Burun ve bronş sıvıları emilimini: hassas örnekleme insan solunum mukoza ve laboratuvar işleme örnekleri

Bugün, mukozal astar sıvısını emmek için sentetik bir emici matris kullanan bir hassas mukozal örnekleme şekli olan nazosorpsiyon tekniğini göstereceğiz. Nazosorpsiyon örnekleyicisi, steril bir kriyotüp içinde bir tutamak ve SAM'den oluşur. SAM, elyaf veya köpük polimerlerden oluşur ve numune toplama için hızlı fitilleme ile yumuşak ve emici olacak şekilde özel olarak seçilmiştir.

SAM'ler ayrıca, emilen sekresyonların verimli bir şekilde elüsyonunu sağlamak için minimum protein bağlanmasına sahiptir. Nazosorpsiyon, bebekler de dahil olmak üzere her yaştan hastaya uygulanabilen çok nazik, noninvaziv bir tekniktir. Ek olarak, birkaç dakikada bir bile seri örnekleme mümkündür.

Nazosorpsiyon yaparken önce ellerinizi yıkamalı ve tercihen hastanın önünde eldiven giymelisiniz. İlk olarak, burun boşluğu incelenir. Bir kafa feneri kullanılmasını ve klinisyenin burun boşluğunu görselleştirmek için hastanın burnunu geri çekmek için baskın olmayan baş parmağını kullanmasını öneririz.

Nazal spekulum genellikle gerekli değildir. Burun boşluğuna bakarsanız, burunlar veya burun delikleri enine kesitte yuvarlak değildir ve düz bir şekilde geriye doğru giderler. Genellikle alt konkayı bir çıkıntı, burun deliğinin yan duvarında bir girinti olarak görürsünüz ve nazal septum pürüzsüz, düz medial duvarı oluşturur.

Altta yatan epitel solunum yollarının basit bir siliyer epiteli olduğu için bu alt konkadan örnek almak istiyoruz. Numune alırken, nazosorpsiyon SAM'ı lümenden nazikçe geçirilir ve alt konkalara karşı düz olacak şekilde yönlendirilir. Ardından SAM'ı burun mukozasına bastırmak için işaret parmağını kullanın.

Bu, MLF emilirken olası göz sulanması ile hafif bir gıdıklanmaya neden olabilir. Genellikle zamanlanmış 60 saniyelik bir absorpsiyon kullanırız. Nazosorpsiyon cihazı daha sonra burun deliğinden çıkarılır, kriyotüpe geri konur ve hemen buz üzerinde saklanabilir ve daha sonra derin dondurulabilir.

Alternatif olarak, MLF'yi hemen elüte etmeye devam edebilirsiniz. Nazosorpsiyon, çeşitli nazal mukozal zorluk modellerinde ve ayrıca farklı hava yolu hastalıklarında incelenmektedir. Bununla birlikte, bu nispeten yeni yöntem, diğer solunum örnekleme yöntemlerine karşı hala resmi doğrulama gerektirmektedir.

Bronkosorpsiyon tekniği, bronşun mukozal astar sıvısını örneklemek için sentetik bir emici matris kullanır. Yöntem, uzman personel tarafından fiberoptik bronkoskop aracılığıyla gerçekleştirilir. Bronkosorpsiyon cihazı, merkezi bir plastik kılavuz tel ile harici bir içi boş kateterden oluşur.

Bunun sonunda, el aletinin etkinleştirilmesi üzerine ekstrüde edilebilen bir SAM vardır. Nazosorpsiyon gibi, SAM şeridi de yumuşak ve emicidir ve numune toplama için hızlı fitilleme özelliğine sahiptir. Ayrıca, emilen salgıların verimli bir şekilde elüsyonuna izin vermek için minimum protein bağlanmasına sahiptir.

Bronkosorpsiyon cihazını bronkoskoptan aşağı yerleştirmeden önce, SAM'ın ekstrüde olup olmadığını ve katetere kolaylıkla geri çekildiğini kontrol etmek olağandır. Şimdi bir bronkoskopi simülatörü kullanarak bronkosorpsiyon yöntemini göstereceğiz. İlk olarak, bronkoskopu trakeadan geçirerek sağ ana bronşa ve sağ alt ve sağ orta lobların bölünmesinin hemen proksimalindeki bronş intermedius seviyesine geçiren standart bir bronkoskopi yapılır.

Bu seviyeye yerleştirildikten sonra beş adım izlenir. Bir, kateter aşağı. Bronkosorpsiyon kateterini, bronkoskopun ucunun ucuna en fazla bir santimetre distal olacak şekilde hava yolunda beyaz uç görünene kadar bronkoskopun çalışma kanalından geçirin.

