Name: GABA beyin dilimleri içinde uygulanması Puff tarafından indüklenen bütün hücreli akımları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Öğrenin beyin dilimlerinde GABA uygulaması için puff tekniğini. Bu yöntem, tüm hücreli yama kelepçe kayıtlarında hızlı ilaç iletimi ve reseptör desensitizasyonunu önleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar aşağıdaki kuruluşlar teşekkür etmek istiyorum: Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31171018, 31171355), bilim ve teknoloji bölümü, Guangdong (2013KJCX0054), Guangdong Eyaleti, Doğa Bilimleri Vakfı ( 2014A030313418, 2014A030313440) ve Guangzhou bilim ve teknoloji Bürosu (201607010320).

Hayvan barınma ve tüm hayvan deneyleri Etik Komitesi tarafından Ulusal Enstitüsü kurulan hayvan bakımı için yönergelere göre Güney Çin Normal Üniversitesi'nde hayvan araştırma tarafından onaylanmış prosedürler uyarınca yapılmıştır Sağlık.
 1. hazırlık çözümler <ol><li>hazırlamak 500 mL standart yapay serebrospinal Tablo 1 ' de listelenen gibi bizim eseri 7 ' açıklanan bileşenleri içeren sıvı (ACSF).
	Taze bir ACSF çözüm hazırlamak için deiyonize su ile <ol><li>kullanımı temiz cam şişeler. NaCl, KCl, NaH eklemek için kullanmadan önce kuru ve temiz spatula deiyonize su ile 2 PO 4, NaHCO 3, MgSO 4, D-glikoz ve çözüm / % 5 ile % 95'i O 2 bubbled sonra CaCl 2 ekleyin CO 2 ~ 20 dk (olarak ayrıntılı olarak açıklandığı tablo 1) 500 mL deiyonize su karışımı. Tamamen eriyene kadar karıştırın.</li>
		<li>Tamamen ACSF olduğunu emin olun herhangi bir yağış temizleyin. Sonra pH 7.2 7.4 için ayarlayın. Kabarcık % 95'i O 2 ve %5 CO 2 ~ 20 dakika süreyle oluşan bir gaz karışımı ile</li>
	</ol></li> <li>250 mL içeren Tablo 2 ' de açıklanan kimyasallar 7 dilim kesme çözeltisi hazırlamak.
	<ol><li>KCl, MgCl 2, NaH 2 PO 4, NaHCO 3, choline·Cl, D-glikoz Ekle ve CaCl 2 son 1.1.1, 250 ml deiyonize su gösterildiği gibi ekleyin ve 1.1.1 ve 1.1.2 anlatılan geçiyoruz.</li>
		Köpüren sonra % 95'i O 2 / %5 <li>CO 2, kesme çözüm olur, böylece çözüm için 15-20 dk bir dondurucu buz gibi ve kısmen donmuş yerleştirin. 
		Not: Biz ne zaman dilimleri 1-2 ay yapım bu kesme çözüm kullanın-eski fareler; formül 2 aydan daha büyük fareler için farklı olabilir.</li>
		<li>Steril endotoksin-Alerjik izotonik salin eriterek tarafından hazırlamak LPS çözüm (% 0.9 NaCl). LPS intraperitoneally yönetilen (0.5 mg/kg) ve 2 h sonra kaydını başlatmak.</li>
	</ol></li></ol> 2. Prefrontal korteks dilim hazırlanması <ol><li>kesme çözüm dondurucudan almak ve bir rüşvet almak için lunaparkçı. Çözüm buz koyun ve sürekli kabarcık / % 5 ile % 95'i O 2 CO 2.</li>
	<li>Büyük, keskin makas kullanarak, hızlı bir fare olarak açıklanan 9 başını kesmek ve hemen kafa ile dolu bir ölçek buz gibi koymak içine (0-4 ° C) kesme çözüm.</li>
	<li>Orta çizgi boyunca kafatası tepesine bir burun Kaudal yönde iyi makasla kesme ve yanal kafatası kısımları kaldırmak. Buz gibi soğuk kesme çözüm bir güzel spatula ve damla ile beyin kaldırın. 
	Not: Adım 2.2 2.3 hızla yapılmalıdır (ideal olarak &#60; 1dk).</li>
