Name: Yöntemleri ile Caenorhabditis elegans çağda doğal Protein toplama çalışma değişikliklere (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Öğrenin, Caenorhabditis elegans yaşlanması sırasında protein çözünmezliğindeki değişiklikleri ve gen susturmanın bu sürece etkisini nasıl değerlendireceğinizi. Bu yöntem, yaşlanma ve proteostaz araştırmalarında sağlıklı proteomun korunmasına dair temel soruları yanıtlamanıza yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser DZNE ve Marie Curie International Reintegration Grant (D.C.D. 322120) fon tarafından desteklenmiştir

<ol><li>Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adapting+proteostasis+for+disease+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adapting proteostasis for disease intervention.</a> Science. 319, 916-919 (2008).</li>
<li>David, D. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23181070">Aging and the aggregating proteome.</a> Frontiers in genetics. 3, 247(2012).</li>
<li>Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+chaperones+in+protein+folding+and+proteostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular chaperones in protein folding and proteostasis.</a> Nature. 475, 324-332 (2011).</li>
<li>Ayyadevara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-+and+Hypertension-Associated+Protein+Aggregates+in+Mouse+Heart+Have+Similar+Proteomic+Profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Age- and Hypertension-Associated Protein Aggregates in Mouse Heart Have Similar Proteomic Profiles.</a> Hypertension. 67, 1006-1013 (2016).</li>
<li>David, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+protein+aggregation+as+an+inherent+part+of+aging+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans.</a> PLoS biology. 8, 1000450(2010).</li>
<li>Demontis, F., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXO%2F4E-BP+signaling+in+Drosophila+muscles+regulates+organism-wide+proteostasis+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FOXO/4E-BP signaling in Drosophila muscles regulates organism-wide proteostasis during aging.</a> Cell. 143, 813-825 (2010).</li>
<li>Lechler, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+Insulin%2FIGF-1+Signaling+Restores+the+Dynamic+Properties+of+Key+Stress+Granule+Proteins+during+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Reduced Insulin/IGF-1 Signaling Restores the Dynamic Properties of Key Stress Granule Proteins during Aging.</a> Cell reports. 18, 454-467 (2017).</li>
<li>Reis-Rodrigues, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+age-dependent+changes+in+protein+solubility+identifies+genes+that+modulate+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+cell%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of age-dependent changes in protein solubility identifies genes that modulate lifespan.</a> Aging cell. 11, 120-127 (2012).</li>
<li>Tanase, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Carbonyl+Modifications+on+Aging-Associated+Protein+Aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Role of Carbonyl Modifications on Aging-Associated Protein Aggregation.</a> Scientific reports. 6, 19311(2016).</li>
<li>Walther, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+Proteome+Remodeling+and+Aggregation+in+Aging+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans.</a> Cell. 161, 919-932 (2015).</li>
<li>Lee, V. M., Wang, J., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+paired+helical+filament+tau+and+normal+tau+from+human+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Purification of paired helical filament tau and normal tau from human brain tissue.</a> Methods in enzymology. 309, 81-89 (1999).</li>
<li>Goudeau, J., Aguilaniu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbonylated+proteins+are+eliminated+during+reproduction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+cell%22%5BJournal%5D)">Carbonylated proteins are eliminated during reproduction in C. elegans.</a> Aging cell. 9, 991-1003 (2010).</li>
<li>Zimmerman, S. M., Hinkson, I. V., Elias, J. E., Kim, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+Aging+Drives+Protein+Accumulation+in+the+Uterus+and+Limits+Lifespan+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Reproductive Aging Drives Protein Accumulation in the Uterus and Limits Lifespan in C. elegans.</a> PLoS genetics. 11, 1005725(2015).</li>
<li>Uno, M., Nishida, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifespan-regulating+genes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Npj+Aging+And+Mechanisms+Of+Disease%22%5BJournal%5D)">Lifespan-regulating genes in C. elegans.</a> Npj Aging And Mechanisms Of Disease. 2, 16010(2016).</li>
<li>Sulston, J. H. <a target="_blank" href="NULL">The Nematode Caenorhabditis elegans</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).</li>
<li>Maine, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+As+a+tool+for+understanding+germline+development+in+Caenorhabditis+elegans%3A+uses+and+cautions%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">RNAi As a tool for understanding germline development in Caenorhabditis elegans: uses and cautions.</a> Developmental biology. 239, 177-189 (2001).</li>
<li>Rauniyar, N., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isobaric+labeling-based+relative+quantification+in+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+proteome+research%22%5BJournal%5D)">Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics.</a> Journal of proteome research. 13, 5293-5309 (2014).</li>
<li>Brignull, H. R., Morley, J. F., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+polyglutamine+pathogenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Modeling polyglutamine pathogenesis in C. elegans.</a> Methods in enzymology. 412, 256-282 (2006).</li>
<li>Fay, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+genetic+methods%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Classical genetic methods.</a> WormBook. , 1-58 (2013).</li>
<li>Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodeoxyuridine+enhances+the+heat+shock+response+and+decreases+polyglutamine+aggregation+in+an+HSF-1-dependent+manner+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans.</a> Mech Ageing Dev. 141, 1-4 (2014).</li>
<li>Angeli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+synthesis+inhibitor+is+protective+against+proteotoxic+stressors+via+modulation+of+fertility+pathways+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans.</a> Aging (Albany NY). 5, 759-769 (2013).</li>
<li>Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodeoxyuridine+improves+Caenorhabditis+elegans+proteostasis+independent+of+reproduction+onset%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset.</a> PLoS One. 9, 85964(2014).</li>
<li>Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodeoxyuridine+affects+the+identification+of+metabolic+responses+to+daf-2+status+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans.</a> Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).</li>
<li>Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+and+insulin+signaling+regulate+reproductive+aging+via+oocyte+and+germline+quality+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TGF-beta and insulin signaling regulate reproductive aging via oocyte and germline quality maintenance.</a> Cell. 143, 299-312 (2010).</li>
<li>Andux, S., Ellis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+maintains+oocyte+quality+in+aging+Caenorhabditis+elegans+females%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Apoptosis maintains oocyte quality in aging Caenorhabditis elegans females.</a> PLoS genetics. 4, 1000295(2008).</li>
<li>Vilchez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPN-6+determines+C.+elegans+longevity+under+proteotoxic+stress+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions.</a> Nature. 489, 263-268 (2012).</li>
<li>Ghazi, A., Henis-Korenblit, S., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcription+elongation+factor+that+links+signals+from+the+reproductive+system+to+lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">A transcription elongation factor that links signals from the reproductive system to lifespan extension in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS genetics. 5, 1000639(2009).</li>
<li>Shemesh, N., Shai, N., Meshnik, L., Katalan, R., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+the+Trade-Off+between+Somatic+Proteostasis+and+Reproduction+in+Caenorhabditis+elegans+Models+of+Polyglutamine+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Uncoupling the Trade-Off between Somatic Proteostasis and Reproduction in Caenorhabditis elegans Models of Polyglutamine Diseases.</a> Front Mol Neurosci. 10, 101(2017).</li>
<li>Kaletsky, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+adult+neuronal+IIS%2FFOXO+transcriptome+reveals+adult+phenotype+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators.</a> Nature. 529, 92-96 (2016).</li>
<li>Kawarabayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+changes+in+brain%2C+CSF%2C+and+plasma+amyloid+%28beta%29+protein+in+the+Tg2576+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Age-dependent changes in brain, CSF, and plasma amyloid (beta) protein in the Tg2576 transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 372-381 (2001).</li>
<li>Kraemer, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegeneration+and+defective+neurotransmission+in+a+Caenorhabditis+elegans+model+of+tauopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neurodegeneration and defective neurotransmission in a Caenorhabditis elegans model of tauopathy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 9980-9985 (2003).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada son derece çözünmez protein toplamları RNAi için analiz için kütle spektrometresi ve Western Blot tarafından tabi C. elegans yaşlanma dan izole etmek için bir metodoloji raporu. Biz proteostasis IIS büyük ölçüde azaltarak iyileştirilmesi yaş bağımlı protein toplama engellediğini gösterir. C. elegansiçinde overexpress için belirli toplama eğilimli proteinler seçerek, daha fazla doğal protein toplama oransal mekanizmaları incelemek mümkündür.
Hastalık ilişkili Pr...