Bronkoskop ve kateter ucunu hava yolunun lümeninin merkezinde tutun. Mukozal hasar riskini azaltmak için kateter ucu ile bronş mukozası arasındaki teması en aza indirmeye dikkat edin. İki, SAM dışarı.

Bronkosorpsiyon cihazının tutamağına bastırın, böylece SAM şeridi sağ orta veya sağ alt lob hava yolunun lümenine ekstrüde edilir. Doğrudan görüş altında, SAM'ın hava yolu duvarındaki mukozal astar sıvısı ile temas ettiğinden emin olmak için bronkoskopun ucunu bükün. SAM şeridini hava yolu içinde, zamanlanmış 30 saniye boyunca mukozal duvara düz bir şekilde bırakın.

Üç, SAM içeride. Doğrudan görüş altında, SAM'ı doğrudan katetere geri çekin. Geri çekerken, nemli SAM probunun düz olduğundan emin olun.

Gerekirse, SAM'ı düzeltmek için kateter ve bronkoskop ucu geri getirilebilir. SAM'ın geri çekilmesinde zorluk varsa, SAM ekstrüde edilmiş tüm cihazı hava yolundan geri çekin. Dört, kateter yukarı.

Tüm kateteri bronkoskopun çalışma kanalından çekin. Beş, SAM'ı kesin. SAM steril makasla kesilir, bir kriyotüpe konur ve derin dondurulmadan veya doğrudan ayrıştırılmadan önce hemen buzun üzerine yerleştirilmelidir.

Aşağıdaki video klip, bir araştırma bronkoskopisi geçiren bir hastanın hava yoluna bir SAM'ın ekstrüzyonunu göstermektedir. Bronkosorpsiyon şu anda çeşitli farklı akciğer hastalıklarında incelenmektedir. Bu hassas mukozal örnekleme yönteminin tanısal çalışma ve hasta tabakalaşması ve izlenmesinde yararlı olacağını umuyoruz.

Nazosorpsiyon ve bronkosorpsiyon sonrası laboratuvar işlemleri. Sentetik Emici Matristen Mukozal Astar Sıvısının Elüsyonu. Bugün, nazosorpsiyon ve bronkosorpsiyon gibi noninvaziv mukozal örnekleme tekniklerinden sonra laboratuvar numunesi işlemenin genel prensiplerini göstereceğiz.

Özellikle, mukozal astar sıvısı örneğini sentetik emici matristen nasıl ayrıştırdığımızı göstereceğiz. Toplama noktasında numuneler laboratuvara taşınmak üzere buz üzerine yerleştirilmelidir. Numuneler hemen işlenebilir veya daha sonraki bir tarihte elüsyon için orijinal numune tüpünde doğrudan derin dondurucuya yerleştirilebilir.

Acil işlem yapılıyorsa, numune buz üzerinde orijinal numune tüpünde laboratuvara aktarılabilir. Veya SAM ayrılabilir ve toplama noktasında elüsyon tamponuna yerleştirilebilir ve daha sonra buz üzerinde laboratuvara aktarılabilir. Numuneler, işlenmeden önce birkaç saat boyunca tampon içinde veya numune tüpü içinde buz üzerinde kalabilir.

SAM'ın santrifüjleme ve spin elüsyonundan önce bir yıkama adımı, numune verimini optimize etmeyi amaçlar. Bunu başarmak için SAM, istenen ekstraksiyon böceği ile birlikte bir Eppendorf tüpüne yerleştirilir. Numune daha sonra gevşek bir şekilde bağlanmış sıvıların ve biyomoleküllerin SAM'ını yıkamak için bir vorteks karıştırıcı üzerinde 30 saniye karıştırılır.

Tam numune geri kazanımını sağlamak için, daha sonra nemli SAM, yıkama için kullanılan aynı Eppendorf tüpünün içindeki bir spin ekine eklenerek spin elüsyonu gerçekleştirilir. Bu prosedür için temiz forseps kullanılmalı ve kontaminasyonu önlemek için numuneler arasında değiştirilmelidir. Bu yöntem, sıvıyı SAM'den çıkarmak için santrifüjleme kullanır.

Numuneleri dört santigrat dereceye kadar soğutulmuş bir santrifüjde 16.000 g'da 20 dakika santrifüj ediyoruz. Kullanılan elüsyon hatası, istenen uygulama tarafından belirlenecektir. Genellikle protein içeren amino tahlil tamponu veya RNA lizis tamponu kullanırız.

İki tip sıkma filtresi kullanılabilir. Birincisi, yalnızca SAM'ı yerinde tutan ve sıvıların tam olarak elüsyonuna izin veren plastik bir ağ içerir. Alternatif olarak, bulaşıcı malzemelerle çalışılıyorsa, 0,2 mikrometre gözenek boyutuna sahip spin filtreleri kullanılabilir.

