Name: G2-seq: geç genom bölgelerinde çoğaltma tanımlamak için bir yüksek işlem hacmi-dayandırılmış tekniği (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Öğrenin, hücre döngüsü fazına göre akış sitometrisi ile ayrılmış hücrelerden DNA dizilemesi yaparak geç çoğaltılan genomik bölgeleri belirlemeyi. Bu yöntem, DNA çoğaltma dinamikleri ve genomik düzenlemeler hakkında zengin bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser hibe A.B. NIH GM117446 tarafından desteklenmiştir

1. hazırlık için hücre Akış Sitometresi sıralama
<ol><li>15 mL test tüpleri kültürler 1,5 mL başına 107 hücre x 5 x 106 yoğunluğu sonra gece büyüme ulaşmak öyle ki 8 mL her YEPD suyu içeren aşılamak (bkz: tartışma Not 1).</li>
	<li>Spin aşağı 15 mL vidalı kapak santrifüj tüpü 5 min için Maya hücrelerinde (1400 x g, oda sıcaklığında veya 4 ° C), 1,5 mL % 70 etanol ve oda sıcaklığında 1 h veya buz (en az 3 h için bu oturup icar transferi bir 1.6 mL microfuge tüp hücrelerde resuspend süresiz olarak 4 ° C-ebilmek var olmak stok) (bkz: tartışma noktası (2)).</li>
	<li>Spin aşağı Maya hücrelerinde microfuge (14.000 x g, 4 ° C'de) 1 dakika, 1 mL 50 mM sodyum sitrat, pH 7.2, (14.000 x g, 4 ° C) aşağı spin için 1 dk resuspend, süpernatant Aspire edin, 1 mL 50 mM sodyum sitrat pH 7.2 resuspend , 0.25 mg/mL 1 h 50 ° C veya gecede 37 ° C ısı blok veya su banyosunda RNAse çözüm içeren.</li>
	<li>50 µL İndinavir K çözüm (20 mg/mL 10 mM Tris pH 7.5, 2 mM CaCl2, % 50 ağırlık birimi gliserol için resuspended) ekleyin ve 50 ° C'de 1 h için kuluçkaya</li>
	<li>(14. 000 x g, 4 ° C) hücreleri aşağı spin, 1 mL 50 mM sodyum sitrat, pH 7.2 hücrelerde resuspend, (14.000 x g, 4 ° C) spin, vakum süpernatant Aspire edin, 1 mL 1 µM yeşil nükleik asit zorlanma 50 mM sodyum sitrat içinde resuspended içinde resuspend , pH 7.2 ve karanlık oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya, 2 x 2 için solüsyon içeren temizleyicide s her (çıkış gücü 2 watt).</li>
</ol>2. hücre sıralama
<ol><li>Bir hücre sıralayıcısı kullanarak, her hücre döngüsü aşama olduğu gibi Resim 1 en az 1.6 milyon haploit hücreleri toplama hücreleri DNA içeriği aşamada G1, S, "erken G2" ve "geç G2", içine göre sıralamak (bkz: tartışma noktası (3)).</li>
	<li>Hücreleri microfuge tüpler için transfer ve hücreler için 14.000 x g microfuge 4 ° C'de 20 dakika aşağı spin ve süpernatant vakum ile Aspire edin (Pelet süresiz-20 ° C'de dondurulmuş depolanabilir; nokta (4) tartışma bakın).</li>
</ol>3. DNA ekstraksiyon ve kitaplıkları sıralama hazırlık
Not: Aşağıdaki adımları "protokol ben" Maya genomik DNA ekstraksiyon kiti temel alır ( Tablo malzemelerigörmek).
<ol><li>"Sindirim arabelleği," Maya litik enzim hücre duvarı ve Maya litik enzim 5 µL sindirmek, vortexing tarafından resuspend ve 40-60 dk 37 ° C'de kuluçkaya sağlar özel bir arabellek 120 µL ekleyin.</li>
	<li>"Lizis arabelleği," deterjan ve girdap için 10-20 s sabit içeren özel bir arabelleği 120 µL ekleyin.</li>
	<li>250 µL kloroform add - iyice karıştırın 1 dk için.</li>
	<li>Bir microfuge 2 min için maksimum hızda çevir.</li>
	<li>Süpernatant DNA bağlama sütun ve 1 dk. için bir microfuge maksimum hızda santrifüj üzerine yükleyin.</li>
	<li>"DNA yıkama arabelleği," etanol ve bir microfuge maksimum hızda 1 dk santrifüj içeren özel bir arabelleği 300 µL ekleyin. Aracılığıyla akış atmak, DNA yıkama arabelleği 300 µL eklemek ve yıkama işlemi yineleyin.</li>
	<li>Spin sütun bir taze microfuge tüp transferi, su (değil TE) 60 µL eklemek - 1-3 dakika bekleyin ve 10 için santrifüj kapasitesi s DNA elute.</li>
	<li>Konsantrasyon dsDNA yüksek hassasiyet arabelleği seyreltilmiş 1: 200 ve sonra sağlanan standart 10 µL için ayarı'nı kullanarak bir yer ölçü Floresans dsDNA yüksek hassasiyet reaktif 195 µL DNA'ın 5 µL ekleyerek ölçün; DNA toplam verim 10 ve 50 ng arasında bekliyoruz.</li>
	<li>Solüsyon içeren temizleyicide (Peak olay gücü 450, görev faktörü % 30, döngüleri patlama başına 200, tedavi süresi 60 s, su seviyesi 6) DNA ' 250-350 bp parçalara kırmak için.</li>
	<li>DNA örneği hazırlık seti kullanarak bir kitaplığı hazırlamak ve bu (en az 10 milyon 50 bp tek taraflı kenar okuma) DNA sıralama cihazda hızlı modda sıra (bkz: tartışma Not (5)).</li>
</ol>4. analiz veri ve çoğaltma nesil Sekanslama profilleri
<ol><li>Saccharomyces cerevisiae sacCer3 genom Gsnap12 kullanarak serileri hizalamak (tartışma Not (6) bakınız).</li>
	<li>Ücret baz çifti derinliklerinde Bedtools' "genomeCoverageBed" yazılım13kullanarak okundu öğrenmek.</li>
	<li>Artefactual sivri okuma derinliklerinde varsa kaldırın (tartışma Not (7) bakınız).</li>
	<li>Düz okumak derinlikleri kromozom 20 kayar pencere "runMean" işlevi R kullanarak KB medians kullanarak tarafından paket "caTools" (bkz: tartışma Not (8)).</li>
	<li>Arsa derinlikleri S faz, erken G2 ve geç G2 (bkz: tartışma Not (9)) tamamen çoğaltılmış okuma derinliklerinde bir yüzdesi olarak okuyun.</li>
</ol>

