Name: Makrofaj hücre dışı tuzaklar Confocal mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Öğrenin, konfokal mikroskopi ile makrofaj hücre dışı tuzaklarının görüntülenmesini. Bu yöntem, akciğer örneklerinde enfeksiyon yanıtlarını ve inflamatuar süreçleri incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser hibe Monash Üniversitesi, Ulusal Sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi ve Monash akciğer ve uyku Enstitüsü tarafından finanse edildi. Yazarlar Imaging confocal mikroskobu ile Klinik İmmünoloji Monash sağlık, Judy Callaghan, Alex Fulcher, Kirstin Elgass ve Camden Lo, Monash mikro Imaging (MMI) personel yardım için teşekkür etmek istiyorum ve yazarlar MMI İmkanları kabul Monash Üniversitesi. Yazarlar imkanları ve Monash Histoloji platformu bilimsel ve teknik yardım kabul edersiniz.

yılında deneyler bu iletişim kuralı izler: (1) insanlar tarafından Etik Komitesi, Monash Tıp Merkezi ve Melbourne Üniversitesi Etik Komitesi hayvanlar (2).
 1. Bronchoalveolar lavaj (BAL) makrofajlar <ol><li>Kullanım akciğer makrofajlar edinmek için BAL: (1) insan denekleri Bronkoskopi 6 ve (2) fareler tarafından içi trakeal aspirasyon kullanarak 13 . 
	Not: Makrofajlar edinimi genellikle bazı etkinleştirme bu hücrelerinin neden olur. Makrofajlar potansiyel bir tıbbi sorunu araştırmak için Bronkoskopi gerektirir hastalardan elde edilen ve tüm konular (bunun için tek tek her proje belirlenecek gerekir) METs çözümlenmesi için uygun olabilir.
	<ol><li>BAL çözüm ve (10 min için 500 x g) aşağı spin için bir Pelet biçiminde, iki kez kültür orta (Roswell Park Memorial Enstitüsü orta (RPMI) ile % 5 fetal buzağı serum ve % 1'l-glutamin) oda sıcaklığında yıkayın ve hücre kültür medi 4 ml seyreltik Um.</li>
		<li>Gerekirse, istek resmi bir fark sayısı; hücrelerin çoğu (genellikle &#62; % 80) makrofajlar 6 olacak. 
		Not: Bu genellikle farklı hücre türleri 6 morfolojik görünümünü kullanarak bir klinik Histoloji hizmeti tarafından gerçekleştirilecek.</li>
		<li>Gerçekleştir uygun makrofaj hücre saymak Trypan mavi dışlama ve bir hemasitometre kullanarak BAL çözüm. 
		Not: BAL çözüm insan ve fare 1.1 adımda belirtildiği gibi elde edilir.</li>
		<li>Ekle 1-4 x 10 5 makrofajlar kültür orta iyi ve bırakın başına 500 µL coverslips 24-şey plakaları için 37 ° C'de gecede; hücreleri coverslips için uygun olacaktır. İnsan örnekleri için antibiyotik ekleyin (örneğin, penisilin ve streptomisin, 10 4 U/mL) bakteriyel kontaminasyonu önlemek için.</li>
	</ol></li></ol> 2. Ayirt etiketleme/mikroskobu BAL makrofajlar, Not: yukarıda da belirtildiği gibi hücreleri coverslips yapıştırılır.
<ol><li>Kültür orta kaldırmak ve fosfat tamponlu tuz (PBS) bir kez hücrelerle yıkayın. % 2 paraformaldehyde/periodate/lizin (PIP) sabitleştirici 10 dakika süreyle hücreleri tamir</li>
	<li>Yıkama PBS kısaca hücrelerde ve %0,2 permeabilize ara 20 dakika sonra 20 dakika süreyle PBS</li>
	<li>Blok hücreleri % 10 tavuk sera içinde %5 sığır serum PBS için 30 dk içinde seyreltilmiş albumin (BSA) ile</li>
	<li>Incubate ilköğretim ve izotip kontrol ile antikor için konsantrasyonlarda (daha özel ayrıntıları Malzemeler tablo içinde listelenen) 1: 100 37 oda sıcaklığında 1 h ° C. 
	Not: BAL örnekleri için belirli bir işaretleyici makrofajlar, genellikle gerekli değildir.</li>
	<li>Birincil antikorlar eklenmesi sonra PBS hücrelerde yıkama ve daha fazla oda sıcaklığında 40 min için ilgili ikincil antikorlar ile kuluçkaya.</li>
	<li>PBS ve montajı ile DAPI tabanlı montaj orta confocal mikroskop lazer uyarilmalar 405, 488, 561 ve 647 nm ve X 40 at (yukarıda belirtildiği gibi) kullanarak görselleştirme için bölümlerde yıka, 1.0 NA petrol hedefi.</li>
</ol> 3. Akciğer doku örnekleri Not: için in vivo çalışmalar Akciğer doku örnekleri ilgili maruz kaldıktan sonra çalışma (O tarafından açıklandığı gibi örneğin, &#39; Sullivan vd. 7). bu deneme için en uygun pozlama bulaşıcı mikroorganizmalar, özellikle bakteri vardır. Bu yöntem için kullanılabilecek fare suşları C57BL/6 veya BALB/c fare, 10-12 hafta yaşlı, ağırlık 25-30 g ve erkek vardır.
