama sınırlı bir seçim gibi ile ilgili ortak sorunları üstesinden gelir 7,11klonlama için kullanılabilir bir bölge. PBIBAC-GW türevleri Glufosinate-amonyum (pBIBAC-BAR-GW) her iki direnç veya DsRed floresan tohum kat (pBIBAC-RFP-GW) seçilmek üzere bitkiler (şekil 1)10,12olarak mevcuttur. Her iki Vektörler, sefaloridin direnç gen bakteri seçim işaretçisi olarak kullanılır.
PBIBAC-GW vektörel çizimler birleştirmek: (1) kolay tasarım ve E. colive (2) sağlam tek kopya entegrasyonlar planta içinde yüksek verimlilikle genetik manipülasyon. PBIBAC-GW vektörel çizimler verim ortalama 1.7 entegrasyonlar Arabidopsis içinde tek bir taşıyan transgenik bitkiler yaklaşık yarısı üzerinde T-DNA10entegre.
Kararlı transgenes çoğu transgenics oluşturulan için zorunlu bir ifadesidir. İstikrarlı transgene ifade olduğu gibi tek kopya entegrasyonlar tarafından elde edilebilir. Transgenik bitkiler olduğu gibi tek kopya entegrasyonlar taşıyan ile çalışıyor, ancak, örneğin, amaç süreçlerinin verimliliği Kromatin tabanlı, mutagenesis, Rekombinasyon, veya onarım ve bu bağımlılık gibi çalışma için ise daha da önemli süreçleri genomik konumu ve Kromatin yapısı ekleme sitesi. Bizim ilgi için yönetmen Oligonükleotid mutagenesis (ODM) bağımlılığı yerel genomik içeriğine, eğitim için oluşturulan (Şekil 2)10bir muhabir çizgi kümesi mutagenesis muhabir gen olduğu gibi tek kopya entegrasyonlar ile oldu. Bu çizgiler kümesi kullanarak, ODM verimliliği transgenik loci rağmen oldukça benzer olarak transgene ifade düzeyleri farklı genomik yerlerde entegre arasında değişir gösterildi.