<ol><li>Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+origin+activation+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA replication origin activation in space and time.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).</li>
<li>Santocanale, C., Diffley, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mec1-+and+Rad53-dependent+checkpoint+controls+late-firing+origins+of+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication.</a> Nature. 395, 615-618 (1998).</li>
<li>Brewer, B. J., Fangman, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+replication+fork+barrier+at+the+3%27+end+of+yeast+ribosomal+RNA+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A replication fork barrier at the 3' end of yeast ribosomal RNA genes.</a> Cell. 55, 637-643 (1988).</li>
<li>Raghuraman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+dynamics+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication dynamics of the yeast genome.</a> Science. 294, 115-121 (2001).</li>
<li>Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+replication+timing+reveals+global+and+local+regulation+of+replication+origin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity.</a> Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).</li>
<li>Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRC1-dependent+scaling+of+the+budding+yeast+DNA+replication+timing+program%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program.</a> Genome Res. 20, 781-790 (2010).</li>
<li>Lang, G. I., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+rates+across+budding+yeast+chromosome+VI+are+correlated+with+replication+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing.</a> Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).</li>
<li>Durkin, S. G., Glover, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+fragile+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosome fragile sites.</a> Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).</li>
<li>Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+instability+at+chromosomal+fragile+sites+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer.</a> Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).</li>
<li>Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Very+late+DNA+replication+in+the+human+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Very late DNA replication in the human cell cycle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).</li>
<li>Foss, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIR2+suppresses+replication+gaps+and+genome+instability+by+balancing+replication+between+repetitive+and+unique+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).</li>
<li>Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GMAP+and+GSNAP+for+Genomic+Sequence+Alignment%3A+Enhancements+to+Speed%2C+Accuracy%2C+and+Functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality.</a> Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).</li>
<li>Langmead, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aligning+short+sequencing+reads+with+Bowtie%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Aligning short sequencing reads with Bowtie.</a> Curr Protoc Bioinformatics. , Chapter 11, Unit 11 17(2010).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li>
<li>Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proof+and+evolutionary+analysis+of+ancient+genome+duplication+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 428, 617-624 (2004).</li>
<li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coming+of+age%3A+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu teknik sağlamdır ve nispeten düz ön, özellikle dikkat için aşağıdaki ayrılmış ise:
(1) biz yoksa kültürleri istenen yoğunluk sadece 4 h aşı sonra ulaşmış sonra hasat farklılıklar hücre döngüsü dağıtımları içinde tezahür beri onlar log fazı, ulaşmadan kültürler en az 12 h için büyümek öneririz. Varsayımımız nispeten istikrarlı bir denge ulaştı bir hücre döngüsü dağıtım daha iyi doymuş bir kültür son zamanlarda taze ortamına Transfer edildiğinde hala Flux bir dağıtım daha bir "gerçek" günlük ...