<ol><li>Ketamin (400 mg/kg) ve xylazine (40 mg/kg) mayi bir enjeksiyon yoluyla Euthanize fareler. Göğüs boşluğuna açın ve akciğer ve kalp cerrahi forseps ve makas kullanarak ortaya çıkarmak.
	<ol><li>Sıcak PBS 30 kapları kandan dışarı yıkamak için sağ ventrikül 21'lik iğne kullanarak demlemek s, 10 mL % 2 PIP sabitleştirici 30 demlemek s (içine sağ ventrikül).</li>
		<li>Sıcak PBS (42 ° C) lavaj açık göğüs boşluğu kullanın. Trakea 21'lik iğne ve boyutuna, kesme 0.8 mm boru parçası ile entübasyon ve Önceden ısıtılmış (için 42 ° C), 800 µL enjekte, düşük erime noktası % 3 özel çözüm.</li>
		<li>Kravat Trakea örgülü ipek (4.0 USP) ile kapalı. Hemen altında kanül, ekleme noktasını Trakea etrafında iplik yerleştirin ve basit bir yukarıdan aşağı düğüm güvenli. Özel kuvvetlendirmek için akciğer çevresinde buz gibi PBS yönetmek. Akciğer ve kalp makas ve künt diseksiyon kullanarak göğüs boşluğuna bir blok olarak kaldırın. Her akciğer tek tek kaldırmanız ve sonra onları saptamak için 2 16 h % PIP veya formalin 4 ° C.</li>
		<li>Örnekler doku kesit kadar 4 ° C'de PBS içinde saklayın. Akciğer dokusu elde etmek için bu yöntemleri yukarıda açıklanan 13 olmuştur.</li>
	</ol></li> <li>Akciğer doku hazırlamak için örnekler aşağıdaki adımları kullanın.
	<ol><li>Düzeltme akciğer dokuları (3.1 adımda rezeke) doku % 10 formalin oda sıcaklığında 24 h için doğal arabelleğe alınmış. Aktarım için % 75 etanol ve 12 h döngüsü (2.5 s %75 alkol, 3 h mutlak alkol, Çözücü 3B ve 3 h parafin için 3,5 h) doku işlemcide koymak.</li>
		<li>Embed içinde oda sıcaklığında saklanan formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) blok oluşturmak için standart parafin. 
		Not: Bu aşamada, akciğer bölümler standart slaytlar için kesmek genellikle uygun.</li>
		<li>4-5 µm kalınlık bir microtome kullanarak FFPE akciğer bölümleri kesme ve ücret, daha önce O tarafından açıklandığı gibi kaplanmış slaytlar üzerinde monte &#39; Sullivan vd. 7</li> <li>Slaytlar bağlamak, 60 x 24 mm coverslips (boyutu 1,5) Montaj orta 3 damla koymak, slayt coverslip üzerinde ters çevir ve aşırı orta itmek için. Hermetik oje ile mühür ve mağaza oda sıcaklığında.</li>
	</ol></li></ol> 4. Hazırlık/mikroskobu Akciğer doku örneklerinin <ol>de-wax, suyla temasa ve FFPE Akciğer doku örneği antijen alma çözümü ile pretreat için <li>.
	60 ° C'de 60 dk için FFPE <ol><li>fırın kuru slaytlar Sonra slaytlar Ksilen çözüm 30 dk ve transfer için % 70 etanol çözüm oda sıcaklığında 5 min için koymak. Musluk suyu durulama.</li>
		<li>Yer ısı geçirmez plastik wrap ve HIER-antijen alma bir düdüklü tencere 10 10 dk içinde tabi m/mol/L Tris, 1 mmol/EDTA pH 9.0. 5 min bir rock'çı, sonra bir kez PBS ile rocker için musluk suyundaki iki kez 20 dk. yıkama için serin.</li>
		<li>% %5 10 tavuk serum ile blok BSA/PBS, oda sıcaklığında 30 dk için.</li>
	</ol></li> <li>Doku leke.
	<ol><li>METs makrofajlar tanımlamak, birincil antikorlar (MMP-9, H3Cit ve F4/80) % 1'eklemek için BSA/PBS 1/100 seyreltme (antikor tutarlarla ilgili belirli ayrıntıları Malzemeler tablo içinde listelenen) yönü 4 ° C'de 16 h için. Bir rocker üzerinde 5 min için PBS ile iki kez yıkayın.</li>
		%1 <li>elde floresan algılama ile ilgili ikincil kuluçka tarafından antikor BSA/PBS 40 dakika oda sıcaklığında. Antikor vardır: (1) tavuk Anti-fare 488 (yeşil), (2) tavuk Anti-keçi 594 (kırmızı) ve (3) eşek Anti-fare 647 (çok kırmızı).</li>
		<li>PBS ve montajı ile Kromatin boyama için montaj orta DAPI içeren bölümlerde yıkayın.</li>
	</ol></li> <li>Floresan görüntü ters bir mikroskop bağlı kafa tarama confocal lazer kullanarak elde.
	<ol><li>Excite 405, 488, 561 ve 647 hazırlıkla nm lazerler. Çizgi-sıralı üzerinde tıklatarak tek uçak 512 x 512 piksel görüntü yakalama, 20 X 0,1 kullanarak (2 satır ortalama) düğme tesviye NA hava ve 40 X 1.0 NA petrol hedefleri.</li>