<table><tbody><tr><td>Kanamisin sülfat monohidrat</td><td>Duchefa</td><td>K0126</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin sülfat</td><td>Duchefa</td><td>G0124</td><td></td></tr><tr><td>Rifampisin</td><td>Duchefa</td><td>R0146</td><td></td></tr><tr><td>Tetrasiklin hidroklorür</td><td>Sigma</td><td>T-3383</td><td></td></tr><tr><td>DB3.1 yetkili hücreler</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>11782-018</td><td>One Shot ccdB Invitrogen veya başka herhangi bir ccdB'ye dirençli E. coli suşu ile hayatta kalma 2 T1R Yetkin Hücreler (A10460) kullanılabilir&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>DH10B yetkin hücreler</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>18290-015</td><td></td></tr><tr><td>Ağ Geçidi LR klonaz enzim karışımı&nbsp;</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>11791-019</td><td></td></tr><tr><td>tri-Sodyum sitrat dihidrat</td><td>Merck</td><td>106432</td><td></td></tr><tr><td>Trizma tabanı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodyum dihidrat</td><td>Duchefa</td><td>E0511</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Bacto tripton</td><td>BD</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Maya özü</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Honeywell Fluka</td><td>13423</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>D (+) - Glikoz monohidrat</td><td>Merck</td><td>108346</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporasyon Küvetleri, 0,1 cm boşluk</td><td>Biorad</td><td></td><td></td>1652089</tr><tr><td>Elektroporatör Gen Pulser</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat heptahidrat</td><td>Calbiochem</td><td>442613</td><td></td></tr><tr><td>D (+) - Maltoz monohidrat% 90</td> <td>Acros Organics</td><td>32991</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0138454</td><td></td></tr><tr><td>Murashige Skoog orta</td><td>Duchefa</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Glufosinat-amonyum (Basta)</td><td>Bayer</td><td>79391781</td><td></td></tr><tr><td>Kısıtlama enzimleri</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etidyum Bromür</td><td>Bio-Rad</td><td>1610433</td><td></td></tr><tr><td>Elektroforez sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Merck</td><td>106498</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>Merck</td><td>100316</td><td></td></tr><tr><td>Kurutma naylon membran Hybond N+</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15358</td><td>veya GE Healthcare Yaşam Bilimleri (RPN203B)</td></tr><tr><td>Whatman 3MM Chr kurutma kağıdı</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td>3030-931</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0181</td><td></td></tr><tr><td>Asetillenmiş BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2518</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Merck</td><td>805740</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50 Kaba</td><td>GE Sağlık Yaşam Bilimleri</td><td>17004401</td><td>veya Sephadex G-50 Orta (17004301)</td></tr> <tr><td>Dekstran sülfat sodyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat ve nbsp;</td><td>ABD Biyolojik</td><td>S5010</td><td></td></tr><tr><td>Somon Sperm DNA'sı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7656</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dihidrojen fosfat monohidrat</td><td>Merck</td><td>106346</td><td></td></tr><tr><td>Depolama Fosfor ekran ve kaset</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td>28-9564-74</td><td></td></tr><tr><td>Fosfor görüntüleyici</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td>Typhoon FLA 7000</td><td></td></tr><tr><td>UV Çapraz Bağlayıcı</td><td>Stratagene</td><td>Stratalinker 1800</td><td></td></tr><tr><td>streç film (Saran sargısı)</td> <td>Omnilabo</td><td>1090681</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>16500</td><td></td></tr><tr><td>Borik asit</td><td>Merck</td><td>100165</td><td></td></tr><tr><td>DNA işaretleyici ' Blauw'; DNA merdiveni.</td><td>MRC Hollanda</td><td>MCT8070</td><td></td></tr><tr><td>DNA işaretleyicisi ' Rood'; DNA merdiveni</td><td>MRC Hollanda</td><td>MCT8080</td><td></td></tr><tr><td>Heksannükleotid Karışımı</td><td>Roche</td><td>11277081001</td><td></td></tr><tr><td>Büyük Yapı Kiti</td><td>Qiagen</td><td>12462</td><td></td></tr><tr><td>Isıl yapışmalı polietilen boru, açık</td><td>çeşitli sağlayıcılar</td><td></td> borunun <td>genişliği, lekeleme membranınkinden daha geniş olmalıdır</td></tr><tr><td>Isı mühürleyen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membran filtre disk</td><td>Merck</td><td>VSWP02500</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Merck</td><td>105833</td><td></td></tr><tr><td>Hibridizasyon ağı</td><td>GE Sağlık Yaşam Bilimleri</td><td>RPN2519</td><td></td></tr></tbody></table>

transgenik bitkiler bibac-gw ikili vektör kullanarak tek kopya ekleme ile oluşturma

Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector

Transgenik bitkiler oluştururken, genellikle nesnel bir transgene istikrarlı ifade sahip olmaktır. Çoklu kopya entegrasyonlar kez gen susturmak için tabi olan gibi bu transgene tek, bozulmamış entegrasyonunu gerektirir. Bakteriyel yapay kromozomu (pBIBAC-GW), diğer pBIBAC türevleri gibi temel ağ geçidi uyumlu ikili vektör tek kopya transgenes ekleme ile yüksek verim sağlar. Faiz dizisi şimdi kolayca vektör transfer içine DNA (T-DNA) ağ geçidi klonlama tarafından eklenebilir böylece orijinal pBIBAC bir gelişme, bir ağ geçidi kaset pBIBAC-GW kopyalamış. Yaygın olarak, dönüşüm pBIBAC-GW ile sonuç 0,2-0,5 bir verimlilik %, mademki transgenics yarısı taşımak T-DNA'ın sağlam tek kopya tümleştirme. PBIBAC-GW vektörel çizimler Glufosinate-amonyum direnç veya DsRed floresan seçilmek üzere bitkiler tohum kat olarak ve sefaloridin direnç bakteri içinde bir seçim olarak kullanılabilir. Burada, bir dizi protokol okuyucu transgenik bitkiler pBIBAC-GW kullanarak oluşturma işlemi boyunca rehberlik sunulur: faiz dizileri tercih bir dönüşüm tesisi için pBIBAC-GW vektör içine yeniden birleştirme başlatma Agrobacterium, seçim transgenics ve bitkiler DNA kurutma kullanarak ekleme intactness ve kopya sayısı için sınama. Dikkat bir DNA blotting stratejisi tasarlama için tek ve çok kopyayı entegrasyonlar, tekli ve çoklu loci tanımak için verilir.

BIBAC-GW sistemiyle, muhabir yapıları ODM bitkilerde eğitim için oluşturulan10vardı. Yapıları içinde ağ geçidi giriş vektör pENTR-gm12 tasarlanmış ve pBIBAC-BAR-ağ geçidi LR Rekombinasyon tepkimesi kullanarak GW (şekil 1) eklenir.
Arabidopsis pDM19, BIBAC-BAR-GW plazmid translasyonel kodonu pozisyonda 120 eYFP okuma çerçevesi içinde taşıyan bir mTurquo...

PBIBAC-GW ikili vektör oluşturma transgenik bitkiler sağlam tek kopya eklemeler, kolay bir süreç ile kolaylaştırır. Burada, bir dizi protokol okuyucu transgenik Arabidopsis bitkiler üretme ve bitkiler intactness için sınama işlemi boyunca rehberlik ve ekleme sayısı kopyalamak sunulur.

Transgenik bitkiler BIBAC-GW ikili vektör kullanarak tek kopya ekleme ile oluşturma

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the ...

Bu metodolojinin genel amacı, bir transfer DNA'sının veya T-DNA'nın bozulmamış, tek kopyalı eklemelerini verimli bir şekilde taşıyan transgenik bitkiler üretmektir. BIBAC-Gateway vektörü, kararlı gen ekspresyonu gösteren ilgilenilen dizilerin sağlam, tek kopyalı eklemelerini taşıyan transgenik bitkiler üretmek için değerli bir araçtır. BIBAC-Gateway vektörü ile, ilgilenilen dizileri minimum çabayla eklemek için Gateway rekombinasyon teknolojisi kullanılabilir.BIBAC-Gateway vektörleri de dahil olmak üzere tüm BIBAC türevleri, büyük, transgenik DNA parçalarının bitki genomlarına aktarılması için uygundur. BIBAC-GW vektörleri, mısır, pirinç ve domates gibi birçok bitki sistemine ilgi dizileri eklemek için kullanılabilir. İki BIBAC-GW plazmidi mevcuttur.BIBAC-RFP-GW plazmidi, tohum kabuklarında eksprese edilen bir DsRed geni içerir. BIBAC-BAR-GW plazmidi, glufosinata direnç sağlayan bir gen içerir. Her iki vektör de bakterilerde bir seçim belirteci olarak kanamisine dirençli bir gen içerir.İlgilenilen dizileri ikili vektöre eklemek için, önce metin protokolünde açıklandığı gibi Ağ Geçidi Girişini ve ikili vektörleri hazırlayın. Bir Ağ Geçidi reaksiyonu gerçekleştirmek için, LR rekombin

generating-transgenic-plants-with-single-copy-insertions-using-bibac

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Bu videoda, Agrobacterium aracılı ikili bakteriyel yapay kromozom tabanlı gen dönüşümü yoluyla kararlı transgen ifade eden transgenik Arabidopsis bitkilerinin neslini gösteriyoruz.

Arabidopsis Bitkilerinde İkili Bakteriyel Yapay Kromozom Vektör Tabanlı Gen Dönüşümü: Tek Kopya Yerleştirme ile Transgenik Bitkiler Oluşturma Tekniği

Agroinfiltrasyon ve PVX agroinfection, bitkilerdeki genlerin geçici ektopik ekspresyonu için rutin fonksiyonel tahlillerdir. Bu yöntemler, efektoromik stratejilerde (hızlı direnç ve avirulence gen keşfi) etkili tahlillerdir ve moleküler bitki patolojisinde modern araştırmalar için çok önemlidir. Tesislerde sağlam yüksek verimli fonksiyonel analiz talebini karşılarlar.

Patates ve Nicotiana benthamiana'da Agroinfiltrasyon ve PVX Agroinfection

Bu çalışma, seçici olarak BioRad Gene Gun kullanılarak tahlil, bitkilerde hücre-altı organel hedefleyen için yeni bir yöntem tarif eder.