Ökaryotik genom çoğaltma çoğaltma, hangi çoğaltma dışında çatal (Fragkos ve ark.içinde 20151gözden) her iki yönde devam kökenleri denilen birden çok ayrı site başlatılır. Kökenleri değişir hem kendi zamanlama ve ateş verimliliğini ve çoğaltma kaynağı etkinliğini izlemek ve bu değişim nedenleri aydınlatmak için çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Etkinlik bireysel kökenli tek iplikçikli DNA2, hangi formların etkin kökenleri, çevresinde düzeylerinden anlaşılmaktadır olabilir veya 2D Jel Elektroforez belirli çoğaltma ara ürün3izlemek için kullanarak, her ikisi ile tespit edilebilir radyoaktif sondalar. Kökeni eski belirli bilinen sıralarını sınırlı olduğu için bu tekniklerin her ikisi de daha kolay S. cerevisiae memeli hücrelerinde uygulanır. Microarrays gelişiyle, genel olarak ateş kökenli değerlendirmek mümkün oldu. Bu ilk DNA ile ağır izotoplar etiketleme, orta içeren hafif izotopların bir G1 blok hücrelerden serbest ve ağır-hafif hibrid DNA genom4arasında oluşumu izleme tarafından yapıldı. Yüksek işlem hacmi sıralama giriş benzer genom geniş izleme kökenli faaliyet pahalı izotopik etiketleme zorunluluğu olmadan izin. Hücreleri DNA içeriği göre Akış Sitometresi ve derin sıralama için tabi DNA'ları sıralanmış. Sıra kapsama 1 x 2 x S faz boyunca devam eder çünkü göreli çoğaltma zamanlaması S aşamasında G1 veya G25,6, olanlar için hücre okuma derinliği karşılaştırarak tespit edilebilir. Bu teknikler, özellikle Maya için uygulanan kaynak zamanlaması ve verimlilik nasıl DNA dizisi, Kromatin yapısı ve DNA çoğaltma proteinler düzenleyen daha derin bir anlayış için yol açtı.
Sadık iletim hücresel proliferasyonu sırasında genetik bilgi DNA ikileşmesi, kökeni yer alan yalnızca başarılı inisiyasyon, aynı zamanda başarılı bir şekilde tamamlanması, çoğaltma, çoğaltma çatal buluştuğu oluşur gerektirir. Çoğaltma başlatma gibi genom arasında bile geç Hücre döngüsünde çoğaltılmamış kalan belirli bölgelerde tamamlama çoğaltma zamanlaması göre değişir. Gibi bölgelerden özellikle etkin çoğaltma kökeni uzak olabilir veya dizileri veya DNA polimerazlar engel Kromatin yapıları içerebilir. Geç bölgeleri çoğaltma kendilerini kromozom kırılma ve yüksek mutasyon oranları ile ilişkili olan ve kanser ve yaşlanma7,8,9karıştığı kırılgan siteler olarak bildirilebilir. Ancak, uygun bakım DNA ikileşmesi genom istikrar tamamlanması önemini rağmen bizim anlayış nerede ve nasıl bu gerçekleşir kadar bu çoğaltma başlatma gecikmeli. Ve bireysel genler olan geç çoğaltma hastalığı ile ilişkili olduğu süre ile örneğin, qPCR10, yerleri elucidating ve nedenleri geç çoğaltma eksik yatan, yönetmen küresel çalışmalar incelenmiştir. Burada "Biz Akış Sitometresi ile yüksek işlem hacmi sıralama genom çoğaltmasında tamamlanması ışık içinde birleştirmek G2 seq" olarak11Maya anlamlara bir tekniğini tanımlamak. Küçük değişiklikler ile bu iletişim kuralı akışı DNA içeriği göre sıralanmış olabilir herhangi bir hücre için adapte edilebilir.

