Makrofaj hücre dışı tuzaklar Confocal mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi
19 Ekim 2017
Makrofaj hücre dışı tuzakları yeni açıklanan bir varlık vardır. Bu makale confocal mikroskobu yöntemleri üzerinde konsantre ve nasıl olduklarını vitro ve in vivo akciğer örneklerinden görüntülenir.
Bu yöntemin genel amacı, makrofaj hücre dışı tuzaklarının konfokal mikroskopi kullanılarak nasıl görselleştirilebileceğini ve incelenebileceğini göstermektir. Bu yöntem, enfeksiyona ve diğer bağışıklık uyaranlarına verilen yanıtlar gibi iltihaplanma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, nötrofil hücre dışı tuzakları incelemek için kullanılan iyi bilinen bir yöntemin bir modifikasyonu olmasıdır.
Bu prosedürü gösteren Roleen Sharma olacaktır. Metin protokolüne göre bronkoalveoler lavaj veya BAL ile insanlardan ve farelerden akciğer makrofajları elde ettikten sonra, BAL çözeltisi üzerinde canlı bir hücre sayımı yapmak için tripan mavisi ve bir hemositometre kullanın. 500 mikrolitre kültür ortamında bir ila dört kez 10 ila beşinci makrofajları 24 oyuklu plakaların oyuklarındaki örtü fişlerine pipetleyin, ardından hücrelerin yapışması için hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Kültür ortamını çıkarın ve hücreleri bir kez yıkamak için PBS'yi kullanın. Daha sonra% 2 paraformaldehit-periodat-lizin veya PLP fiksatif ekleyin ve numuneleri 10 dakika inkübe edin. Hücreleri kısaca yıkamak için PBS'yi kullandıktan sonra, PBS'ye% 0.2 TWEEN 20 ekleyin ve hücreleri 20 dakika inkübe edin.
Daha sonra, hücreleri bloke etmek için,% 5 BSA içinde% 10 tavuk serumu ekleyin, PBS'de seyreltin ve örnekleri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Daha sonra blok çözeltisini bir ila 100 konsantrasyonda birincil ve izotop kontrol antikorları ile değiştirin ve hücreleri oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, karşılık gelen ikincil antikorları eklemeden önce hücreleri yıkamak için PBS kullanın.
Daha sonra numuneleri oda sıcaklığında 40 dakika inkübe edin. Hücreleri PBS'de yıkadıktan sonra, numuneleri DAPI bazlı montaj ortamı ile monte edin, ardından numuneleri konfokal bir mikroskop kullanarak görselleştirin. FFPE örneklerini antijen alma çözeltisi ile ön işleme tabi tutmak için, slaytları 60 santigrat derecede 60 dakika fırında kurutun.
Daha sonra, numuneleri beş dakika boyunca oda sıcaklığında% 70 etanole aktarmadan önce slaytları 30 dakika boyunca ksilen çözeltisine aktarın. Slaytları durulamak için musluk suyu kullandıktan sonra, ısıya dayanıklı plastik sargıya koyun ve 10 dakika boyunca Tris-EDTA pH 9.0'da bir düdüklü tencereye koyarak daha yüksek antijen alımına tabi tutun. Numuneleri 20 dakika soğutun ve musluk suyuna aktarın.
Sonra onları beş dakika boyunca bir külbütöre yerleştirin. Musluk suyuyla yıkamayı tekrarlayın ve ardından slaytları külbütör üzerindeki PBS'de bir kez yıkayın. Örnekleri bloke etmek için, %5 BSA PBS'ye %10 tavuk serumu ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
Daha sonra, makrofaj hücre dışı tuzakları veya makrofajlardaki MET'leri tanımlamak için,% 1 BSA PBS'de bir ila 100 primer antikor seyreltmesi ekleyin ve slaytları 16 saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Numuneleri her biri beş dakika boyunca bir külbütör üzerinde iki kez yıkamak için PBS'yi kullanın. Karşılık gelen floresan ikincil antikorları% 1 BSA PBS'ye ekleyin ve slaytları oda sıcaklığında 40 dakika inkübe edin.