Bu filtreler, enfekte olmuş numuneleri dekontamine eder ve mikrobakteriyel enfeksiyon şüphesi olan numuneler için uygundur. Bu tür filtreler gerekiyorsa, numunenin eklenmesinden önce proteinli tamponun filtreden geçmesine izin verilen bir ön inkübasyon adımının dahil edilmesi önemlidir. Bu adım, spesifik olmayan protein absorpsiyonu ile aracıların filtreye bağlanmasını en aza indirir.

Aşağıda, ikinci sınıf patojenler de dahil olmak üzere, dekontaminasyon adımı gerektirmeyen numunelerin nazosorpsiyon ve bronkosorpsiyon işlemleri için laboratuvarımız tarafından kullanılan örnek bir yöntem yer almaktadır. Birinci adımda, SAM, 30 saniye boyunca uygun tampon ve girdap içeren bir Eppendorf'a yerleştirilir. Nazosorpsiyon için tipik olarak 300 mikrolitre tampon ve bronkosorpsiyon için 100 mikrolitre kullanırız.

İkinci adımda, SAM forseps kullanılarak çıkarılır ve SAM'ı yıkamak için kullanılan tamponla birlikte plastik bir ağ filtre kabına yerleştirilir. Üçüncü adımda, SAM'ı içeren plastik ağ filtre kabı orijinal Eppendorf'a geri gönderilir. Dördüncü adım, filtre kabı, tampon ve SAM içeren Eppendorf, dört santigrat derecede 16.000 g'da 20 dakika santrifüjlenir.

Santrifüjlemeyi takiben, SAM içeren filtre kabı çıkarılır ve atılır. Elute daha sonra analiz edilmek üzere serbest bırakılabilir ve derin dondurulabilir. Nazosorpsiyon örneklemesi bir dizi klinik solunum araştırma ortamına uygulanmıştır.

Bu, prostaglandin D2 ve interlökin 5 gibi nazal alerjen mücadelesi sırasında inflamatuar mediatörlerin ölçümlerini içerir. Bu meydan okuma modeli ayarlarında daha da önemlisi, nazosorpsiyonla örnekleme, örneklemenin birkaç dakikada bir tekrarlanabildiği aracı seviyelerinin sık sık kinetik profilinin çıkarılmasına izin verir. Nazosorpsiyon, sağlıklı deneklerde ve alerjik astımlılarda rinovirüs enfeksiyonu sorunu sırasında da kullanılmıştır ve nazosorpsiyon, çalışma süresi boyunca günlük olarak tekrarlanmıştır.

Çalışmada nazosorpsiyon kullanılması, rinovirüs enfeksiyonuna interferon yanıtlarının hassas karakterizasyonuna izin verdi. Son olarak, bronşiolitli bebekleri incelemek için nazosorpsiyon örneklemesini kullandık. Bu çalışmada, respiratuar sinsityal virüs enfeksiyonu, interferon gama gibi daha yüksek seviyelerde inflamatuar mediatörler ile ilişkilendirilmiştir.

Daha da önemlisi, nazosorpsiyon ile örnekleme, bebeklerde yapılan çalışmalara sağlıklı bir kontrol grubunun dahil edilmesine olanak sağlar. Bronkosorpsiyon, sağlıklı deneklerde ve alerjik astımlılarda rinovirüs meydan okuma çalışmasında da kullanılmıştır. Bu çalışma, rinovirüs enfeksiyonu sırasında alt solunum yolunda inflamatuar mediatörler interferon gama, ITAC, IL-10 ve IL-5'te önemli artışlar göstermiştir.

Bu tekniğin alt solunum yolu çalışmalarına dahil edilmesi, bronkoalveoler lavaj gibi geleneksel yöntemlerle tespit edilemeyen mediatör seviyelerinin ölçülmesi olasılığını yaratır. Sonuç olarak, mukozal astar sıvısı noninvaziv olarak elde edilebilir ve enfeksiyon ve inflamasyonda inflamatuar yanıtları ölçmek için heyecan verici bir potansiyele sahiptir. Elüsyon yöntemlerinin, numunelerin doğasına ve ölçülecek parametrelere göre uyarlanması gerekir.

Özellikle, MLF, mukozal sitokinleri ve kemokinleri, viral enfeksiyonları, viral yükü, bakteri ve mantar enfeksiyonlarını ve mikrobiyom ve mukozal antikorları ölçmek için kullanılabilir. Son olarak, mukozal örnekleme ve elüsyon yöntemleri, bireysel projeler için özel geliştirme ve dikkatli doğrulama gerektirecektir.