		<li>Elde etmek için analiz bölümüne ve veri (örneğin, 10 yüksek güçlü alanları bakış açısı (HFOV) denetimi, uyarılmış örnek, vb, her fare için 10) her sonuç için başına en az on alanları bakış. 
		Not: tüm alanı temsil edici bir örnek almak için bir matris sistemi hangi alanı ayrılmıştır kullanılabilir içine farklı bölümler ve aynı matris görüş alanları seçmek için kullanılan farklı her örnek için (örneğin, alan 9 bölümlere ayrılabilir ve merkezi ve 4 köşe, iki HFOV alınır).</li>
	</ol></li></ol> 5. Üç boyutlu (3-D) görüntüleme, METs Not: METs 3-b yapılardır gibi birden çok z-yığın alarak yeniden, görüntüler, değerli bilgiler verebilir.
<ol><li>200 µm 1.8 mm ve hız 0.1-0,5 olarak ayarlamak bir genlik adlı bir vibratome kullanarak, parafin blok gelen akciğer numuneler bölümünde mm/s.</li>
	<li>Blok akciğer dokusu ile ilgili serum (% 10 fetal buzağı serum ve % 10 tavuk serum) % 20'si ve takıma PBS ve %3,75 permeabilize Triton-X 100 nazik ajitasyon altında oda sıcaklığında 7 h için.</li>
	<li>Bölümleri ile ilgili birincil antikorlar (MMP-9, H3Cit ve F4/80) 4 ° C'de 16 h için microcentrifuge tüpler (antikor konsantrasyonları Malzemeler tablo içinde listelenen) 200 µL cilt leke.</li>
	<li>PBS, 1 h için oda sıcaklığında ilgili ikincil antikorlar ile kuluçka önce 10 dakika için 3 kez bölümlerde yıkama</li>
	<li>Kapak paket fişi için mikroskop ekleme PBS içinde slaytlar önce akciğer bölümler 20 dk, çözüm DAPI (1:5, 000) için leke.</li>
	<li>405 ile donatılmış bir confocal ters mikroskop (40 x 1.3 NA) kullanarak floresan görüntü elde nm, 440 nm, 473 nm, 543 nm ve 635 nm lazerler.</li>
	<li>3-b z-yığınları 0,54 µm kalınlık 40 x 1.3 NA petrol amaç için en iyi z kesit ile rekor. 
	Not: kullanılan yazılım bireysel mikroskop bağlı olarak değişir. Nasıl belgili tanımlık bilgisayar yazılımı-ebilmek var olmak kullanılmış için bir mikroskop bir örneği ek dosya 1 ' de sağlanan.</li>
</ol> 6. Görüntü analizi Not: analiz örnekleri belirli görüntüleme analizi yazılımı kullanımı gerektirir ve örnekler Malzemeler tablo içinde listelenir. Analiz sonuçlarının kullandığınız belirli programa bağlıdır iken, listelenen aşağıdaki önemli noktalardır.
<ol><li>Mavi kanal DAPI için seçerek ve hücrelerin en az boyutu atama BAL analiz örnekleri <ol><li>tanımla makrofajlar sayısı (örneğin, &#62; çapı 18 µm). İlgili yazılım kullanarak makrofajlar her alanı için toplam sayısını ölçmek.</li>
		<li>Hücre dışı Kromatin DAPI tarafından diğer işaretleri (örneğin, MMP12, PAD2 ve H3Cit) Co ifade ile tespit varlığı ile bir MET özelliklere sahip hücreleri say. 
		Not: Analiz edilebilir işaretleri sayısı lazerler kullanılabilir sayısına bağlıdır, ancak ideal DAPI ek olarak, en az iki başka işaretleri dahil edilmelidir. Diğer daha az belirli parametreleri MET ifade (örneğin, hücreleri ekstrasellüler Kromatin ve genişlemiş bir çekirdeğe sayısı) için kullanılabilir.</li>
		<li>BAL MET ifadede karşılaştırmak için en az 100 BAL makrofajlar örnek başına örnekleri (Denetim arasında duman, duman/Dnaz tedavi grupları), analiz.</li>
		İkincil antikor ve izotip ölçmek için <li>kontrol Floresans düzeyde; en az 100 her örnek için onların Floresans hücrelerde ölçmek. Arka plan floresan (örneğin, H3Cit) her işaretçi için ortalama düzeyini ölçmek standart yazılım kullanarak.</li>
		<li>MET ifade, tanımlamak için tipik fenotip (örneğin, H3Cit ve MMP9 ortak ifadesi ile hücre dışı Kromatin) içeren hücreleri saymak ve her MET Floresans işaretleri (örneğin, H3Cit ve MMP9) düzeyini ölçmek. Eğer onların boyama arka plan ve izotip kontrol değildi METs üreten hücreleri dışlamak.</li>
		<li>İnsan BAL örnekleri için en az 100 hücre METs yapmak makrofajlar yüzdesi için her örnek için analiz. Fare örnekleri için hücreleri daha küçüktür ve METs daha sert tanımlamak için olarak, daha büyük bir sayı (örneğin, 200 makrofajlar) her örnek için hücre analiz.</li>