<table><tbody><tr><td>YeaStar Genomik DNA kiti</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-323</td><td></td></tr><tr><td>1 & mikro; M SYTOX Green</td><td>ThermoFisher</td><td>57020</td><td>, 50 mM sodyum sitrat, pH 7.2</td></tr><tr><td>50 mM sodyum sitrat, pH 7.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNaz çözeltisi (0.25 mg / mL)</td> içinde yeniden süspanse edilmiş <td>Sigma</td><td>R6513</td><td>0.25 mg / mL RNaseA, 50 mM sodyum sitrat, pH 7.2 içinde yeniden süspanse edilir, RNase çözeltisini yalnızca ilk kullanımdan önce 10 dakika kaynatın ve bundan sonra -20 ° C'de saklayın;</td></tr><tr><td>proteinaz K çözeltisi (20 mg / mL)</td> <td>ThermoFisher / Invitrogen</td><td>25530-015</td><td>, 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2,% 50 gliserol içinde yeniden süspansiyon, -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Model 50 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB50A220</td><td></td></tr><tr><td>BD Biosciences FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>Zymo-spin III sütunları</td><td>Zymo Research</td><td>C1005</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Test Kiti</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Florometre</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Covaris Model LE220 Odaklanmış Ultrasonikatör</td><td>Covaris</td><td>500219</td><td></td></tr><tr><td>Illumina TruSeq DNA LT Numune Hazırlama Kiti</td><td>Illumina</td><td>15026486</td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq 2500 cihazı</td><td>Illumina</td><td>SY&ndash; 401&ndash; 2501</td><td></td></tr><tr><td>Gsnap Alignment Yazılımı</td><td>Açık Kaynak Yazılım / Genentech</td><td></td><td>http://research-pub.gene.com/gmap</td></tr></tbody></table>

g2-seq: geç genom bölgelerinde çoğaltma tanımlamak için bir yüksek işlem hacmi-dayandırılmış tekniği

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

DNA ikileşmesi S aşaması hücre döngüsünün ilerlemesini takip etmek çok sayıda teknikleri geliştirilmiştir. Bu tekniklerin çoğu aydınlatma konumunun ve inisiyasyon tamamlanması yerine genom çoğaltma zamanlaması doğru yönetti. Ancak, bu bölgelerde yüksek seviyede kromozom kırılma ve mutasyon muzdarip çünkü son çoğaltma, tamamlamak üzere olan bölgeler genom kopyası anlıyoruz ve hastalık ve yaşlanma ile ilişkili olmuştur önemlidir. Burada nasıl yerine bölgelere genom kopyası son tam çoğaltma için tanımlamak için çoğaltma başlatma izlemek için kullanılan bir teknik genişletilmiş var açıklar. Bu yaklaşım Akış Sitometresi ve yüksek işlem hacmi sıralamanın kombinasyonuna dayanmaktadır. Bu rapor bu tekniği uygulamaya Maya üzerinde duruluyor olsa da, yaklaşım, bir Akış Sitometresi DNA içeriği göre sıralanan hücreler ile kullanılabilir.

Mayası geç kopyalayan siteleri belirlemek için yukarıda açıklanan yordamı kullandık. Bu yaklaşım bir bilinen geç kopyalayan bölgesi yapay bir kromozom üzerinde kullanmayı test doğru ve güvenilir olduğu için teknik kanıtladı. Sonuçlarımız de çoğaltma zamanında tamamlanması biyolojik önemi kromozom 7, biz geç çoğaltma olarak G2-seq sonuçlarımız temelinde tanımlanan, bir geç kopyalayan bölge kayıp göstererek yaklaşık göstermiştir üç kat daha sık sık--dan bir karşılaştırılabilir kontrol bölge...