Protein misfolding ve toplama bir hallmark reklam, PD, amyotrofik lateral skleroz (ALS), da demans (FTD) ve diğerleri gibi çeşitli nörodejeneratif hastalıkların kabul edilmektedir. Örneğin, α-synuclein derlemeler amiloid liflerinde içine bu PD hastalarında ALS hastalar TDP-43 veya FUS misfold iken motor nöronların oluşan bozucu formu sitoplazmik toplamları için özellikle de gözlemliyorum nigra Lewy organları olarak birikir. Her bu nörodejeneratif hastalıklar, protein homeostazı veya proteostasis Bakımı mekanizmaları hastalık için sonuç olarak lider misfolded proteinlerin birikimi önlemek başarısız.
Normal şartlar altında düzenleyici mekanizmaların sıkı bir şekilde denetlemesi protein sentezi, katlama ve bozulma oranını ve Proteostasis hücresel işlev görmesini sağlamak için önemlidir. Çeşitli çalışmalarda ile yaşlanma, protein homeostazı korumak yeteneği birçok hücre ve organların yavaş yavaş açığa ve yaş proteostasis ağlarıyla fizyolojik bozulma için önemli bir ağırlaştırıcı faktör olduğunu göstermek nörodejeneratif hastalıklar (başvurular1,2,3' te gözden). Protein kalite kontrol ve gelişeceğini protein stres hücresel yanıt yaşla birlikte tehlikeye protein misfolding ve toplama yaşlanma genel bir sonucu olabilir gösteriyor. Nitekim, biz ve diğerleri protein toplama hastalığı için sınırlı değildir ve bunun yerine Proteom parçası çok deterjan-yaşlı hayvanlar4,5,6',7 çözünmez olur göstermiştir ,8,9,10. Hesaplamalı ve in vivo analizi bu fizyolojik yaşı ile ilgili toplamları çeşitli yönleri5hastalık toplamları benzer saptandı. Endojen, yaş-bağımlı protein toplama keşfi bize protein toplama, ectopically ifade insan hastalık ilişkili proteinler kullanmadan düzenleyen moleküler ve hücresel mekanizmaları incelemek için fırsat verir. Şu anda, bu bozukluk organizmanın sağlık üzerine etkisi ve yaygın protein insolubility düzenlenmesi hakkında sadece sınırlı bilgi bulunmaktadır.
Nematot C. elegans bu hayvanlar nispeten kısa bir ömrü var ve daha yüksek organizmalarda gözlenen birçok karakteristik yaşlanma özellikleri göstermek gibi araştırma yaşlanma içinde en yoğun olarak çalışılan model organizmalar biridir. Protein insolubility yaşlanma etkilerini C. elegans içinde ateş araştırma11 alan hastalık toplamları ayıklamak için yaygın olarak kullanılan farklı çözünürlük göre sıralı biyokimyasal ayırma tarafından incelenmiştir . Nicel kütle spektrometresi tarafından birkaç yüz proteinler toplama C. elegans eğilimli hastalık5yokluğunda olmak için gösterildi. Burada biz ayrıntılı olarak tarif sıvı kültür ve miktar için toplanan proteinler kütle spektrometresi ve analiz tarafından Western blot tarafından izole etmek için sıralı ayıklama solucanlar çok sayıda büyümeye protokolü. Çünkü misfolded ve toplama eğilimli proteinler yaşlı içinde birikir C. elegans gonads ve maskeleri değişikliklerinin diğer somatik dokular5,12,13, erbezi daha az mutant protein analizi odaklanmak için kullanmak Sigara üreme dokularda insolubility. Yöntemi sunulan % 0.5 SDS çözünmez ve nispeten düşük santrifüj hızlı tarafından pelleted son derece çözünmez, büyük toplamları çözümleme sağlar. Alternatif olarak, aynı zamanda daha küçük ve daha fazla çözünür toplamları toplamak için daha az sıkı bir ayıklama Protokolü oldu başka bir yerde10yayınlandı. Ayrıca, C. eleganstoplama vivo içinde değerlendirmek için kullanılan yöntem açıklamaktadır.
Genel olarak, bu yöntemleri RNA müdahale (RNAi) ile birlikte bir gen yaş bağımlı protein toplama oransal ilgi rolü değerlendirebilir. Bunun için biz genç ve yaşlı kurt ve nakavt RNAi kullanarak ilgi belirli bir protein olmayan özler analizini açıklar. Bu yöntemler proteostasis ağ bileşenlerini protein insolubility düzenleyen belirlemek için güçlü bir araç olmalıdır. Birkaç müdahaleler gibi insülin/İnsülin benzeri büyüme faktörü (IGF) azaltılmış 1 (IIS) sinyal gösterilmiştir dramatik C. elegans yaşlanma14geciktirmek için. Uzun ömürlü yolları genellikle protein-kalite kontrol mekanizmaları teşvik ve böylece bu yolları aktif protein toplama oranını etkileyen. Örneğin, sınırlı doğal protein toplama IIS yolu7inhibisyonu üzerine uzun ömürlü hayvanlarda göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>Fernbach kültür şişesi&nbsp;</td><td>Corning</td><td>4425-2XL</td><td>Pyrex, Kapasite 2.800 ml, 3 bölme girintili</td></tr><tr><td>Membran Vidalı Kapak&nbsp;</td><td>Schott</td><td>1088655</td><td>GL45</td></tr><tr><td>Somun Sıkma Mikseri</td><td>VWR</td><td>444-0148</td><td></td></tr><tr><td>Ayırma hunisi</td><td>Nalgene</td><td>4300-1000</td><td>Kapasite 1.000 ml</td></tr><tr><td>1 ml şırınga&nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>Gri iğne, 27 G x &frac12; ", 0,4 mm x 13 mm</td><td>BD Microlance 3</td><td>300635</td><td></td></tr><tr><td>Membran filtreler 0,025 & mikro; M</td><td>Millipore</td><td>VSWP04700</td><td></td></tr><tr><td>pH şeridi</td><td>Machery-Nagel</td><td>92110</td><td>pH-Fix 0-14</td></tr><tr><td>Proteaz İnhibitörü Kokteyl</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td>Komple Mini EDTA içermeyen tabletler&nbsp;</td></tr><tr><td>Okoksinol-9&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A1388</td><td>Triton X-100</td></tr><tr><td>4-Morfolineetansülfonik asit (MES)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M1317</td><td></td></tr><tr><td>Nonilfenilpolietilenglikol</td><td>Applichem</td><td>A1694</td><td>Nonidet P40 (NP40)</td></tr> <tr><td>DNaseI</td><td>Roche</td><td>04716728001</td><td>rekombinant, RNaz içermeyen</td></tr><tr><td>RNaseA</td><td>Promega</td><td>A7973</td><td>çözeltisi</td></tr><tr><td>Toplam protein leke boyama</td><td>Thermofisher</td><td>S11791</td><td>Sypro Yakut protein lekesi lekesi</td></tr><tr><td>Toplam protein jel boyama</td><td>Thermofisher</td><td>S12001</td><td>Sypro Ruby protein jel boyası</td></tr><tr><td>TCEP (tris (2-karboksietil) fosfin hidroklorür)</td> <td>Serva</td><td>36970</td><td></td></tr><tr><td>İyodoasetamid</td><td>Serva</td><td>26710</td><td></td></tr><tr><td>Amonyumbikarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Sıralama Sınıfı Modifiye Tripsin</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Bağıl ve mutlak kantitasyon için izobarik etiketler</td><td>Sciex</td><td>4352135</td><td>iTRAQ Reaktifleri Multipleks</td></tr><tr><td>Kiti Santrifüj Avanti J-26XP</td><td>Beckmann Coulter</td><td>393126</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj Optima Max-XP</td><td>Beckmann Coulter</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj 5424R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5404000413 Santrifüj 5702</td><td>Eppendorf</td><td>5702000329</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj Megafüj 40R</td><td>Termo Bilimsel</td><td>75004518</td><td></td></tr><tr><td>Yoğunlaştırıcı Plus</td><td>Eppendorf</td><td>5305000304</td><td>Santrifüj buharlaştırıcı</td></tr><tr><td>Floresan stereo-mikroskop M165 FC&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>Planapo 2.0x objektif</td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>ile Leica&nbsp;</td><td></td><td>Leica S6E</td></tr><tr><td>Yüksek büyütme mikroskobu Zeiss Axio Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td>PlanAPOCHROMAT 20x objektif ve Zeiss Axio Cam MRm</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image analiz yazılımı</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kütle spektrometresi verilerinin analizi</td><td>Protein Prospector</td><td></td><td></td></tr><tr><td>http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm<güçlü>E.coli