Yöntemleri ile Caenorhabditis elegans çağda doğal Protein toplama çalışma değişikliklere

Bu deneyin genel amacı, C.elegans'ta yaşla birlikte protein çözünmezliğindeki değişiklikleri tespit etmek ve hedeflenen gen yıkımının bu yaşlanma belirtecini nasıl etkilediğini değerlendirmektir. Bu yöntem, organizmaların yaşla birlikte neden sağlıklı bir proteom sürdüremediği gibi yaşlanma ve proteostaz alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hastalık süreçlerinin yokluğunda normal yaşlanma sırasında protein agregasyonunu inceleme fırsatıdır.

Bu yöntem, C. elegans'ta protein agregasyonu hakkında bilgi sağlayabilse de, örneğin farelerde yaşa bağlı protein çözünmezliğini incelemek için diğer model organizmalara da uyarlanabilir. Tedaviye başlamak için, 2.800 mililitrelik bir Fernbach kültür şişesine ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi ek reaktiflerle birlikte 207.45 mililitre S Bazal ortamı ekleyin. Mililitre Karbenisilin başına 50 mikrogram nihai konsantrasyon ve bir milimolar IPTG ekleyin ve şişeyi bir membran vidalı kapakla kapatın.

L1'leri 25 santigrat derece inkübatörden çıkarın ve 15 mililitrelik tüplere aktarın. L1'leri üç dakika boyunca 1.900 kez g'de santrifüjleyin. Döndürdükten sonra süpernatanı çıkarın.

Mikroskop altında, iki mikrolitre başına L1'leri sayın ve en az dokuz damladan elde edilen sayıların ortalamasını alın. Daha sonra, genç solucan koleksiyonu için 50.000 solucan ve yaşlı solucan koleksiyonu için 100.000 solucanı önceki adımda hazırlanan dört Fernbach kültür şişesine ekleyin. Ardından, solucan sayısıyla orantılı olarak ilgilenilen gen için kontrol RNAi bakterileri ve RNAi bakterileri ekleyin.

Bakteri ekledikten sonra, toplam hacmi 300 mililitreye getirmek için S Basal ile solucan kültürünü tamamlayın. Solucan kültürünü, toplanana kadar 150 rpm'lik çalkalanan bir inkübatörde 25 santigrat derecede inkübe edin. Protein çözünürlüğünün bazal seviyelerini ölçmek için ikinci veya üçüncü günde genç solucanları toplayın.

Solucanları bir şişeden bir ayırma hunisine dökün ve solucanların oda sıcaklığında 10 dakika tortulaşmasına izin verin. Solucanlar çökeltisinden sonra, durdurma musluğunu açın ve solucanları 50 mililitrelik bir tüpe damlatın. Sonra, solucan peletini iki adet 15 mililitrelik tüpe bölün.

Tüpleri M9 ile 15 mililitreye kadar doldurun ve solucanları santrifüjleyin. Solucanları yıkamak için, süpernatanı çıkarın ve tüpü 15 mililitreye kadar M9 ile doldurun. Santrifüjlemeyi tekrarlayın. Yıkama tamamlandıktan sonra, solucanları iki adet 50 mililitrelik tüpe aktarın ve toplam hacmi 20 mililitreye doldurmak için buz gibi M9 kullanın.

Bakterileri ve ölü solucanları temizlemek için, iki adet 20 mililitre seyreltilmiş solucan peletini 20 mililitre buz gibi %60 sükroz ile doldurulmuş iki adet 50 mililitrelik tüpe ekleyin. Tüpleri hızlı bir şekilde santrifüjleyin. 25 mililitrelik bir pipetle, üst solucan tabakasının 15 mililitreye kadar dikkatlice çıkarın.

Üst solucan katmanını doğrudan buz üzerinde hazırlanmış 37 mililitre M9 artı oktosinol-9'a yerleştirin. Daha sonra, tüpleri dört santigrat derece hızlanma dokuzda ve yavaşlama yedide üç dakika boyunca 2.700 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, peleti dört adet 15 mililitrelik tüpe aktarın ve buz gibi soğuk M9 artı oktosinol-9 ile iki kez yıkayın.

Ardından tüpleri santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve tüpleri 15 mililitre işaretine kadar buz gibi M9 artı okoksinol-9 ile doldurun. Solucanları buz gibi M9 ile yıkayın ve dört tüpü iki tüpte birleştirin.

Tüpleri 15 mililitreye kadar doldurun ve santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın, iki tüpü oda sıcaklığında M9 ile toplam dört mililitre hacme kadar doldurun ve 40 dakika boyunca 25 santigrat derecede bir somunlama karıştırıcısı üzerinde döndürün. Yemledikten sonra solucanları buz gibi M9 artı okoksinol-9 ile iki kez yıkayın.

Daha sonra M9 ile iki kez yıkayın ve solucanları bir tüpe aktarın. Toplamadan önce solucanları yeniden birleştirme veya RAB yüksek tuz ekstraksiyon tamponunda inhibitörler olmadan yıkayın. Solucan peletinin üstünde sıvı kalmayana kadar süpernatanı çıkarın.