	</ol></li> <li>Analiz Akciğer doku örnekleri <ol><li>METs huzurunda Akciğer doku belirlemek için belirli makrofaj marker F4/80 gibi kullanın.</li>
		<li>6.1 bölümünde listelenen diğer parametrelerle ekstraselüler Kromatin hızlı hücrelerdeki F4/80 co lokalizasyonu kullanarak akciğer dokusunda METs varlığı tanımlayın.</li>
		<li>Arka plan Floresans örneklerinde ile ikincil antikor düzeyleri ve izotip denetimlerini belirler. Arka plan üstüne olmayan analiz METs dışlamak.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+is+immunity+the+second+function+of+chromatin%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?</a> J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).</li>
<li>Jorch, S. K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nat Med. 23 (3), 279-287 (2017).</li>
<li>Cheng, O. Z., Palaniyar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NET+balancing%3A+a+problem+in+inflammatory+lung+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+immunol%22%5BJournal%5D)">NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases.</a> Frontiers immunol. 4, 1(2013).</li>
<li>Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+traps+and+macrophages%3A+new+roles+for+the+versatile+phagocyte%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte.</a> J Leukoc Biol. 97 (6), 1023-1035 (2015).</li>
<li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nontypeable+Haemophilus+influenzae+induces+sustained+lung+oxidative+stress+and+protease+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression.</a> PloS one. 10 (3), e0120371(2015).</li>
<li>O'Sullivan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+participation+of+myeloperoxidase+in+antineutrophil+cytoplasmic+antibody+%28ANCA%29-associated+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis.</a> Kidney Int. 88 (5), 1030-1046 (2015).</li>
<li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+hypercitrullination+mediates+chromatin+decondensation+and+neutrophil+extracellular+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation.</a> J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).</li>
<li>Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+elastase+and+myeloperoxidase+regulate+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 191 (3), 677-691 (2010).</li>
<li>Rohrbach, A. S., Slade, D. J., Thompson, P. R., Mowen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+PAD4+in+NET+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activation of PAD4 in NET formation.</a> Front Immunol. 3, 360(2012).</li>
<li>Lewis, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+PAD4+activity+is+sufficient+to+disrupt+mouse+and+human+NET+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation.</a> Nat Chem Biol. 11 (3), 189-191 (2015).</li>
<li>Ruwanpura, S. M., McLeod, L., Dousha, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+Targeting+of+the+IL-6+Trans-Signaling%2FMechanistic+Target+of+Rapamycin+Complex+1+Axis+in+Pulmonary+Emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema.</a> Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).</li>
<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+how+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (36), (2010).</li>
<li>Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statins+enhance+formation+of+phagocyte+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+host+%26+microbe%22%5BJournal%5D)">Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps.</a> Cell host & microbe. 8 (5), 445-454 (2010).</li>
<li>Wong, K. W., Jacobs, W. R. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+exploits+human+interferon+gamma+to+stimulate+macrophage+extracellular+trap+formation+and+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis.</a> J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar ile ilgili olarak bu işi yapmak için hiçbir açıklamalar var.