	<li>Beyin buz dolu bir 9 cm Petri kapağını yerleştirin. Buz gibi soğuk kesme çözüm beyinle durulayın. Serebellum ve olfaktör ampul bir tıraş bıçağı ile kesti.</li>
	<li>Uygula cyanoacrylate tutkal numune için sahibi bir vibratome. Dikkatle tutkal, rostral tarafı yukarı, damla üzerinde beyin blok yer ve hemen buz gibi kesme çözümde bırakın.</li>
	<li>Vibratome 15 ° yatay düzlemde referansla açısı için bıçak sahibi ayarlamak ve koronal beyin dilimleri 350 µm hazırlamak (bıçak titreşim frekansı 85 Hz, hız = 0.1 mm/s =).</li>
	<li>Bir pipet kullanarak, kurtarma odası dilimlere dolu ACSF ile transfer kuluçkaya 1 sürekli köpüren % 95'i O 2 / %5 ile h (RT) için CO 2.</li>
</ol> 3. Bütün hücre yama kayıt <ol><li>yapmak cam borosilikat MİKROPİPETLER için elektrotlar kayıt olarak kullanın veya çektirme işlemi el kitabında MİKROPİPETLER belirli esaslarına göre puf. Elektrotlar kayıt için ipucu Dirençleri aralığında 4-6 M olan &#8486;, puf MİKROPİPETLER aralığında 2-5 µm uç çapı varken.</li>
	<li>Blok hızlı Na + kanal ve böylece aksiyon potansiyelleri, ACSF Na + kanal engelleyici (TTX, 1 µM), ekleme ve Peristaltik Pompa Odası ile 2-3 mL/dk kayıt odasında bu çözümün bir sabit akış hızı sürdürmek ve bunun dışında aspirasyon. ACSF % 95'i O 2 / %5 kabarcık sürekli ve yaşayabilirliği dilimleri sağlamak için CO 2.</li>
	<li>Bir beyin dilim kimin iyi ipucu dilim boyutuna sığacak şekilde kesildi değiştirilmiş bir Pasteur pipet kullanarak kayıt odasına aktar. Dilim bir platin dilim çapa ile aralıklı paralel naylon konu ile kapak &#8805; dilimi platform üzerinde tutmak için 2 mm ayrı.</li>
	<li>Kayıt micropipette iç çözüm 7 ile (Tablo 3) doldurun ve puf MİKROPİPETLER 10 µM, 50 µM ve 100 µM (ACSF içinde çözünmüş) veya araç kontrol olarak ACSF GABA ile doldurmak.</li>
	Enkaz ile tıkanma önlemek için <li>ACSF kayıt elektrot çeker önce 1 mL şırınga kullanarak ışık pozitif basınç uygulayın. Bir micromanipulator (4 x objektif lens), mikroskop altında kullanarak kayıt elektrot ve puf micropipette ipuçları monitör ( şekil 1 A) video görüntüsündeki ortasına görünmesini sağlayacak şekilde getirin.</li>
	<li>Yavaş yavaş puf micropipette düşürürken mikroskop odak (40 x objektif lens) ayarlamak ve 45 ° açılı kayıt nöron yukarıda yerleştirin. Puf micropipette ucu ve 20-40 µm ( şekil 1 B) arasında kaydedilen nöron arasındaki mesafe tutun. Yavaş yavaş ve dikkatli bir şekilde kayıt elektrot ile nöron yaklaşım ve pozitif basınç düğmesini bırakın. Zayıf ve kısa emme giga-ohm mühür oluşturmak için elektrot tutucu bağlı boru aracılığıyla uygulamak.</li>
	<li>Koru gerilim 0, mV. Giga-ohm mühür oluşumu sonra hızlı için telafi etmek ve kapasite el ile veya otomatik olarak yavaş. Yukarıda belirtilen bütün hücreli moduna almak için boru aracılığıyla kısa ve güçlü bir emici uygulamak.</li>
	<li>Kayıt eIPSC gerilim tipi kelepçe içinde modu. Düşük gaz basıncı (azot, 4-6 PSI) tek veya eşleştirilmiş GABA puffs ( Şekil 2) sunmak için bir Master 8 gerilim adım jeneratör tarafından kontrollü bir Picospritzer kullanarak puf micropipette uygulamak.</li>
	<li>En iyi eIPSC sonuçları ( şekil 3) elde etmek ve LPS kaynaklı depresyon modeli ( şekil 4) eIPSC ölçmek için puf süresini değiştirmek.</li>
</ol>

