G2-seq: geç genom bölgelerinde çoğaltma tanımlamak için bir yüksek işlem hacmi-dayandırılmış tekniği

Hücre döngüsü fazına göre akış sıralanmış hücrelerden DNA'nın derin dizilenmesi için bu prosedürün genel amacı, hücre döngüsünün son derece geç saatlerinde çoğalan genom bölgelerini tanımlamaktır. Bu yöntem, genomun hangi bölgelerinin DNA replikasyonunu tamamlamakta sorun yaşadığı ve bu nedenle genomun yeniden düzenlenmesine karşı özellikle savunmasız olduğu gibi DNA replikasyonu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, deneysel bir bakış açısından çok basit olmasına rağmen, genomik replikasyonun dinamiklerine şaşırtıcı derecede zengin bir bakış açısı sağlamasıdır.

Başlamak için, sekiz mililitre YEPD içeren 15 mililitre test tüplerini ilgilenilen maya hücreleri ile aşılayın. Sentetik veya zengin ortam kabul edilebilir. Hücreleri gerçek log faz dağılımları sırasında toplamak için en az 12 saat boyunca gece boyunca kültürleyin.

Ertesi gün, kültürler mililitre başına beş ila 15 milyon hücre yoğunluğunda olduğunda, hücreleri döndürün ve 1.5 mililitre% 70 etanol içinde yeniden süspanse edin. Daha sonra süspansiyonu 1.6 mililitrelik bir mikrofüj tüpüne aktarın ve hücrelerin oda sıcaklığında bir saat veya en az üç saat buz üzerinde inkübe etmesine izin verin. Aşılamadan sonra, hücreleri döndürün ve bir mililitre sodyum sitrat içinde yeniden süspanse edin.

Son olarak, hücreleri iki kez kısaca sonikleştirin. Daha sonra santrifüjleme döngüsünü tekrarlayın ve mayayı RNaz içeren bir mililitre sodyum sitrat içinde yeniden süspanse edin. RNase'nin maya ile 50 santigrat derecede bir saat veya gece boyunca 37 santigrat derecede bir ısı bloğunda veya bir su banyosunda reaksiyona girmesine izin verin.

RNase işleminden sonra, karışıma 50 mikrolitre proteinaz K çözeltisi ekleyin ve reaksiyona 50 santigrat derecede bir saat devam edin. Daha sonra hücreleri döndürün ve hücreleri bir mililitre sodyum sitrat içinde yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücreleri santrifüjleyin ve süpernatanı bir vakum kullanarak aspire edin.

Daha sonra loş ışıkta, hücreleri yeşil nükleik asit lekesi ile bir mililitre sodyum sitrat içinde yeniden süspanse edin. Şimdi karanlıkta mayada oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Devam etmek için, 530 nanometre emisyon verilerini kullanarak bir hücre sıralayıcı kullanarak hücreleri sayın.

Bunları DNA içeriklerine göre hücre döngüsü fazları, G1 S, erken G2 ve geç G2 olarak sıralayın. Her fazdan en az 1,6 milyon haploid hücre toplayın. Hücreleri sıraladıktan hemen sonra, 20 dakika boyunca döndürün. Süpernatanı aspire edin ve peleti saklamak için eksi 20 santigrat derecede dondurun.

Bu prosedür için en kritik adımın, hücreleri topladıktan hemen sonra, sıralamadan en fazla bir saat sonra döndürmek olduğunu bulduk. Bu ekstraksiyon, bir maya genomik DNA ekstraksiyon kitine dayanmaktadır. 120 mikrolitre sindirim tamponu ve beş mikrolitre maya litik enzimi ekleyerek başlayın.

Daha sonra hücreleri bir girdap kullanarak reaksiyon karışımına karıştırın ve karışımı 37 santigrat derecede 40 ila 60 dakika inkübe edin. Daha sonra, 120 mikrolitre lizis tamponu ekleyin ve karışımı 10 ila 20 saniye boyunca yüksek hızda girdaplayın. Daha sonra 250 mikrolitre kloroform ekleyin ve bir dakika boyunca tüp içeriğini iyice karıştırın.

Ardından, tüpü iki dakika boyunca maksimum hızda döndürün. Daha sonra süpernatanı DNA bağlama kolonuna aktarın. Bir dakikalık maksimum hızlı santrifüj döngüsü kullanarak süpernatanı kolon boyunca döndürün.

DNA'yı kolon zarında yıkamak için, kolonu yeni bir toplama tüpüne aktarın ve 300 mikrolitre DNA yıkama tamponu uygulayın. Ardından santrifüjlemeyi bir dakika boyunca maksimum hızda tekrarlayın. Bu yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın.

DNA'yı toplamak için, döndürme sütununu yeni bir tüpe aktarın. 60 mikrolitre su ekleyin ve bir ila üç dakika bekleyin. Ardından, ayrıştırılmış DNA'yı içeren suyu izole etmek için sütunu 10 saniye boyunca maksimum hızda santrifüjleyin.

Şimdi beş ila 195 mikrolitre arasında çift sarmallı DNA yüksek hassasiyetli tampon içeren bir ila 200 konsantrasyonda reaktif ekleyin. Ardından verimi hesaplamak için numunenin floresansını ölçün. 10 ila 50 nanogram DNA toplamayı bekleyin.

Şimdi DNA'yı 250 ila 350 baz çifti arasında olan parçalara ayırmak için sonikasyon kullanın. Daha sonra bir DNA kütüphanesi hazırlamak için standart bir kit kullanın ve en az 10 milyon 50 baz çifti tek uçlu okuma kullanarak dizileyin. Açıklanan prosedür, tomurcuklanan mayadaki geç çoğalma bölgelerini belirlemek için kullanıldı.

Normal hücreler, bir deasetilaz proteini olan Sir2'den yoksun olanlarla karşılaştırıldı. Ham veriler, çoğunlukla TY öğelerinin varlığı nedeniyle büyük artışlar içeriyordu. Bu ani artışlar, her numune için okuma derinlikleri medyan kırmızı derinliğin 2,5 katı ile sınırlandırılarak kaldırıldı.

Çivisi çıkarılmış veriler daha sonra 20 kb'lık bir kayan pencere ile düzleştirildi. Son olarak, veriler normalleştirildi ve G1'deki seviyelere oranlar olarak çizildi. Tamamen kopyalanmamış bir hücre 0.5'te görünür ve tamamen kopyalanmış bir hücre birde görünür. Yedinci kromozomdan elde edilen bu verilerde, Sir2 mutantında bilinen bir geç replikasyon bölgesinin kanıtı vardı.

Bu videoyu izledikten sonra, DNA replikasyonunu tamamlamak için en son olan ve bu nedenle DNA kırılmalarına ve geç replikasyonla ilişkili diğer sorunlara karşı özellikle savunmasız olan genom bölgelerini nasıl tanımlayacağınızı iyi anlamış olmalısınız.