Akış Sitometresi ve yüksek işlem hacmi sıralama genom kopyası geç kopyalayan bölgeleri tanımlamak için birleştirme tekniği tarif.

G2-seq: geç genom bölgelerinde çoğaltma tanımlamak için bir yüksek işlem hacmi-dayandırılmış tekniği

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Hücre döngüsü evresine göre akışla ayrıştırılmış hücrelerden elde edilen DNA'nın derin sekanslanmasına yönelik bu prosedürün genel amacı, hücre döngüsünün çok geç evrelerinde replike olan genom bölgelerini belirlemektir. Bu yöntem, genomun hangi bölgelerinin DNA replikasyonunu tamamlamakta zorlandığı ve bu nedenle genomik yeniden düzenlemelere karşı özellikle savunmasız olduğu gibi, DNA replikasyonu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, deneysel açıdan çok basit olmasına rağmen, genomik replikasyon dinamiklerine dair şaşırtıcı derecede zengin bir bakış açısı sunmasıdır.Başlamak için, sekiz mililitre YEPD içeren 15 mililitrelik test tüplerine ilgili maya hücrelerini inoküle edin. Sentetik veya zengin ortam kullanılabilir. Hücreleri, gerçek log fazı dağılımı sırasında toplayabilmek için gece boyunca en az 12 saat kültürleyin.Kültürlerin mililitre başına beş ila 15 milyon hücre yoğunluğuna ulaştığı ertesi gün, hücreleri santrifüjleyiniz ve 1,5 mililitre %70 etanol içinde yeniden süspande ediniz. Ardından süspansiyonu 1,6 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarınız ve hücreleri oda sıcaklığında bir saat veya buz üzerinde en az üç saat inkübe ediniz. İnkübasyonun ardından, hücreleri santrifüjleyiniz ve bir mililitre sodyum sitrat içinde yeniden süspande ediniz.Son olarak, hücreleri kısa süreliğine iki kez sonike edin. Ardından santrifüj döngüsünü tekrarlayın ve mayayı RNase içeren bir mililitre sodyum sitrat içinde yeniden süspande edin. RNase'nin maya ile 50 °C'de bir saat boyunca veya 37 °C'de gece boyunca bir ısı bloğu veya su banyosunda reaksiyona girmesini sağlayın.RNase işleminin ardından, karışıma 50 µL proteinaz K çözeltisi ekleyin ve reaksiyonu 50 °C'de bir saat boyunca sürdürün. Ardından hücreleri çöktürün ve hücreleri 1 mL sodyum sitrat içinde yeniden süspande edin. Sonrasında hücreleri santrifüjleyin ve süpernatantı vakum kullanarak aspire edin.Ardından, hücreleri loş ışık altında, yeşil nükleik asit boyası içeren bir mililitre sodyum sitrat içinde yeniden süspande edin. Şimdi mayayı karanlıkta, oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Devam etmek için, 530 nanometre emisyon verilerini kullanarak bir hücre ayırıcı ile hücreleri sayın.Hücreleri DNA içeriklerine göre G1, S, erken G2 ve geç G2 hücre döngüsü evrelerine göre ayırın. Her evreden en az 1,6 milyon haploid hücre toplayın. Hücreleri ayırdıktan hemen sonra, 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı aspire edin ve pelletini saklamak üzere -20 °C'de dondurun.Bu prosedür için en kritik adımın, hücrelerin toplandıktan hemen sonra, en geç ayıklama işleminden bir saat sonra santrifüj edilerek çöktürülmesi olduğunu tespit ettik. Bu ekstraksiyon, bir maya genomik DNA ekstraksiyon kiti temel alınarak gerçekleştirilmiştir. 