<ol><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).</li>
<li>Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+used+for+studying+synaptic+transmission+in+slices+of+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Q+J+Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain.</a> Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).</li>
<li>Eyo, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+hyperactivity+recruits+microglial+processes+via+neuronal+NMDA+receptors+and+microglial+P2Y12+receptors+after+status+epilepticus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus.</a> J Neurosci. 34 (32), 10528-10540 (2014).</li>
<li>Dickinson, G. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+determining+the+recruitment+of+inositol+trisphosphate+receptor+channels+during+calcium+puffs%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Factors determining the recruitment of inositol trisphosphate receptor channels during calcium puffs.</a> Biophys J. 105 (11), 2474-2484 (2013).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Columnar+distribution+of+activity+dependent+gabaergic+depolarization+in+sensorimotor+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Columnar distribution of activity dependent gabaergic depolarization in sensorimotor cortical neurons.</a> Mol Brain. 5, 33(2012).</li>
<li>Glykys, J., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+main+source+of+ambient+GABA+responsible+for+tonic+inhibition+in+the+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The main source of ambient GABA responsible for tonic inhibition in the mouse hippocampus.</a> J Physiol. 582, (Pt 3) 1163-1178 (2007).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APP+modulates+KCC2+expression+and+function+in+hippocampal+GABAergic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Dunn, A. J., Swiergiel, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+interleukin-1+and+endotoxin+in+the+forced+swim+and+tail+suspension+tests+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Biochem+Behav%22%5BJournal%5D)">Effects of interleukin-1 and endotoxin in the forced swim and tail suspension tests in mice.</a> Pharmacol Biochem Behav. 81 (3), 688-693 (2005).</li>
<li>Engel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+Patch-clamp+Recordings+from+the+Somatodendritic+Domain+of+Nigral+Dopamine+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li>
<li>Wondolowski, J., Frerking, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit-dependent+postsynaptic+expression+of+kainate+receptors+on+hippocampal+interneurons+in+area+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Subunit-dependent postsynaptic expression of kainate receptors on hippocampal interneurons in area CA1.</a> J Neurosci. 29 (2), 563-574 (2009).</li>
<li>Yang, L., Wang, Z., Wang, B., Justice, N. J., Zheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+precursor+protein+regulates+Cav1.2+L-type+calcium+channel+levels+and+function+to+influence+GABAergic+short-term+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amyloid precursor protein regulates Cav1.2 L-type calcium channel levels and function to influence GABAergic short-term plasticity.</a> J Neurosci. 29 (50), 15660-15668 (2009).</li>
<li>Huo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+Cortical+GABAergic+Dysfunction+Contributes+to+Aberrant+UP-State+Duration+in+APP+Knockout+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Prefrontal Cortical GABAergic Dysfunction Contributes to Aberrant UP-State Duration in APP Knockout Mice.</a> Cereb Cortex. , (2016).</li>
<li>Zhou, W. L., Gao, X. B., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholine+Acts+through+Nicotinic+Receptors+to+Enhance+the+Firing+Rate+of+a+Subset+of+Hypocretin+Neurons+in+the+Mouse+Hypothalamus+through+Distinct+Presynaptic+and+Postsynaptic+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Acetylcholine Acts through Nicotinic Receptors to Enhance the Firing Rate of a Subset of Hypocretin Neurons in the Mouse Hypothalamus through Distinct Presynaptic and Postsynaptic Mechanisms.</a> eNeuro. 2 (1), (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Puf uygulama postsinaptik reseptör işlevi3,4,7değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır, ancak her deney da hassas doğrulukta denetim gerektirir. Biz burada GABA-puf prefrontal kortikal beyin dilimler halinde IPSCs (yani eIPSCs) indüklenen gösteren bütün hücreli yama sıkma, içeren bir açıklayınız. Kayıt elektrot dayanıklılığını yaklaşık 5 MΩ, puf MİKROPİPETLER uç çapı hakkında ise 2-5 µm. Puff arasında 4-6 psi basınçtır: daha...