Ardından, solucan peletinin hacmini tahmin edin ve inhibitörlerle aynı hacimde RAB ekleyin. Kuru buz üzerinde yarısı sıvı nitrojenle doldurulmuş 50 mililitrelik bir tüp hazırlayın ve bir Pasteur pipeti kullanın, solucanları çekin ve yavaşça tüpe damlatın. Sıvı nitrojenin buharlaşmasına izin verin ve donmuş solucanları daha sonraki işlemlere kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Harcı sıvı nitrojen ile soğutun ve kuru buz üzerinde hayvan parçalanmasını gerçekleştirin. Donmuş solucanları önceden soğutulmuş harca aktarın ve 2,5 dakika öğütün. Toza 100 mililitre sıvı azot ekleyin ve 2,5 dakika daha öğütün.

Solucan cisimlerinin küçük parçalara ayrılıp ayrılmadığını kontrol etmek için bir mikroskop kullanın. Ardından, tozu iki mililitrelik tüplere aktarın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Kuru buz üzerinde, zaman noktası başına ve RNAi bakterisi başına iki mililitrelik tüplere iki kez 350 miligram öğütülmüş solucan tartın.

Tuzda çözünen yüksek proteinleri uzaklaştırmak için, inhibitörlerle önceden hazırlanmış RAB'nin ağırlığı başına iki hacim, bir milimolar PMSF, mililitre DNaz I başına 200 birim ve her tüpe mililitre RNase A başına 100 mikrogram ekleyin ve tozu buz üzerinde çözündürün. Süspansiyonu 15 kez bir mililitrelik şırıngaya çekin ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 18, 400 kez g'de santrifüjleyin.

Yağ tabakasından geçin ve yüksek tuzda çözünür proteinler içeren süpernatanı her koşulda iki mililitrelik bir tüpe toplayın. Yağı çıkarın ve atın. Eksi 80 santigrat derecede dondurmak için yüksek tuzda çözünür proteinler

Lipitleri atmak için, peleti DNaz I ve RNase A içermeyen bir molar sükroz içeren inhibitörlerle 700 mikrolitre RAB ile çözündürün. Süspansiyonu 10 kez bir şırıngaya çekin ve beş dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Tüm süpernatan ve lipitleri çıkardığınızdan ve attığınızdan emin olun. SDS'de çözünür proteinleri çıkarmak için peleti 700 mikrolitre RIPA tamponu ile çözündürün.

Süspansiyonu 10 kez bir şırıngaya çekin ve buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. Dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 18.400 g'da santrifüjleyin. SDS'de çözünür proteinler içeren süpernatanı ve eksi 80 santigrat derecede dondurmak için alikotu toplayın.

Her bir peleti 500 mikrolitre RIPA tamponu ile çözündürdükten sonra her koşulun iki örneğini bir araya getirin ve süspansiyonu 10 kez bir şırıngaya çekin. Tüm süpernatanı çıkarmaya ve atmaya dikkat edin. Yüksek derecede çözünmeyen proteinler içeren son peleti 400 mikrolitre% 70 formik asit ile çözündürün ve süspansiyonu 20 kez bir şırıngaya çekin.

Süspansiyonu buz üzerinde 20 dakika inkübe edin. Solucan kütikül kalıntılarını gidermek için süspansiyonu ultrasantrifüj tüplerinde santrifüjleyin. Yüksek oranda çözünmeyen proteinler içeren süpernatanı toplayın ve eksi 80 santigrat derecede dondurun.

Genç ve yaşlı solucanların çözünmeyen protein içeriğinin toplam protein boyaması, uzun ömürlü hayvanlarda değil, kontrol hayvanlarında yüksek oranda çözünmeyen protein seviyelerinde yaşa bağlı güçlü bir artış olduğunu ortaya koymuştur. Tahmin edilen prion benzeri bir alana sahip bir RNA bağlayıcı protein olan PAB-1'in antikor boyaması, uzun ömürlü hayvanların PAB-1'i yaşla birlikte çözünür hale getirdiğini gösteren kütle spektrometresi verilerini doğruladı. Faringeal kaslarda tagRFP PAB-1 eksprese eden transgenik hayvanların in vivo analizi yapıldı.

Genç hayvanlarda, tagRFP PAB-1 esas olarak farenks boyunca yaygın olarak yerleştirilmiştir. Yaşla birlikte, posterior faringeal ampulde başlayan parlak punktalarda ilerleyici bir birikim. Yaşlanma sırasında, artan sayıda hayvanda ön faringeal ampulde agregasyon da gözlemledik.

Yabani tipte ve daf-2 mutant arka planında yaşla birlikte farklı tagRFP PAB-1 agregasyon seviyelerinin nicelleştirilmesi, uzun ömürlü hayvanlarda yaşla birlikte güçlü bir şekilde gecikmiş tagRFP PAB-1 agregasyonunu ortaya koymaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, protein ekstraksiyonu için çok sayıda solucanın nasıl toplanacağını ve kütle spektrometresi veya SDS sayfası ile daha fazla analiz için yüksek oranda çözünmeyen büyük agregaların nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız.