Transgenik bitkiler BIBAC-GW ikili vektör kullanarak tek kopya ekleme ile oluşturma

Bu metodolojinin genel amacı, bir transfer DNA'sının veya T-DNA'nın bozulmamış, tek kopyalı eklemelerini verimli bir şekilde taşıyan transgenik bitkiler üretmektir. BIBAC-Gateway vektörü, kararlı gen ekspresyonu gösteren ilgilenilen dizilerin sağlam, tek kopyalı eklemelerini taşıyan transgenik bitkiler üretmek için değerli bir araçtır. BIBAC-Gateway vektörü ile, ilgilenilen dizileri minimum çabayla eklemek için Gateway rekombinasyon teknolojisi kullanılabilir.

BIBAC-Gateway vektörleri de dahil olmak üzere tüm BIBAC türevleri, büyük, transgenik DNA parçalarının bitki genomlarına aktarılması için uygundur. BIBAC-GW vektörleri, mısır, pirinç ve domates gibi birçok bitki sistemine ilgi dizileri eklemek için kullanılabilir. İki BIBAC-GW plazmidi mevcuttur.

BIBAC-RFP-GW plazmidi, tohum kabuklarında eksprese edilen bir DsRed geni içerir. BIBAC-BAR-GW plazmidi, glufosinata direnç sağlayan bir gen içerir. Her iki vektör de bakterilerde bir seçim belirteci olarak kanamisine dirençli bir gen içerir.

İlgilenilen dizileri ikili vektöre eklemek için, önce metin protokolünde açıklandığı gibi Ağ Geçidi Girişini ve ikili vektörleri hazırlayın. Bir Ağ Geçidi reaksiyonu gerçekleştirmek için, LR rekombinasyon reaksiyonunu tedarikçinin önerilerine göre oda sıcaklığında 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde hazırlayın. 100 ila 300 nanogram süper sarmal Giriş klonu ve 300 nanogram BIBAC-Ağ Geçidi vektörünü karıştırın.

Karışımın hacmini TE ile 16 mikrolitreye ayarlayın. Son olarak, dört mikrolitre LR Klonaz enzim karışımı ekleyin ve girdaplama ile karıştırın. Karışımı 25 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Karışıma iki mikrolitre Proteinaz K çözeltisi ekleyerek LR reaksiyonunu sonlandırın.

Metin protokolünde açıklandığı gibi E.coli'ye dönüşüme devam etmeden önce 37 santigrat derecede 10 dakika karıştırın ve inkübe edin. Arabidopsis bitkilerini dönüşüme hazırlamak için, Arabidopsis bitkilerini çiçek açana kadar bir serada veya iklim kontrollü büyüme odasında büyütün. Daha fazla ikincil cıvatanın ortaya çıkmasına izin vermek için ilk cıvataları klipsleyin.

Bitkiler, kırpıldıktan dört ila altı gün sonra, bitkilerin çok sayıda olgunlaşmamış çiçek başına sahip olduğu ve çok fazla döllenmiş silisiğe sahip olmadığı zaman daldırmaya hazırdır. Çiçek daldırma yapmak için, çiçek salkımını Agrobacterium süspansiyonuna beş ila 10 saniye daldırın. Hafif çalkalama kullanın.

Nem oranını yüksek tutmak için bitkilerin toprak üstü kısımlarını streç filme sarın ve bitkileri karanlıkta tutmak için bitki saksılarını bir kutu ile örtün. Bitkileri bir serada veya büyüme odasında iki gün boyunca kuluçkaya yatırın. İki gün sonra, kutuyu ve streç filmi çıkarın ve bitkileri bir serada veya yetiştirme odasında olgunlaşana kadar büyütün.

Dönüşümün verimliliğini artırmak için, aynı bitkiler ilk daldırmadan yedi gün sonra yeniden daldırılabilir. Daha sonra, dönüştürülmüş bitkiler olgunlaştığında ve kuruduğunda tohumları hasat edin. Aynı yapıyla dönüştürülen bitkilerin tohumlarını tek bir set olarak bir araya getirin ve analiz edin.

Bitkilerin bir BIBAC-RFP-Gateway plazmid türevi ile dönüştürülmesi durumunda, tohumları floresan mikroskobu kullanarak analiz ederek transgenik bitkileri tanımlayın. Tohum kabuklarındaki DsRed ekspresyonunu tespit etmek için, tohumları 560 nanometrelik bir uyarılmada ve 600 ila 650 nanometre emisyonda görüntüleyin. Floresan tohumları forseps kullanarak floresan olmayan muadillerinden ayırın.

BIBAC-BAR-Gateway plazmid türevi ile dönüştürülmüş transgenik bitkileri taramak için tohumları toprakla dolu tepsilere ekin. Tohumları 0,5x MS ortamında %0,1 agar içinde askıya alarak tohumların tepsilere eşit şekilde yayılmasını sağlayın ve tohumları bir mililitrelik bir pipet kullanarak yayın. Tohumları dört santigrat derecede en az iki gün kuluçkaya yatırarak tohumları senkronize bir şekilde çimlenmeye teşvik edin.

Bu, tohumların ekilmesinden önce veya sonra yapılabilir. Tohumların ekilmesinden iki ve üç hafta sonra, fidelere% 0.5 glufosinat-amonyum çözeltisi püskürtün. Bir metrekare başına 500 mililitre glufosinat-amonyum çözeltisi kullanın.

Hayatta kalan fideleri saksılara aktarın. Glufosinat-amonyuma dirençli bitkileri, ilgilenilen yapının varlığı için PCR ile analiz edin. Restriksiyon enzimleri kullanarak DNA lekeleme ile T-DNA entegrasyonlarının sayısını ve bütünlüklerini belirleyin.

Bu yöntem, genomdaki aynı veya farklı lokuslarda tek ve tekrarlanan entegrasyonların tanımlanmasına izin verir. Mümkün olan farklı entegrasyon modellerini belirlemek için bir dizi kısıtlama özeti kullanın. Kısıtlama bölgesinin yukarı ve aşağı akışındaki dizileri bağımsız olarak inceleyebilmek için T-DNA'nın ortasında bir kez kesen bir enzim seçin.

Ayrıca, ilgilenilen tüm diziyi bir kerede kesen bir enzim veya enzim kombinasyonu seçin. Sadece sitozin metilasyonuna duyarlı olmayan kısıtlama enzimlerini kullanmaya özen gösterin. DNA lekeleme işlemini gerçekleştirdikten sonra, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, leke analizi yapın.

Analiz, kullanılan kısıtlama stratejisine bağlıdır. T-DNA'nın ortasında bir kısıtlama bölgesi olan stratejiyi kullanarak lekeyi analiz ederken, tespit edilen parçaların sayısını sayın. Bu stratejide, hibritleştirilmiş parçaların sayısı, T-DNA entegrasyonlarının sayısını göstermektedir.

T-DNA'nın sol ve sağ tarafı için bir prob ile tespit edilen fragmanların sayısını karşılaştırın. İki prob ile farklı sayıda hibridizasyon fragmanı tespit edilirse, o zaman ya ters çevrilmiş bir tekrarda çoklu T-DNA entegrasyonları ya da tam olarak entegre edilmemiş T-DNA'lar mevcuttur. T-DNA'ların tandem ve ters çevrilmiş düzenlemelerini tanımlamak için, işaretleyici bantların boyutuna dayalı olarak leke üzerindeki hibritleyici fragmanların boyutlarını tahmin edin ve tahmini boyutları, kısıtlama stratejisine dayalı olarak hesaplanan beklenen parça boyutlarıyla karşılaştırın.

İlgilenilen transgenik dizinin sağlam olup olmadığını incelemek için, ilgilenilen dizinin uç noktalarında kısıtlama bölgeleri olan stratejiye göre hazırlanan lekeyi analiz edin. İşaretleyici bantların boyutuna bağlı olarak leke üzerindeki hibridize edici parçaların boyutunu tahmin edin ve bunu beklenen boyutla karşılaştırın. Sağlam bir yerleştirme, tanımlanmış bir uzunluğa sahip tek bir parça verir.