Bu derlemede açıklanan yöntemi tabanlı ağlar14varlığı tanımlamak için kullanılan tarih. Makrofajlar tarafından çok BAL örneklerinde baskın hücre tipi vardır ve bu yöntem koleksiyon METs eğitimi için özellikle uygundur. Kırmızı kan hücreleri içinde BAL varsa, bu hücreleri amonyum klorür kullanarak lysed. BAL yordam genellikle makrofajlar devreye giriyor ve bu nedenle bu METs un uyarılmış örnekleri mevcut olacak bekleniyor. BAL makrofajlar genellikle çok yapışık. Bu hücreler baskın hücre tipi vardır...

Nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar), ilk olarak Brinkmann vd tarafından açıklanan 1 onlar enfeksiyon (özellikle bakteri) yanıt olarak ağırlıklı olarak üretilen ve konak savunma1,2' önemli bir role sahiptir. Onlar da yanıt olmayan bulaşıcı hastalık, vaskülit ve sistemik lupus Eritematozus (SLE); de dahil olmak üzere için gerçekleşmesi için tarif edilmistir ve mitojenle phorbol 12-myrisate 13-asetat (PMA)2,3. Bu son zamanlarda diğer hücre tipleri aynı zamanda hücre dışı tuzakları, makrofajlar da dahil olmak üzere neden olabilir kabul edilmiştir. Makrofaj hücre dışı tuzakları (METs) henüz edebiyat4,5iyi tanımlanmış bir varlık değildir. Biz son zamanlarda METs olup olmadığını belirlemek için yöntemleri kurduk vitro ve in vivo6,7. Bu makalede, METs confocal mikroskobu kullanılarak ölçüm açıklanacaktır.
Kromatin ile birlikte ekstrüzyon (gibi Apoptozis8) hücresel diğer yolları ayırmak NETosis temel özellikleri şunlardır: (1) citrullination histonlarla (H3Cit)9, (2) ortak ifade granül proteaz10 ve peptit arginin deiminase (PAD) 4 (3) katılımı11,12. Makrofajlar da ifade H3Cit, granül proteaz ve PAD ve bu özellikler METs varlığı tanımlamak için kullanılabilir.
METs makrofaj baskın hücre mevcut alveoller ve akciğerin airways ve hücresel immün yanıt enfeksiyon/iltihap için yönetmenlik ilk rolü vardır akciğerde, özellikle önemli bir rolü olabileceğini. Akciğer çok boş alanı (örneğin, içinde alveoller), Ayrıca, METs içine belgili tanımlık yer elde edilebilir, sağlam organların aksine genişletmek potansiyel olarak mümkün iken.
NETs varlığı tanımlamak için en çok kullanılan tarafından confocal mikroskobu yöntemidir. Henüz METs ölçmek için açıkça tanımlanmış bir yol değil. NETs ölçme tekniği METs huzurunda bu protokolü ölçmek için adapte edilmiştir. Bu yöntemin temel gereksinimleri confocal mikroskobu ve uygun görüntüleme yazılımı erişim analizi için vardır.