Gibson Meclisi ve Gen Tabancası kullanarak Tütün geçici Gen İfadesi

Gen hedefleme metodolojileri, nakavt, knock-in ve etiketli alellere sahip transgenik fareler oluşturmak için kullanılabilir.  Burada, E. coli'de, özel gen hedefleme vektörlerini hızlı bir şekilde oluşturmak için kullanılabilecek 'alt klonlama artı ekleme' olarak adlandırdığımız gelişmiş bir yeniden birleştirme yöntemini açıklıyoruz.

Alt klonlama Artı Ekleme (SPI) - Gen Hedefleme Vektörler Rapid İnşaat için Yeni Bir Yöntem Recombineering

Burada, biz çiçek daldırma yoluyla Agrobacterium aracılı bitki dönüşümü kullanarak keten dönüştürmek için bir protokol mevcut. Bu protokol için basit ve ucuzdur, ancak keten transformasyonu için mevcut veriler yöntemlere göre daha yüksek bir dönüşüm oranını verir.

Keten Çiçekli-Dip Dönüşüm ( Linum usitatissimum) Yüksek Dönüşüm Oranı ile Transgenik progeny'lerinde oluşturmak için

DNA, düzeneğini kullanarak çok CRISPR vektörleri CRISPR çok sayıda yapı yapım tek klonlama reaksiyonda paralel yapılabilir basit bir işlem vektörleri. Domates kıllı kökleri CRISPR vektörleri doğrulamak ve mutant malzemeleri üretmek için mükemmel bir model sistem.

Domates Tüylü Roots Üretimi ile yüksek verim CRISPR Vektör İnşaat ve DNA Değişiklikler Karakterizasyonu

Burada, ilk kodlama exon genlerin transkripsiyon sürücüleri ile değiştirerek Drosophila içinde doku özel ikili transkripsiyon sistemleri oluşturmak için bir yöntem mevcut. CRISPR/Cas9-tabanlı yöntemi bir transactivator sıra değiştirilen bir gen endojen Yönetmeliği altında yerleştirir ve sonuç olarak transctivator ifade sadece şekillerindeki gene özgü kronolojik zamanmekansal kolaylaştırır.

Genom düzenleyerek Drosophila içinde doku özel ikili transkripsiyon sistemleri oluşturmak için etkili bir strateji

Burada, bitki salgılanan proteinler için protein kristalizasyon büyük miktarlarda üretmek için böcek hücre ve baculovirus protein ifade sistemi kullanan iletişim kurallarını mevcut. Bir baculovirus ifade vektör GP67 ya da böcek hemolin sinyal peptid bitki protein salgılanması ifade böcek hücrelerinde ile değiştirildi.

Bitki proteinleri böcek hücrelerinde salgılanan Baculovirus ifade vektörel çizimler oluşturmak için değiştirme

Burada, biz üretimi tarif ve transgenik Arabidopsis thaliana bir dizi uygulama etkinleştirme indüklenebilir, doku özel ifade üç ana sürgen, sürgün apikal meristem, kök apikal meristem ve cambium satırları.

İndüklenebilir, hücre türüne özgü ifade Arabidopsis thaliana aracılığıyla LhGR-aracılı Trans-harekete geçirmek

Sonbahar ordu kurdunda başarılı germline dönüşümü, Spodoptera frugiperda, hiperaktif piggyBac transposase mRNA kullanılarak elde edildi.

Hiperaktif piggyBac Transposase aracılı Germline Dönüşümü Sonbahar Ordu Kurdu, Spodoptera frugiperda

Burada, sgRNA ekspresyon kasetlerinin Tol2 aracılı iletimi ile kararlı bir zpc:cas9 knock-in hattını birleştiren maternal mutant üretmek için bir protokol açıklıyoruz.

zpc:cas9 knock-in zebra balığı kullanılarak maternal mutantların üretilmesi

Keşfedin, BIBAC-Gateway ikili vektör kullanarak tek kopya, bütün T-DNA eklemeli transgenik Arabidopsis bitkileri oluşturma yöntemini. Bu protokol, genetik mühendisliği çalışmalarında stabil gen ifadesi sağlar.

Transgenik bitkiler BIBAC-GW ikili vektör kullanarak tek kopya ekleme ile oluşturma

Daha fazla video keşfet