Beklenen uzunluktan herhangi bir sapma, eksik entegrasyonu gösterir. T-DNA entegrasyonlarının sayısını ve sağlamlığını belirlemek için DNA kısıtlama ve lekeleme stratejisi gösterilmektedir. ScaI kısıtlama bölgesi, raporlayıcı dizisini çubuk için bir prob kullanılırken algılanan sol kenarlık proksimal kısımlarına ve eYFP için bir prob kullanılırken algılanan sağ kenarlık proksimal kısımlarına böler.

BglII ve PciI kısıtlama bölgeleri, raportör yapısının dışında, T-DNA'nın içinde konumlandırılmıştır. Çift sindirim, tanımlanmış bir boyuta sahip bir parçayla sonuçlanır ve herhangi bir sapma, eksik yerleştirmeler için bir göstergedir. Tanımlanan hibridize edici fragmanların sayısı, T-DNA eklemelerinin sayısını yansıtır.

ScaI ile sindirilen dokuz transgeniğin genomik DNA'sını içeren bir leke, bar ve eYFP için problarla hibritlendi. Birkaç şerit, tek T-DNA entegrasyonlarına sahip transgenikleri gösterir. Dördüncü şerit, çubuklu iki parça ve eYFP'li bir parça görüntüler, bu da eYFP dizisinin kesildiğini veya sağ kenarlık etrafında ters çevrilmiş tekrarı gösterir.

Altıncı şerit, çubuk ve eYFP ile iki parça görüntüler. Bir parça, çubuk probu ile zayıf bir yoğunluğa sahiptir. Diğer parça, biri kesilmiş iki T-DNA eklemesini gösteren yüksek bir yoğunluğa sahiptir.

Bu videoyu izledikten sonra, Gateway rekombinasyonunu kullanarak ilgilendiğiniz DNA dizisini bir BIBAC-GW ikili vektörüne nasıl dahil edeceğinizi, ardından Arabidopsis dönüşümünü, taramayı ve T-DNA entegrasyonlarının sayısını ve bütünlüklerini değerlendirmeyi iyi bir şekilde anlamalısınız. Transgenik bitkilerin üretilmesi ve karakterize edilmesi zaman alıcıdır. BIBAC-Gateway'i ikili vektör olarak kullanırken, bozulmamış, tek kopyalı entegrasyonlara sahip transgenikleri tanımlama süreci kısaltılabilir.

BIBAC türevleri ile üretilen transgeniklerin yaklaşık yarısı sağlam, tek kopyalı entegrasyonlar taşır. Genel olarak, bireyler, ortak ikili vektörler kullanılarak üretilen birçok transgenik bitkinin, gen susturmayı gösteren bir transgen veya transgenlerin kesilmiş kopyalarını taşıdığını fark etmezler. BIBAC türevleri ile, üretilen transgenik bitkilerin çoğu, nadiren gen susturma gösteren bir transgenin sağlam, tek entegrasyonlarını taşır.

Transgenikler üretmek için BIBAC-GW kullanırken, BIBAC türevlerinin genel dönüşüm verimliliği yaygın olarak kullanılan ikili vektörlerinkinden daha düşük olduğundan, yeterli sayıda bitki materyalini dönüştürmek önemlidir. BIBAC-GW'nin dönüşüm verimliliği genellikle %0,2 ile %0,5 arasındadır Bozulmamış, tek kopyalı T-DNA entegrasyonları taşıyan transgenik bitkileri tanımladıktan sonra, gerekirse, T-DNA eklemesinin kesin genomik konumunu tanımlamak için daha fazla analiz yapılabilir. Bozulmamış, tek kopya entegrasyonlu transgenikler, transgenlerin karşılaştırılabilir ekspresyon seviyelerini gösterir.

Bu, T-DNA'nın genomdaki entegrasyon pozisyonunun, transgenin ekspresyon seviyesi üzerinde çok az etkisi olduğunu gösterir.