PBS yıkamalarından sonra, kromatini lekelemek ve numuneleri monte etmek için DAPI içeren montaj ortamı kullanın. Ters çevrilmiş bir mikroskoba bağlı konfokal bir lazer tarama kafası kullanarak, 20X 0.1 NA hava ve 40X 1.0 NA yağ hedefleri kullanarak floresan görüntüler yakalayın. Çizgi Sıralı tesviye düğmesine tıklayarak tek düzlem 512 x 512 piksel görüntüler yakalayın.
Analiz için bölüm başına en az 10 görüş alanı ve her sonuç için veri elde edin. Mikrosantrifüj tüplerindeki bölümleri boyamak için, ilgili birincil antikorları 200 mikrolitrelik hacimlere ekleyin ve numuneleri 16 saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Uygun ikincil antikorları eklemeden ve numuneleri oda sıcaklığında bir saat inkübe etmeden önce PBS'deki bölümleri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
Akciğer bölümlerini çözelti içinde boyamak için DAPI kullanın ve PBS'deki mikroskop slaytları üzerindeki bölümlere kapak fişleri eklemeden önce numuneleri 20 dakika inkübe edin. Görüntü yakalamak ve optimum Z kesiti ile 0,54 mikron kalınlığında 3D Z yığınlarını kaydetmek için 405 nanometre, 440 nanometre, 473 nanometre, 543 nanometre ve 635 nanometre lazerle donatılmış, 40X 1,3 NA objektifli ters konfokal bir mikroskop kullanın. Son olarak, görüntüleri metin protokolüne göre analiz edin.
Bir BAL örneğindeki MET'lerin bir örneği burada gösterilmiştir. İlk tespit edilebilir özellik, kabaca küresel bir şekle sahip olan bu erken aşama MET'te görüldüğü gibi, çekirdeğin hücrenin kenarına doğru hareketidir. Bunu, bu daha olgun MET'de görüldüğü gibi, H3Cit ve granüler proteazlar gibi diğer birlikte eksprese edilen aracılarla hücre dışı kromatin takip eder.
Daha erken evre MET sol üsttedir ve daha sonraki evre MET bunun altında merkeze doğru yer alır. Akciğer dokusu MET'leri bu şekilde gösterilmiştir. Akciğerler, akciğer mimarisini tanımlamak için sıvı ile şişirildiğinden, MET'ler alveolar duvarlara doğru itilecektir.
MET'lerin morfolojisi, dokunun hangi düzlemde kesildiğine bağlı olarak da değişecektir. Akciğer dokusu örnekleri için kullanılan standart bölümler dört ila beş mikron kalınlığındadır. Daha kalın doku kesitleri, birden fazla görüntünün alınmasını sağlar ve MET'ler daha sonra 3D olarak görüntülenebilir.
25 ila 35 mikronluk kesitler halinde kesilmiş fare akciğer dokusundan alınan bir 3D görüntü örneği burada sunulmuştur. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa iki günlük boyama ve görüntüleme ile yapılabilir. Bu prosedürü denerken, yıkamalara karşı nazik olmayı unutmamak önemlidir.
Bu prosedürü takiben, proteaz ekspresyonu gibi ek soruları yanıtlamak için zymografi gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik inflamatuar makrofaj yanıtlarının incelenmesi için yol açabilir. Bu videoyu izledikten sonra, konfokal mikroskopi kullanarak MET'leri nasıl görselleştireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.
PLP ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman eldiven ve göz koruması gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, konfokal mikroskopi teknikleri kullanılarak makrofaj hücre dışı tuzaklarının görselleştirilmesine odaklanmaktadır. Akciğer örneklerine uygulanan hem in vitro hem de in vivo yöntemleri tartışmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- İmmünoloji
- Hücre Biyolojisi
- Mikroskopi Teknikleri
Arka Plan
- Makrofaj hücre dışı tuzaklar yeni tanımlanmış bir varlıktır.
- Enflamasyondaki rollerini anlamak, bağışıklık yanıtı araştırması için çok önemlidir.
- Konfokal mikroskopi, bu yapıları görselleştirmek için güçlü bir araçtır.
- Bu yöntem, nötrofil hücre dışı tuzaklar için kullanılan yerleşik tekniklere dayanmaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Makrofaj hücre dışı tuzaklarının görselleştirilmesini göstermek.
- Enfeksiyon ve bağışıklık uyarıcılarına verilen tepkileri araştırmak.
- Alandaki araştırmacılara ayrıntılı bir protokol sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Bronkoalveoler lavaj (BAL) yoluyla insan ve fare akciğer makrofajlarının izolasyonu.