Yama-klemp tekniği, nöronlar, elektrik sinyalleri soruşturma için birincil araç 1970'lerde1,2geliştirilmiştir. O nasıl spesifik tedaviler üzerinde bilgi sağlamak bu tekniği önemli bir avantajı olduğunu (örneğin, farmakolojik) nöronal işlevleri veya gerçek zamanlı3kanalları değiştirebilir. Nöronal fonksiyon farmakolojik değerlendirme bütün hücreli bir beyin dilimi kayıt sırasında kaydedilen nöronlar agonistler veya belirli reseptörlerinin antagonistleri gibi ilaçlar uygulamaya gerektirir. Bu yöntem uygulama böylece daha iyi nöronlar4fizyolojik ve patolojik özelliklerini anlamak için önde gelen özel bir ilaç takip meydana gelen nöronal değişiklikler tanımlamasını sağlar. Farmakolojik yönetim ya da perfüzyon5 veya puf6yapılabilir rağmen ikinci üstün bir tekniktir. Özellikle: (i) uygulama hızla puf artar ilaç konsantrasyonu bir seviyeye kaydedilen nöron etrafında öyle ki membran reseptörleri duyarsızlaştırma engellenir; (II) böylece bu nedenle yönetilen kimyasallar beyin dilimleri üzerinde herhangi bir istenmeyen etkileri azaltır banyo çözüm üzerinde küçük etkisi şişirilmiş uyuşturucu hacmi son derece düşüktür; (iii) puf Protokolü olabilir ayarlamak ve kaydedilmiş, deneme çok hassas tekrarlanabilir; yapma (iv) puf uygulama agonistler/antagonistleri, özellikle bu tür reaktifler pahalı veya elde etmek zor olduğu ekonomik kullanımını gösterir.
Burada, Bütün hücreli akımları GABA akut hazırlanan beyin dilimleri, nispeten iyi korunmuş beyin devreleri avantajına sahip bir hazırlık şişirme tarafından indüklenen kayıt üzerinde durulacak. Bu makalede nasıl inhibitör akımları puf kaynaklı7 kuralları açıklanacaktır. Sezyum (Cs+) kullanarak-tabanlı iç çözümler ve nöronlar 0 tutan mV, GABA-puf uyarılmış tanıtacak inhibitör postsinaptik akımları (eIPSCs) uygun teknik ayrıntılarla. Biz gösteriyor ki eIPSC lipopolysaccharide (LPS) enjeksiyon8tarafından indüklenen depresyon bir fare modeli kullanarak GABA puff tarafından uyarılmış genlik, LPS-Injected fareler araç kontrollere göre dilim içinde önemli ölçüde azalır. Bu makalede nasıl nefes tekniği yaygın olarak uygulanabilir herhangi bir kimyasal madde, bileşikleri veya uyuşturucu beyin dilimleri nöronal faaliyetleri üzerindeki etkisini değerlendirmek yönelik çalışmalar için göstermelidir bizim niyeti olduğunu.