<table><tbody><tr><td><güçlü>İnsan örnekleri: Birincil antikorlar< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Tavşan anti-insan H3Cit (Sitrülin R26)</td> <td>Abcam</td><td>AB5103</td><td>10 ug / ml</td></tr><tr><td>Tavşan anti-insan MMP12</td><td>Novus Biyolojik</td><td>NB110-57214</td><td>1:100 konsantrasyon ölçülemez</td></tr><tr><td>Fare anti-insan MMP9</td><td>Novus Biyolojik</td><td>AB119906</td><td>1:200 asit, konsantrasyon yok verilen</td></tr><tr><td>Tavşan anti-insan PADI2 / PAD2</td><td>Abcam</td><td>AB16478</td><td>7 ug / ml</td></tr><tr><td>Fare anti-insan PADI4 / PAD4</td><td>Abcam</td><td>AB128086</td><td>10.1 ug / ml</td></tr><tr><td>Koyun anti-insan NE</td><td>LifeSpan Bioscience</td><td>LS-B4244</td><td>25 ug / ml</td></tr> <tr><td>< güçlü > Adı< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Şirket < / güçlü ></td> <td>< güçlü > Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</td></tr><tr><td>Fare örnekleri: Birincil antikorlar< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-fare MMP9</td><td>Abcam</td><td>AF909</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Tavşan anti-fare H3Cit (Sitrülin R26)</td><td>Abcam</td><td>AB5103</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Sıçan anti-fare F4/80</td><td>Kurum içi (hibridom)</td><td>Evde</td><td>20 ug/ml</td></tr><tr><td>Koyun anti-insan Anti-HNE /NE</td><td>Safir Biyobilim</td><td>LS-B4244</td><td>25 ug / ml</td></tr><tr><td>Fare anti-insan ve utangaç; &utangaç; &utangaç; &utangaç; PADI4/PAD4</td><td>Abcam</td><td>AB128086</td><td>10.1 ug/ml</td></tr><tr><td>Super-frost plus slaytlar</td><td>Menzel</td><td>S41104A</td><td></td></tr><tr><td>Dapi-prolong altın</td><td>Moleküler problar</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9434</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td> Şirket</td><td>Katalog Numarası</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>İkincil antikorlar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tavuk anti-tavşan AF 488/</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>A-21441</td><td></td></tr><tr><td>Tavuk anti-tavşan AF 594</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>A-21442</td><td></td></tr><tr><td>Tavuk anti-keçi AF 594</td><td>Yaşam Teknolojiler</td><td>A-21468</td><td></td></tr><tr><td>Tavuk anti-fare AF488</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>A-21200</td><td></td></tr><tr><td>Eşek anti-koyun AF 594</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>A-11018</td><td></td></tr><tr><td>Tavuk anti-fare AF 647</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>A-21463</td><td></td></tr><tr><td>Eşek anti-koyun AF 594</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>A-11016</td><td></td></tr><tr><td>İzotip kontrolü</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tavşan IgG</td><td>Evde</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tavşan IgG</td><td>Evde</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fare IgG1</td><td>BD Bioscience</td><td>550878</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan IgG</td><td>Evde</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fare IgG2a</td><td>BioLegend</td><td>400201</td><td></td></tr><tr><td>Koyun IgG</td><td>Evde</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ad</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Yazılım Programları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Florforların ortalama yoğunluğu için Microsoft Excel gibi standart bir ofis uygulaması kullanılabilir</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Mikroskoplar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1 Konfokal tarama mikroskobu</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FV1200 Konfokal tarama mikroskobu</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Doku kaynakları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monash Tıp Merkezi'ndeki</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>bronkoskopi odasından insan BAL örnekleriMelbourne Üniversitesi Farmakoloji Bölümü'nden fare BAL örnekleri ve akciğer dokusu.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>r8758</td><td></td></tr><tr><td>Fetal buzağı serumu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Adı< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Şirket< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Yorumlar< / güçlü ></td></tr> <tr><td>< güçlü > Diğer reaktifler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Sudan siyah</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>199664</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehit/periperiodat/lizin (PLP) fiksatif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27387</td><td></td></tr><tr><td>Ksilen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K2753</td><td></td></tr><tr><td>Doğal formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42904</td><td></td></tr><tr><td>Parafin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>327204</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2576</td><td></td></tr><tr><td>Solvent 3B</td><td>Hi-Chem</td><td>2026</td><td></td></tr><tr><td>Lamel 12 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1815</td><td></td></tr><tr><td>Lamel 60 x 24 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6875</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</td></tr><tr><td>Fareler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>c57 siyah 6</td><td>Monash hayvan araştırma platformu (MARP)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/c</td><td>MARP</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

