GABA beyin dilimleri içinde uygulanması Puff tarafından indüklenen bütün hücreli akımları

Bu puf tekniğinin genel amacı, tüm hücre yama-klemp kaydında farmakolojik uygulamayı yürütmektir. Bu yöntem, farmakolojik uygulama gibi elektrofizyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kayıt bölgesi etrafındaki ilaç konsantrasyonunun hızla artması ve böylece membran reseptörlerinin duyarsızlaşmasını önlemesidir.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişi, akut prefrontal korteks diliminin hazırlanması ve puf mikropipetinin pozisyonu nispeten zor olduğu için mücadele edecektir. Bu işleme başlamak için, bir rüşvet elde etmek için donmuş kesme solüsyonunu ezin. Sulu çözeltiyi buz üzerinde tutun ve %95 oksijen, %5 karbondioksit ile köpürtün.

Daha sonra, parçalanmış kafayı buz gibi soğuk kesme solüsyonu ile doldurulmuş bir behere yerleştirin ve birkaç saniye sonra çıkarın. Kafatasını orta hat boyunca ince bir makasla kaudal-rostral yönde kesin ve yanal kafatası kısımlarını çıkarın. Daha sonra beyni ince bir spatula ile çıkarın ve buz gibi kesme solüsyonuna bırakın.

Daha sonra, beyni buzla dolu dokuz santimetrelik bir Petri kabının kapağına yerleştirin. Beyni buz gibi soğuk kesme solüsyonu ile durulayın. Ardından beyincik ve koku soğancığını jiletle kesin.

Ardından, Vibratom numune tutucusuna siyanoakrilat yapıştırıcısı uygulayın. Beyin bloğunu dikkatlice tutkal damlasına, rostral tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve hemen buz gibi soğuk kesme solüsyonuna daldırın. Bıçak tutucuyu yatay düzleme göre 15 derecelik bir açıyla ayarlayın.

Beyin dokularını 350 mikronluk koronal dilimler halinde bölümlere ayırın. Daha sonra, slaytları ACSF ile doldurulmuş geri kazanım odasına aktarın ve sürekli olarak% 95 oksijen,% 5 karbondioksit köpürterek bir saat boyunca inkübe edin. Deneyimizde, akut prefrontal korteks diliminin hazırlanması da prosedürde kritik öneme sahiptir.

Sağlıklı bir beyin dilimi, sıkıca yamalanabilen aktif nöronlar anlamına gelir. Bu prosedürde, kayıt elektrotları veya puf mikropipetleri olarak kullanılmak üzere cam borosilikat mikropipetler yapın. Elektrotları kaydetmek için uç dirençleri dört ila altı megaohm aralığındayken, puff mikropipetlerin uç çapları iki ila beş mikrometre aralığındadır.

Hızlı sodyum kanalını ve dolayısıyla aksiyon potansiyellerini bloke etmek için ACSF'ye sodyum kanal blokeri ekleyin ve bu çözeltinin kayıt odasında dakikada iki ila üç mililitre arasında sabit bir akış hızını koruyun. Dilimlerin canlılığını sağlamak için ACSF'yi sürekli olarak %95 oksijen, %5 karbondioksit ile köpürtün. İnce ucu dilimin boyutuna uyacak şekilde kesilmiş bir Pasteur pipeti kullanarak bir beyin dilimini kayıt odasına aktarın.

Ardından, platformda tutmak için dilimin üzerine bir platin dilim çapa yerleştirin. Bundan sonra, kayıt mikropipetlerini dahili çözelti ile doldurun ve puf mikropipetlerini 10 mikromolar, 50 mikromolar ve 100 mikromolar veya araç kontrolü olarak ACSF'de GABA ile doldurun. Kalıntı ile tıkanmayı önlemek için, kayıt elektrodunu ACSF'ye daldırmadan önce bir mililitrelik bir şırınga kullanarak hafif pozitif basınç uygulayın.

Mikroskop altında, kayıt elektrodunu ve puf mikropipetini, uçları monitörün ortasında görünecek şekilde konumlandırın. Ardından, bir hedef nöron belirleyin. Puf mikropipetini kademeli olarak indirirken mikroskop odağını ayarlayın ve 45 derecelik bir açıyla kayıt nöronunun üzerine yerleştirin.

Puf mikropipetinin ucu ile hedef nöron arasındaki mesafeyi 20 ila 40 mikrometre aralığında tutun. Kayıt elektrodu ile nörona yavaş ve dikkatli bir şekilde yaklaşın ve ardından pozitif basıncı serbest bırakın. Bir gigaohm contası oluşturmak için elektrot tutucusuna bağlı borudan zayıf ve kısa bir emme uygulayın.

Voltajı sıfır milivoltta tutun. Gigaohm contasının oluşumundan sonra, hızlı ve yavaş kapasitansı manuel veya otomatik olarak telafi edin. Ardından, tüm hücre moduna geçmek için borudan kısa ve güçlü bir emme uygulayın.

Daha sonra, uyarılmış IPSC akımlarını voltaj kelepçesi modunda kaydedin. Bir Master-8 voltaj adımlı jeneratör tarafından kontrol edilen puf mikropipeti aracılığıyla tek veya eşleştirilmiş GABA ponponları verin. En iyi uyarılmış IPSC akımları sonuçlarını elde etmek için puf süresini değiştirin ve LPS kaynaklı depresyon modelinde uyarılmış IPSC akımlarını ölçün.

Burada gösterilenler, 10, 50 ve 100 mikromolar GABA tarafından indüklenen örnek IPSC'lerdir. Ve işte puf süresi tepki eğrileri. GABA tarafından bir, iki veya üç saniyelik aralıklı aralıklarla 50 mikromolar ponpon da uyandırılan tekrarlayan akımlar burada gösterilmektedir.

Bir ustalaşan bu teknik, düzgün bir şekilde uygulanırsa iki saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, sağlıklı beyin dilimleri elde etmeyi unutmamak önemlidir. Geliştirildikten sonra bu teknik, farmakolojik uygulama alanındaki araştırmacıların ilacın elektrofizyolojideki etkisini keşfetmelerinin yolunu açmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, tam hücre yama-kelepçe kaydında farmakolojik uygulamanın nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. TTX ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman eldiven giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.