<table><tbody><tr><td>Cam Borosilikat mikropipetler</td><td>Kepenk Aletleri</td><td>BF150-86-10</td><td>1,50 mm dış çap; 0,86 mm iç çap</td></tr><tr><td>Mikropipet</td><td>Çektirme Kepenk Aletleri</td><td>MODEL P-97&nbsp;</td><td>Alevli/Kaş Mikropipet Çektirme</td></tr><tr><td>Mikromanipülatörler</td><td>Deklanşör Aletleri</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Bilgisayar kontrollü Amplifikatör &nbsp; &nbsp;</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Dijital Toplama sistemi&nbsp;</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Görüntüleme Kamerası</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>2115001</td><td>Muayene ekipmanı</td></tr><tr><td>Mikroskopi&nbsp;</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Tutulma FN1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Usta 8</td><td>AMPI</td><td>Master-8 Nabız stimülatörü</td><td></td></tr><tr><td>Vibratom Dilimleyici</td><td>Leica</td><td>VT 1000S</td><td></td></tr><tr><td>Tıraş bıçağı</td><td>Gillette</td><td>74-S</td><td>FLYING EAGLE</td></tr><tr><td>Video monitörü</td><td>Panasonic</td><td>WV-BM 1410</td><td></td></tr><tr><td>502 Tutkal</td><td>Şarküteri</td><td>7146</td><td>Siyanoakrilat Tutkal</td></tr><tr><td>Peristaltik pompa</td><td>Şangay JIA PENG Corporation</td><td>BT100-1F</td><td></td></tr><tr><td>Video Kamera</td><td>Olympus America Medical</td><td>OLY-150</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Pipetleri</td><td>Biologix</td><td>30-0138A1</td><td></td></tr></tbody></table>

gaba beyin dilimleri içinde uygulanması puff tarafından indüklenen bütün hücreli akımları

Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices

Farmakolojik yönetim yaygın olarak bütün hücreli yama-kelepçe beyin dilimler halinde kayıt yürütmek için kullanılır. Elektrofizyolojik kayıt sırasında uyuşturucu uygulamasının en iyi yöntemlerden birini farmakolojik reaktifler beyin dilimleri nöronal faaliyetleri üzerindeki etkisini incelemek için kullanılan puf tekniğidir. Puff uygulama en büyük avantajı ilaç konsantrasyonu kayıt site çevresinde hızlı, böylece membran reseptörleri duyarsızlaştırma engelleyen artırır olmasıdır. Puff uygulama başarılı kullanımı dikkat için aşağıdaki öğeleri içerir: ilaç konsantrasyonu, puf micropipette, puf micropipette ve kaydedilen nöron ucu ve süresi arasındaki mesafe parametreleri ve puf sürüş basınç (inç kare başına pounds PSI). Bu makalede gama - aminobütirikasit (GABA) bir nöron prefrontal kortikal dilimin üzerine şişirme tarafından indüklenen bütün hücreli akımları kaydetmek için adım adım bir yordam açıklanır. Özellikle, aynı yordamı küçük değişiklikler oluşur ve striatum gibi diğer beyin bölgeleri ve hücre kültürleri gibi farklı ürünleri ile uygulanabilir.

Puff tekniği araştırmacılar uyuşturucu etkisi belirli bir neuron yüzeyinde belirli reseptörleri üzerinde çalışmaya izin verir. Bu makalede, GABA reseptörleri tarafından aracılı akımları odaklanmak. Şekil 1 üfle ve kayıt MİKROPİPETLER gösterir. Fiziksel baskı kaydedilen nöronlar üzerinde herhangi bir etkisi ortadan kaldırmak için puf, ACSF tarafından üretilen ve sukroz puffs (Şekil 2A) denetimleri kullanılır. <str...

Biz hangi tarafından farmakolojik reaktifler bütün hücreli yama-kelepçe kayıt sırasında yönetilemez duruma gelir ve başarısı için çok önemli özellikleri çeşitli yönlerini vurgulamak puf tekniğini tanımlamak.