120 µL sindirim tamponu ve beş µL maya litik enzimi ekleyerek başlayın.Ardından, hücreleri bir vortex kullanarak reaksiyon karışımına karıştırın ve karışımı 37 °C'de 40 ila 60 dakika inkübe edin. Daha sonra, 120 µL lizis tamponu ekleyin ve karışımı yüksek hızda 10 ila 20 saniye boyunca vortexleyin. Son olarak, 250 µL kloroform ekleyin ve tüp içeriğini bir dakika boyunca iyice karıştırın.Ardından, tüpü maksimum hızda iki dakika boyunca santrifüjleyin. Sonra süpernatantı DNA bağlanma kolonuna aktarın. Süpernatantı, bir dakikalık maksimum hızda santrifüj döngüsü kullanarak kolon üzerinden geçirin.Kolon membranındaki DNA'yı yıkamak için kolonu yeni bir toplama tüpüne aktarın ve 300 µL DNA yıkama tamponu uygulayın. Ardından maksimum hızda bir dakika boyunca santrifüj işlemini tekrarlayın. Bu yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın.DNA'yı toplamak için spin kolonu yeni bir tüpe aktarın. 60 µL su ekleyin ve bir ila üç dakika bekleyin. Ardından, elüye edilen DNA'yı içeren suyu izole etmek için kolonu maksimum hızda 10 saniye boyunca santrifüjleyin.Şimdi, 1:200 konsantrasyonda reaktif içeren 5 ile 195 µL arasında çift zincirli DNA yüksek hassasiyetli tamponu ekleyin. Ardından, verimi hesaplamak için numunenin floresan değerini ölçün. 10 ile 50 ng arasında DNA toplamayı bekleyin.Şimdi, DNA'yı 250 ile 350 baz çifti arasındaki fragmanlara ayırmak için sonikasyon uygulayın. Ardından, bir DNA kütüphanesi hazırlamak için standart bir kit kullanın ve en az 10 milyon 50 baz çifti tek uçlu okuma (single-end reads) ile sekanslayın. Açıklanan bu prosedür, tomurcuklanan mayadaki geç replike olan bölgeleri tanımlamak için kullanılmıştır.Normal hücreler, bir deasetilaz proteini olan Sir2'den yoksun hücrelerle karşılaştırılmıştır. Ham veriler, çoğunlukla TY elementlerinin varlığından kaynaklanan büyük sıçramalar içeriyordu. Bu sıçramalar, okuma derinlikleri her örnek için medyan okuma derinliğinin 2,5 katı ile sınırlandırılarak kaldırılmıştır.Sivri uçları temizlenmiş veriler daha sonra 20 kb'lık bir kayan pencere ile düzeltildi. Son olarak, veriler normalize edildi ve G1 seviyelerine oranlar olarak grafiğe aktarıldı. Tamamen replike olmamış bir hücre 0,5'te, tamamen replike olmuş bir hücre ise birde görünürdü. Kromozom yediye ait bu verilerde, Sir2 mutantında bilinen bir geç replikasyon bölgesine dair kanıtlar vardı.Bu videoyu izledikten sonra, genomun DNA replikasyonunu en son tamamlayan ve bu nedenle geç replikasyonla ilişkili DNA kırılmaları ve diğer sorunlara karşı özellikle hassas olan bölgelerinin nasıl belirleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