makrofaj hücre dışı tuzaklar confocal mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Confocal mikroskobu, nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar) varlığı tanımlamak için kullanılan bir birincil yöntemidir. Makrofaj hücre dışı tuzakları (METs) görselleştirmek için kurulan confocal mikroskobu yöntemleri değiştirdiniz. Bu hücre dışı tuzakları ekstraselüler Kromatin varlığı granül proteaz, citrullinated Histon ve peptit arginase deiminase (PAD) gibi diğer bileşenlerinin ortak ifade ile tanımlanır. METs ifade genellikle bir uyarana maruz kaldıktan sonra ölçülen ve un uyarılmış örnekleri karşılaştırıldığında. Örnekleri de arka plan ve izotip kontrol için yer almaktadır. Hücreleri iyi tanımlanmış görüntü analiz yazılımı kullanılarak analiz edilir. Confocal mikroskobu METs varlığı tanımlamak için kullanılan vitro ve in vivo akciğer dokusunda.

METs BAL örneklerinden, akciğer dokusu ve 3-b görüntülerle daha kalın akciğer bölümlerde görüntülenmeyecektir. Bir BAL örnek görüntülenir METs örneği şekil 1' de gösterilen. METs morfolojisi olgunlaşma onların sahne göre değişir. Mikroskobu ilk tespit özelliğini hücrenin kenarını çekirdeğine harekettir. Bu H3Cit ve granül proteaz gibi diğer ortak ifade arabulucu ile hücre dışı Kromatin tarafından takip ediyor. Önceki aşamada hücre hala ifade ekstraselüler tuz...

Makrofaj hücre dışı tuzakları yeni açıklanan bir varlık vardır. Bu makale confocal mikroskobu yöntemleri üzerinde konsantre ve nasıl olduklarını vitro ve in vivo akciğer örneklerinden görüntülenir.

Makrofaj hücre dışı tuzaklar Confocal mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Bu yöntemin genel amacı, makrofaj hücre dışı tuzaklarının konfokal mikroskopi kullanılarak nasıl görselleştirilebileceğini ve incelenebileceğini göstermektir. Bu yöntem, enfeksiyona ve diğer bağışıklık uyaranlarına verilen yanıtlar gibi iltihaplanma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, nötrofil hücre dışı tuzakları incelemek için kullanılan iyi bilinen bir yöntemin bir modifikasyonu olmasıdır.Bu prosedürü gösteren Roleen Sharma olacaktır. Metin protokolüne göre bronkoalveoler lavaj veya BAL ile insanlardan ve farelerden akciğer makrofajları elde ettikten sonra, BAL çözeltisi üzerinde canlı bir hücre sayımı yapmak için tripan mavisi ve bir hemositometre kullanın. 500 mikrolitre kültür ortamında bir ila dört kez 10 ila beşinci makrofajları 24 oyuklu plakaların oyuklarındaki örtü fişlerine pipetleyin, ardından hücrelerin yapışması için hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Kültür ortamını çıkarın ve hücreleri bir kez yıkamak için PBS'yi kullanın. Daha sonra% 2 paraformaldehit-periodat-lizin veya PLP fiksatif ekleyin ve numuneleri 10 dakika inkübe edin. Hücreleri kısaca yıkamak için PBS'yi kullandıktan sonra, PBS'ye

visualizing-macrophage-extracellular-traps-using-confocal-microscopy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar (NET), patojen bakteriler, mantarlar ve parazitler mücadele için önemli bir doğuştan gelen bağışıklık mekanizması. Burada insan kan nötrofil granülositler izole etmek ve NET'ler oluşturmak için bunları etkinleştirmek yöntemleri açıklanmaktadır. Biz ışık ve elektron mikroskobu NET'ler görselleştirmek için hazırlama teknikleri mevcut.

Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar: Onları nasıl oluşturun ve görselleştirin için

Ayrı ayrı seçmek işlemek için bir yöntem tarif ve görüntü canlı patojenlerin dönen bir diskin mikroskop optik bir tuzak kullanıyor. Optik tuzak mekansal ve zamansal organizmaların kontrolü sağlar ve konak hücrelerine onları komşu yerleştirir. Floresan mikroskopi hücrelere az pertürbasyon dinamik hücrelerarası etkileşimleri yakalar.

Dinamik Canlı Hücre Görüntüleme Konukçu-Patojen Etkileşimleri Çalışma Optik Tuzak

Bu videoda, murin akciğer dokusundaki makrofaj hücre dışı tuzaklarının (MET'ler) immünoboyama ve konfokal mikroskopi tabanlı görselleştirilmesi için bir protokol açıklıyoruz. Dokuda yerleşik makrofajlar, makrofaj spesifik F4/80 yüzey glikoprotein markörünün ekspresyonu ile karakterize edilirken, MET'ler, MET belirteçleri matris metalloproteinaz 9, sitrüline histon H3 ve hücre dışı kromatin etiketlenerek görselleştirilir.