GABA beyin dilimleri içinde uygulanması Puff tarafından indüklenen bütün hücreli akımları

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug ...

Bu puf tekniğinin genel amacı, tüm hücre yama-klemp kaydında farmakolojik uygulamayı yürütmektir. Bu yöntem, farmakolojik uygulama gibi elektrofizyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kayıt bölgesi etrafındaki ilaç konsantrasyonunun hızla artması ve böylece membran reseptörlerinin duyarsızlaşmasını önlemesidir.Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişi, akut prefrontal korteks diliminin hazırlanması ve puf mikropipetinin pozisyonu nispeten zor olduğu için mücadele edecektir. Bu işleme başlamak için, bir rüşvet elde etmek için donmuş kesme solüsyonunu ezin. Sulu çözeltiyi buz üzerinde tutun ve %95 oksijen, %5 karbondioksit ile köpürtün.Daha sonra, parçalanmış kafayı buz gibi soğuk kesme solüsyonu ile doldurulmuş bir behere yerleştirin ve birkaç saniye sonra çıkarın. Kafatasını orta hat boyunca ince bir makasla kaudal-rostral yönde kesin ve yanal kafatası kısımlarını çıkarın. Daha sonra beyni ince bir spatula ile çıkarın ve buz gibi kesme solüsyonuna bırakın.Daha sonra, beyni buzla dolu dokuz santimetrelik bir Petri kabının kapağına yerleştirin. Beyni buz gibi soğuk kesme solüsyonu ile durulayın. Ardından beyincik ve koku soğancığını jiletle kesin.Ardından, Vibratom numune tutucusuna siyanoakrilat yapıştırıcısı uygulayın. Beyin bloğunu dikkatlice tutkal damlasına, rostral tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve hemen buz gibi soğuk kesme solüsyonuna daldırın. Bıçak tutucuyu yatay düzleme göre 15 derecelik bir açıyla ayarlayın.Beyin dokularını 350 mikronluk koronal dilimler halinde bölümlere ayırın. Daha sonra, slaytları ACSF ile doldurulmuş geri kazanım odasına aktarın ve sürekli olarak% 95 oksijen,% 5 karbondioksit köpürterek bir saat boyunca inkübe edin. Deneyimizde, akut prefrontal korteks diliminin hazırlanması da prosedürde kritik öneme sahiptir.Sağlıklı bir beyin dilimi, sıkıca yamalanabilen aktif nöronlar anlamına gelir. Bu prosedürde, kayıt elektrotları veya puf mikropipetleri olarak kullanılmak üzere cam borosilikat mikropipetler yapın. Elektrotları kaydetmek için uç dirençleri dört ila altı megaohm aralığındayken, puff mikropipetlerin uç çapları iki ila beş mikrometre aralığındadır.Hızlı sodyum kanalını ve dolayısıyla aksiyon potansiyellerini bloke etmek için ACSF'ye sodyum kanal blokeri ekleyin ve bu çözeltinin kayıt odasında dakikada iki ila üç mililitre arasında sabit bir akış hızını koruyun. Dilimlerin canlılığını sağlamak için ACSF'yi sürekli olarak %95 oksijen, %5 karbondioksit ile köpürtün. İnce ucu dilimin boyutuna uyacak şekilde kesilmiş bir Pasteur pipeti kullanarak bir beyin dilimini kayıt odasına aktarın.Ardından, platformda tutmak için dilimin üzerine bir platin dilim çapa yerleştirin. Bundan sonra, kayıt mikropipetlerini dahili çözelti ile doldurun ve puf mikropipetlerini 10 mikromolar, 50 mikromolar ve 100 mikromolar veya araç kontrolü olarak ACSF'de GABA ile doldurun. Kalıntı ile tıkanmayı önlemek için, kayıt elektrodunu ACSF'ye daldırmadan önce bir mililitrelik bir şırınga kullanarak hafif pozitif basınç uygulayın.Mikroskop altında, kayıt elektrodunu ve puf mikropipetini, uçları monitörün ortasında görünecek şekilde konumlandırın. Ardından, bir hedef nöron belirleyin. Puf mikropipetini kademeli olarak indirirken mikroskop odağını ayarlayın ve 45 derecelik bir açıyla kayıt nöronunun üzerine yerleştirin.Puf mikropipetinin ucu ile hedef nöron arasındaki mesafeyi 20 ila 40 mikrometre aralığında tutun. Kayıt elektrodu ile nörona yavaş ve dikkatli bir şekilde yaklaşın ve ardından pozitif basıncı serbest bırakın. Bir gigaohm contası oluşturmak için elektrot tutucusuna bağlı borudan zayıf ve kısa bir emme uygulayın.Voltajı sıfır milivoltta tutun. Gigaohm contasının oluşumundan sonra, hızlı ve yavaş kapasitansı manuel veya otomatik olarak telafi edin. Ardından, tüm hücre moduna geçmek için borudan kısa ve güçlü bir emme uygulayın.Daha sonra, uyarılmış IPSC akımlarını voltaj kelepçesi modunda kaydedin. Bir Master-8 voltaj adımlı jeneratör tarafından kontrol edilen puf mikropipeti aracılığıyla tek veya eşleştirilmiş GABA ponponları verin. En iyi uyarılmış IPSC akımları sonuçlarını elde etmek için puf süresini değiştirin ve LPS kaynaklı depresyon modelinde uyarılmış IPSC akımlarını ölçün.Burada gösterilenler, 10, 50 ve 100 mikromolar GABA tarafından indüklenen örnek IPSC'lerdir. Ve işte puf süresi tepki eğrileri. GABA tarafından bir, iki veya üç saniyelik aralıklı aralıklarla 50 mikromolar ponpon da uyandırılan tekrarlayan akımlar burada gösterilmektedir.Bir ustalaşan bu teknik, düzgün bir şekilde uygulanırsa iki saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, sağlıklı beyin dilimleri elde etmeyi unutmamak önemlidir. Geliştirildikten sonra bu teknik, farmakolojik uygulama alanındaki araştırmacıların ilacın elektrofizyolojideki etkisini keşfetmelerinin yolunu açmıştır.Bu videoyu izledikten sonra, tam hücre yama-kelepçe kaydında farmakolojik uygulamanın nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. TTX ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman eldiven giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