g2-seq-high-throughput-sequencing-based-technique-for-identifying

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

NGS dizilimi için gDNA zenginleştirme, yapısal mutasyonların incelenmesi için kolay ve güçlü bir araçtır. Bu makalede, DNA hasarının onarımında yer alan 11 genin tam dizisini basitçe analiz etme prosedürünü sunuyoruz.

Whole Sırasının NGS Analiz için bir transpozaz tabanlı Technology tarafından gDNA Zenginleştirme BRCA1 BRCA2 ve 9 Genler

Bisülfit amplikon dizilemesi (BSAS), hedeflenen genomik ilgi bölgelerinde sitozin metilasyonunu ölçmek için bir yöntemdir. Bu yöntem, baza özgü bir seviyede DNA metilasyonunun mutlak kantitasyonunu üretmek için yeni nesil dizilemeden önce hedef bölgelerin PCR amplifikasyonu ile eşleştirilmiş bisülfit dönüşümünü kullanır.

DNA Metilasyon Analizi nesil Dizilimine tarafından hedef

Enfekte hücrelerin genomik DNA'sından retroviral entegrasyon bölgelerini amplifiye etmek, amplifiye edilmiş virüs-konak bağlantılarını dizilemek ve daha sonra bu dizileri bir referans genoma eşlemek için bir protokol açıklıyoruz. Ayrıca, BEDTools kullanarak çeşitli genomik açıklamalara göre entegrasyon bölgelerinin dağılımını ölçmek için teknikler de açıklıyoruz.

Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

Burada, hücre izolasyonundan dizileme sonuçlarının temel analizine kadar, genom çapında memeli replikasyon zamanlamasını haritalamak için nispeten hızlı ve basit bir yaklaşımı açıklıyoruz. Protokolü takiben temsili bir replikasyon programının genomik haritası sağlanacaktır.

DNA İçerik Ölçüm tarafından Memeli Çoğaltma Zamanlama genom Tayini

Bu el yazması, aynı anda yukarı akış ve aşağı akış vektör-konakçı bağlantı DNA'sını analiz edebilen çift yönlü bir entegrasyon alanı tahlilinin deneysel prosedürünü ve yazılım analizini anlatmaktadır. Çift yönlü PCR ürünleri, herhangi bir aşağı akım sıralama platformu için kullanılabilir. Ortaya çıkan veriler, entegre DNA hedeflerinin yüksek verimli, niceliksel bir karşılaştırması için kullanışlıdır.

Çift Yönlü Retroviral Entegrasyon Sitesi PCR Metodolojisi ve Kantitatif Veri Analizi İş Akışı

Jel-seq kitaplıkları için her iki DNA - ve RNA-seq basit hidrojel aygıtı kullanarak 100-1000 hücreden başlayarak ihmal edilebilir ek maliyetle aynı anda hazırlamak araştırmacılar sağlar. Bu kağıt eşleştirilmiş kitaplıkları oluşturmak için biyolojik Protokolü yanı sıra cihazın imalatı için detaylı bir yaklaşım sunar.

Jel-seq: DNA ve RNA hidrojel matrisleri kullanarak eşzamanlı sıralama kitaplığı hazırlanması için bir yöntem

Genlerin ve onların düzenleyici elemanlarının arasındaki fiziksel etkileşimleri tanımlaması zordur ama kromozom conformation yakalama yöntemleri tarafından kolaylaştırdı. Bu değişiklik 4C-seq protokolü için PCR önyargı yanında en aza indirgemek PCR şablonları aşırı amplifikasyon azaltır ve bir ek Restriksiyon enzimi Özet adım dahil ederek okur mappability en üst düzeye çıkarır.

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

Burada, endojen RNA bağlayıcı siteleri veya RNA: protein (RNP) kompleksler "ayak izleri" mammalin hücrelerden zenginleştirmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım RNP alt paketleri iki immünoprecipitations içerir ve bu nedenle tandem RNA immünopresipitasyon dubbed (ripit).

RNA 'nın ayak Izleri tanımlaması: proteinli kompleksleri RNA Immunoprecipitation ile tandem sonra sıralamayı (RIPiT-seq)

Burada, 2 boyutlu jel elektroforezi kullanarak patojenik, yapıya eğilimli tekrarlar yoluyla replikasyon ilerlemesini analiz etme prosedürünü özetliyoruz.

SV40 Tabanlı İnsan Epizomu İçinde Yapıya Eğilimli DNA Tekrarları Yoluyla Replikasyonun Elektroforetik Analizi

Bir yüksek verimlilik, otomatik, tütün protoplast üretim ve dönüşüm metodolojisi açıklanmıştır. Robotik sistem dışı bir model ürünlere çevrilebilir olmalıdır modeli BY-2 sistemde güçlü paralel gen ifadesi ve keşif sağlar.

Yüksek verim Protoplast İzolasyonu ve Dönüşüm için Robotik Platformu

Öğrenin, hücre döngüsü fazına göre akış sitometrisi ile ayrılmış hücrelerden DNA dizilemesi yaparak geç çoğaltılan genomik bölgeleri belirlemeyi. Bu yöntem, DNA çoğaltma dinamikleri ve genomik düzenlemeler hakkında zengin bilgiler sunar.

G2-seq: geç genom bölgelerinde çoğaltma tanımlamak için bir yüksek işlem hacmi-dayandırılmış tekniği

Daha fazla video keşfet