- Trypan mavisi ve bir hemositometreyle canlı hücre sayımı.
- 24 kuyu plakalarındaki kapak üzerinde hücre kültürü.
- Yapışma için hücrelerin 37 derece Celsius'ta inkübasyonu.
Ana Sonuçlar
- Makrofaj hücre dışı tuzaklarının başarılı görselleştirilmesi.
- Yöntemin bağışıklık yanıtlarını incelemede etkinliğinin gösterilmesi.
- Protokolün daha fazla netlik ve tekrarlanabilirlik için rafine edilmesi.
- Enflamasyondaki makrofaj fonksiyonlarının anlaşılmasına katkı.
Sonuçlar
- Konfokal mikroskopi yöntemi, makrofaj hücre dışı tuzaklarını incelemek için etkilidir.
- Bu teknik, enflamasyon ve bağışıklık yanıtları konusundaki araştırmaları ilerletebilir.
- Gelecekteki çalışmalar bu metodolojiyi temel alarak daha fazla sonucu keşfetmek için kullanılabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Visualizing macrophage extracellular traps (METs) provides a mechanistic readout of innate immune activation relevant to inflammatory disease modeling. This confocal microscopy approach enables target de-risking by linking stimulus exposure to quantifiable chromatin release and protease co-expression. The method supports early discovery workflows where understanding macrophage-driven pathology informs target validation and phenotypic screening strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of macrophage activation states through direct visualization of extracellular chromatin and co-expressed mediators like citrullinated histones and granule proteases.
- Operational Value: Provides a reproducible imaging-based assay to compare stimulated versus unstimulated conditions for target pathway modulation.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing in inflammation models by correlating MET formation with functional immune responses to infection or stimuli.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantifiable imaging outputs (e.g., chromatin release, H3Cit, protease co-localization) suitable for high-content screening adaptation.
- Reproducibility: Includes built-in controls (background, isotype, unstimulated) to ensure assay specificity and reduce false-positive signals in compound evaluation.
- Scalability: Compatible with both in vitro cell culture and ex vivo lung tissue sections, enabling cross-model consistency in target engagement studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly models macrophage-driven processes in lung inflammation, aligning with preclinical studies of fibrotic, infectious, or autoimmune lung conditions.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo lung tissue analysis, supporting biomarker-aligned progression from discovery to preclinical validation.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables objective assessment of macrophage extracellular trap formation as a functional readout for go/no-go criteria in immunomodulator screening.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead optimization, where MET visualization serves as a functional immune response assay in inflammation-focused programs.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by visualizing chromatin extrusion and protease release as downstream consequences of target modulation in macrophages.
- Screening: Enables quantitative imaging readouts that can be automated via image analysis software to assess compound effects on MET formation across dose ranges.
- Analytics: Delivers multiparametric data (chromatin, citrullinated histones, protease co-expression) enabling statistical comparison of experimental groups for target prioritization.
- Translational Research: Facilitates cross-species comparison (human and mouse lung macrophages) and ex vivo tissue validation, strengthening preclinical-to-clinical translatability.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable to multiple inflammatory targets and disease models beyond initial validation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in macrophage activation studies by providing direct, visual evidence of extracellular trap formation and molecular co-expression.
- Operational Value: Standardizes sample preparation, staining, and imaging workflows, improving inter-lab reproducibility and data consistency in immune profiling.
- Strategic Value: Informs early portfolio decisions by linking target inhibition to measurable reductions in pathogenic MET formation, decreasing late-stage attrition risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of immunomodulatory candidates based on functional macrophage phenotype modulation rather than binding affinity alone.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence staining, confocal microscopy operation, and image analysis for accurate MET detection and quantification.
- Dependent on access to confocal laser scanning microscopes with appropriate objectives (e.g., 20X air, 40X oil) and laser lines for multichannel fluorescence detection.
- Necessitates standardized antibody panels and titration protocols to ensure specific detection of chromatin, citrullinated histones, and granule proteases across sample types.
- Involves optimization steps for antigen retrieval in FFPE lung tissue, including pressure-based retrieval in Tris-EDTA pH 9.0, to maintain epitope accessibility.
- Limited by the need for careful wash steps to preserve delicate extracellular trap structures during staining, as aggressive handling may disrupt NET/MET morphology.