whole-cell-currents-induced-puff-application-gaba-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

GABA-aktive tek kanal akımları (GABAA kanalları, GABAA reseptörleri) ve nöronlarda sinaptik üreten ve tonik akımları ölçmek için yama klemp tekniği kullanır. Sağlık ve hastalık kanalların aktivasyonu nöronal eksitabilite...

Rat Beyin Dilimleri GABA-aktive Tek kanallı ve Tonik Akımlar

Bu video, bir fare prefrontal kortikal beyin diliminde gama-aminobütirik asit veya GABA tarafından indüklenen tüm hücre akımlarının kaydını göstermektedir. GABA'nın kontrollü iletimi, postsinaptik bir nöronda klorür kanallarını açar ve inhibitör postsinaptik akımlar veya IPSC'ler üretir. Bu IPSC'ler, GABA'nın sinaptik iletim üzerindeki inhibitör aktivitesini yansıtan daha yüksek GABA konsantrasyonları ile artar.

Bir Fare Beyin Diliminde GABA Puffing ile Tüm Hücre Akımlarının Kaydedilmesi

Kortikal ağları inhibitör küçük, ama farklı kümesi tarafından kontrol edilir. Internöronlar Fonksiyonel soruşturma dolayısıyla hedeflenen kayıt ve titiz belirlenmesini gerektirir. Hücre içi etiketleme, post-hoc morfolojik ve imünositokimyasal analizler nöronu tek ya da çiftli sinaptik çiftlerinden bütün hücre kayıtları içeren bir birleşik yaklaşım aşağıda tarif edilmiştir.

