G2-seq: geç genom bölgelerinde çoğaltma tanımlamak için bir yüksek işlem hacmi-dayandırılmış tekniği

Hücre döngüsü evresine göre akışla ayrıştırılmış hücrelerden elde edilen DNA'nın derin sekanslanmasına yönelik bu prosedürün genel amacı, hücre döngüsünün çok geç evrelerinde replike olan genom bölgelerini belirlemektir. Bu yöntem, genomun hangi bölgelerinin DNA replikasyonunu tamamlamakta zorlandığı ve bu nedenle genomik yeniden düzenlemelere karşı özellikle savunmasız olduğu gibi, DNA replikasyonu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, deneysel açıdan çok basit olmasına rağmen, genomik replikasyon dinamiklerine dair şaşırtıcı derecede zengin bir bakış açısı sunmasıdır.

Başlamak için, sekiz mililitre YEPD içeren 15 mililitrelik test tüplerine ilgili maya hücrelerini inoküle edin. Sentetik veya zengin ortam kullanılabilir. Hücreleri, gerçek log fazı dağılımı sırasında toplayabilmek için gece boyunca en az 12 saat kültürleyin.

Kültürlerin mililitre başına beş ila 15 milyon hücre yoğunluğuna ulaştığı ertesi gün, hücreleri santrifüjleyiniz ve 1,5 mililitre %70 etanol içinde yeniden süspande ediniz. Ardından süspansiyonu 1,6 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarınız ve hücreleri oda sıcaklığında bir saat veya buz üzerinde en az üç saat inkübe ediniz. İnkübasyonun ardından, hücreleri santrifüjleyiniz ve bir mililitre sodyum sitrat içinde yeniden süspande ediniz.

Son olarak, hücreleri kısa süreliğine iki kez sonike edin. Ardından santrifüj döngüsünü tekrarlayın ve mayayı RNase içeren bir mililitre sodyum sitrat içinde yeniden süspande edin. RNase'nin maya ile 50 °C'de bir saat boyunca veya 37 °C'de gece boyunca bir ısı bloğu veya su banyosunda reaksiyona girmesini sağlayın.

RNase işleminin ardından, karışıma 50 µL proteinaz K çözeltisi ekleyin ve reaksiyonu 50 °C'de bir saat boyunca sürdürün. Ardından hücreleri çöktürün ve hücreleri 1 mL sodyum sitrat içinde yeniden süspande edin. Sonrasında hücreleri santrifüjleyin ve süpernatantı vakum kullanarak aspire edin.

Ardından, hücreleri loş ışık altında, yeşil nükleik asit boyası içeren bir mililitre sodyum sitrat içinde yeniden süspande edin. Şimdi mayayı karanlıkta, oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Devam etmek için, 530 nanometre emisyon verilerini kullanarak bir hücre ayırıcı ile hücreleri sayın.

Hücreleri DNA içeriklerine göre G1, S, erken G2 ve geç G2 hücre döngüsü evrelerine göre ayırın. Her evreden en az 1,6 milyon haploid hücre toplayın. Hücreleri ayırdıktan hemen sonra, 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı aspire edin ve pelletini saklamak üzere -20 °C'de dondurun.

Bu prosedür için en kritik adımın, hücrelerin toplandıktan hemen sonra, en geç ayıklama işleminden bir saat sonra santrifüj edilerek çöktürülmesi olduğunu tespit ettik. Bu ekstraksiyon, bir maya genomik DNA ekstraksiyon kiti temel alınarak gerçekleştirilmiştir. 120 µL sindirim tamponu ve beş µL maya litik enzimi ekleyerek başlayın.

Ardından, hücreleri bir vortex kullanarak reaksiyon karışımına karıştırın ve karışımı 37 °C'de 40 ila 60 dakika inkübe edin. Daha sonra, 120 µL lizis tamponu ekleyin ve karışımı yüksek hızda 10 ila 20 saniye boyunca vortexleyin. Son olarak, 250 µL kloroform ekleyin ve tüp içeriğini bir dakika boyunca iyice karıştırın.

Ardından, tüpü maksimum hızda iki dakika boyunca santrifüjleyin. Sonra süpernatantı DNA bağlanma kolonuna aktarın. Süpernatantı, bir dakikalık maksimum hızda santrifüj döngüsü kullanarak kolon üzerinden geçirin.

Kolon membranındaki DNA'yı yıkamak için kolonu yeni bir toplama tüpüne aktarın ve 300 µL DNA yıkama tamponu uygulayın. Ardından maksimum hızda bir dakika boyunca santrifüj işlemini tekrarlayın. Bu yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın.

DNA'yı toplamak için spin kolonu yeni bir tüpe aktarın. 60 µL su ekleyin ve bir ila üç dakika bekleyin. Ardından, elüye edilen DNA'yı içeren suyu izole etmek için kolonu maksimum hızda 10 saniye boyunca santrifüjleyin.

Şimdi, 1:200 konsantrasyonda reaktif içeren 5 ile 195 µL arasında çift zincirli DNA yüksek hassasiyetli tamponu ekleyin. Ardından, verimi hesaplamak için numunenin floresan değerini ölçün. 10 ile 50 ng arasında DNA toplamayı bekleyin.

Şimdi, DNA'yı 250 ile 350 baz çifti arasındaki fragmanlara ayırmak için sonikasyon uygulayın. Ardından, bir DNA kütüphanesi hazırlamak için standart bir kit kullanın ve en az 10 milyon 50 baz çifti tek uçlu okuma (single-end reads) ile sekanslayın. Açıklanan bu prosedür, tomurcuklanan mayadaki geç replike olan bölgeleri tanımlamak için kullanılmıştır.

Normal hücreler, bir deasetilaz proteini olan Sir2'den yoksun hücrelerle karşılaştırılmıştır. Ham veriler, çoğunlukla TY elementlerinin varlığından kaynaklanan büyük sıçramalar içeriyordu. Bu sıçramalar, okuma derinlikleri her örnek için medyan okuma derinliğinin 2,5 katı ile sınırlandırılarak kaldırılmıştır.

Sivri uçları temizlenmiş veriler daha sonra 20 kb'lık bir kayan pencere ile düzeltildi. Son olarak, veriler normalize edildi ve G1 seviyelerine oranlar olarak grafiğe aktarıldı. Tamamen replike olmamış bir hücre 0,5'te, tamamen replike olmuş bir hücre ise birde görünürdü. Kromozom yediye ait bu verilerde, Sir2 mutantında bilinen bir geç replikasyon bölgesine dair kanıtlar vardı.

Bu videoyu izledikten sonra, genomun DNA replikasyonunu en son tamamlayan ve bu nedenle geç replikasyonla ilişkili DNA kırılmaları ve diğer sorunlara karşı özellikle hassas olan bölgelerinin nasıl belirleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.