Fare Akciğer Dokusu Örneklerinde Makrofaj Hücre Dışı Tuzakların Karakterizasyonu

Bu video, anti-nötrofil sitoplazmik antikorlar içeren hasta serumu kullanılarak önceden etiketlenmiş nötrofillerde nötrofil hücre dışı tuzakların veya NET'lerin indüksiyonunu ve görselleştirilmesini göstermektedir. Ayrıca, geçirimsiz bir DNA boyası ve floresan mikroskobu kullanmak, NET'lerin görüntülenmesini sağlar.

Önceden Etiketlenmiş Nötrofillerde Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İndüksiyonu ve Görselleştirilmesi

Bu video, bronkoalveoler lavaj sıvısından bronkoalveoler makrofajlardaki makrofaj hücre dışı tuzakların, MET'lerin immünokilloetiketlenmesini ve bunların konfokal mikroskop kullanılarak görselleştirilmesini göstermektedir.

İnsan Bronkoalveoler Lavaj Sıvılarından Makrofajlarda Hücre Dışı Tuzakların Görüntülenmesi

Bu video, TNF-alfa, PMA ve HOCL gibi farklı inflamatuar uyaranlar kullanılarak insan monosit türevi makrofajlarda makrofaj hücre dışı tuzaklarının (MET'ler) in vitro stimülasyonunu göstermektedir. Video ayrıca görselleştirme için MET'lerin SYTOX boya boyama yöntemini de göstermektedir.

Makrofaj hücre dışı tuzakların in vitro stimülasyonu ve görselleştirilmesi

Burada dönen disk confocal mikroskobu görüntüsü tek fagositik olayları için fare ikamet periton makrofajlar tarafından kullanma yöntemleri açıklanmaktadır. İletişim kuralları diğer fagositik hücreler için genişletilebilir.

Fagositoz fare makrofajlar tarafından hızlandırılmış 3D görüntüleme

Nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NETs) uyarılmış nötrofil granülositler tarafından oluşturulan üç boyutlu yapılardır. Son yıllarda NET'lerin çok çeşitli hastalıklara karıştıkları ortaya çıkmıştır. Dokudaki NET'lerin saptanması tanısal bir önemi olabilir, bu nedenle NET bileşenlerinin etiketlenmesi için standart protokoller gereklidir.

Parafin-Gömülü Dokuda İnsan ve Mürin Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklarının İmmünofloresan Etiketlemesi

Burada mikroskopve floresan boyama kullanarak canlı hücre kültüründe makrofaj ekstrasellüler tuzak (MET) üretimini tespit etmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, immünoresans boyama ile spesifik MET protein belirteçlerini incelemek için daha da genişletilebilir.

Diferansiye İnsan Monosit türevi Makrofajlarda Hücre Dışı Tuzak Salınımının İn Vitro Stimülasyon ve Görselleştirilmesi

Burada in vitro nötrofil hücre dışı tuzakların (NET'ler) indüksiyonu ve analizi için bir protokol sunulmaktadır. DNA, katelisidin (LL37) ve enzim aktivitesinin nicelleştirilmesi, benzer kontrollü koşullar altında mikrobiyal ve kimyasal uyaranlar tarafından indüklenen NET'lerin bileşimindeki ve morfolojisindeki değişkenliği gösteren veriler vermiştir.

Mikrobiyal ve Kimyasal Uyaranlar Tarafından İndüklenen Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Morfolojik ve Bileşimsel Analizi

Nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET'ler) çeşitli hastalıklarla ilişkilidir ve immünofloresan genellikle görselleştirmeleri için kullanılır. Bununla birlikte, çeşitli boyama protokolleri vardır ve çoğu durumda sadece bir doku türü incelenir. Burada, fare ve insan dokusunda NET'lerin boyanması için genel olarak uygulanabilir bir protokol oluşturuyoruz.

İnsan ve Fare Dokularında Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İmmünofloresan Görüntülemesi

Öğrenin, konfokal mikroskopi ile makrofaj hücre dışı tuzaklarının görüntülenmesini. Bu yöntem, akciğer örneklerinde enfeksiyon yanıtlarını ve inflamatuar süreçleri incelemek için kullanılır.

Makrofaj hücre dışı tuzaklar Confocal mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi

Daha fazla video keşfet