Morphologically- ve nörokimyasal tanımlanan hipokampal internöronlardan gelen tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

Salınımlar temel ağ özellikleri ve hastalık ve ilaçlarla modüle edilir. Beyin dilim salınımlar incelenmesi kontrollü koşullar altında izole ağların karakterizasyonu sağlar. Protokoller CA1 γ salınımları çağrıştıran akut beyin dilimleri hazırlanması için temin edilmiştir.

Tetanik Uyarım tarafından Yerel CA1 γ Titreşim Üretimi

Bu protokol tüm hücre yama-kelepçe kayıtları gerçekleştirmek için temel usul adımları açıklar. Bu teknik nöronların elektriksel davranışının çalışma sağlar ve beyin dilimleri yapıldığında, hala nispeten iyi korunmuş beyin devreleri entegre edilmiştir nöronlardan farklı nöron işlevlerinin değerlendirilmesine olanak sağlamaktadır.

Beyin Dilimleri tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

Burada, GABAA reseptörleri, fizyoloji ve farmakoloji bağlama, aktif bileşikler keşfetmek için protokolleri mevcut.

Bir Neurotransmission roman bileşikleri bir gama - aminobütirikasit reseptör oransal keşfi için yöntemleri yazın

Akut kriz modelleri epileptiform olaylar altında yatan mekanizmaları eğitim için önemlidir. Ayrıca, epileptiform olaylar üstünde-istek oluşturma yeteneği kendi başlatma altında yatan olay tam sırası çalışmaya son derece verimli bir yöntem sağlar. Burada, fare ve insan dokusu içinde kurulan akut 4-aminopyridine kortikal nöbet modelleri açıklar.

Akut Ictal faaliyet kemirgen ve insan dokusu üretimi ve isteğe bağlı başlatma

Burada, vitro omurilik dilim nöronlarda gözlemliyorum gelatinosa (SG) yapılan bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları için gerekli adımları açıklar. Bu yöntem, içsel membran özelliklerini, sinaptik iletimi ve morfolojik belirlenmesi için SG nöronlar karakterizasyonu sağlar.

Akut omurilik dilimleri hazırlanması gözlemliyorum Gelatinosa nöronlar bütün hücreli yama-kelepçe kayıt için

Sunulan protokol, potansiyel antiepileptik maddeler için bir preklinik değerlendirme aracı olarak hayati beyin dilimleri kullanmak nihai hedefi ile rezeke insan hipokampal doku taşıma ve hazırlanması açıklar.

Elektrofizyolojik Kayıtlar için Akut İnsan Hipokampal Dilimlerinin Hazırlanması

Ex vivo beyin dilimleri, uçucu anesteziklerin afferent girdilere uyarılmış yanıtlar üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılabilir. Optogenetik, talamokortikal ve kortikokortikal afferentleri primer olmayan neokortekse bağımsız olarak aktive etmek için kullanılır ve sinaptik ve ağ yanıtları izofluran ile modüle edilir.

Beyin Dilimlerinde Afferent Yolakların Optogenetik Aktivasyonu ve Uçucu Anesteziklerle Yanıtların Modülasyonu

Bu makale, farelerde yatay hipokampal beyin dilimleri elde etmek için sistematik bir protokolü tanımlamayı amaçlamaktadır. Bu metodolojinin amacı, dentat girus ile ilgili nörolojik süreçleri değerlendirmek için perforant yol ve yosunlu lif yolu gibi hipokampal lif yollarının bütünlüğünü korumaktır.

Fare Beyninin Yatay Hipokampal Dilimleri

Öğrenin beyin dilimlerinde GABA uygulaması için puff tekniğini. Bu yöntem, tüm hücreli yama kelepçe kayıtlarında hızlı ilaç iletimi ve reseptör desensitizasyonunu önleme sağlar.

GABA beyin dilimleri içinde uygulanması Puff tarafından indüklenen bütün hücreli akımları

Daha fazla video keşfet