suşu< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>RNAi bakteri< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L4440</td><td>Julie Ahringer RNAi kütüphanesi</td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>C. elegans mutantlar< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CF2253</td><td>CGC, suş adı: EJ1158&nbsp;</td><td></td><td>Genotip: gon-2(q388)</td></tr><tr><td>C. elegans transgenics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DCD214</td><td>Della David'in DZNE T&uuml'daki laboratuvarı; bingen</td><td></td><td>Genotip: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]</td></tr><tr><td>DCD215</td><td>Della David'in DZNE T&uuml'daki laboratuvarı; bingen</td><td></td><td>Genotip: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]</td></tr></tbody></table>

yöntemleri ile caenorhabditis elegans çağda doğal protein toplama çalışma değişikliklere

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Son yıllarda, nörodejeneratif hastalıkları, Alzheimer hastalığı (Ah) ve Parkinson hastalığı (PD), gibi yaygınlığı büyüdü. Bu yaş ilişkili bozuklukları protein toplamları bu hastaların beynindeki fibrillary yapısı ile görünümünü ile karakterizedir. Tam olarak normal çözünür proteinler tabi neden bir toplama işlemi kötü anlaşılır kalır. Protein toplama hastalık süreçlerine sınırlı değildir ve bunun yerine normal yaşlanma sürecinin bir parçası protein toplama, ectopically kullanmadan düzenleyen moleküler ve hücresel mekanizmaları çalışma sağlar keşif insan ifade hastalık ilişkili proteinler. Burada Caenorhabditis elegans doğal protein toplamada tamamlayıcı yaklaşımlar ile incelemek için yöntemleri açıklanmaktadır. İlk olarak, biz yaşlı hayvanlar elde etmek için çok sayıda yaş senkronize C. elegans yetiştirmeyi incelemek ve biz son derece-çözünmez-büyük toplamları ayırmak için biyokimyasal yordamlar mevcut. Hedeflenen genetik nakavt ile birlikte, teşvik ya da yaş bağımlı protein toplama nicel kütle spektrometresi ile ya da kapsamlı bir çözümlemesini kullanarak engelleyen bir gen rolünü incelemek mümkündür veya bir aday tabanlı analiz antikorlar ile. Bu bulgular sonra toplama eğilimli proteinler floresan öğesini ifade Transjenik hayvanlar ile vivo içinde analiz tarafından onaylanır. Bu yöntemler belirli proteinler topluluğu ile yaş ve sonuçta bu proteinler tamamen işlevsel tutmayı yatkındır neden açıklamak yardımcı olmalıdır.

Biz burada ne kadar uzun ömürlü hayvanlarla değerlendirmek için sunulan yöntemleri kullanılan azaltılmış IIS modüle yaş bağımlı protein toplama. Tarafından Western blot (2.2, çabuk çözünmez protein çıkarma Western blot analizi için bkz. adım), toplam ve genç (3. gün erişkin) çözünmez protein içeriği analiz ve yaş (gün 18 yetişkinlik) solucanlar kontrol RNAi ve insülin hedefleme RNAi / IGF-1-benzeri reseptör daf-2. RNAi koşulları (Şekil 2A</st...

Burada sunulan yöntem model organizma C. elegansnormal yaşlanma sırasında protein toplama keşfetmek için hedeftir. Protokolü temsil eden yaş ile oluşturmak son derece çözünmez büyük toplamları çalışmaya ve nasıl protein toplama proteostasis değişiklikleri etkisini belirlemek için güçlü bir araç.

Yöntemleri ile Caenorhabditis elegans çağda doğal Protein toplama çalışma değişikliklere

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Bu deneyin genel amacı, C.elegans'ta yaşla birlikte protein çözünmezliğindeki değişiklikleri tespit etmek ve hedeflenen gen yıkımının bu yaşlanma belirtecini nasıl etkilediğini değerlendirmektir. Bu yöntem, organizmaların yaşla birlikte neden sağlıklı bir proteom sürdüremediği gibi yaşlanma ve proteostaz alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hastalık süreçlerinin yokluğunda normal yaşlanma sırasında protein agregasyonunu inceleme fırsatıdır.Bu yöntem, C. elegans'ta protein agregasyonu hakkında bilgi sağlayabilse de, örneğin farelerde yaşa bağlı protein çözünmezliğini incelemek için diğer model organizmalara da uyarlanabilir. Tedaviye başlamak için, 2.800 mililitrelik bir Fernbach kültür şişesine ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi ek reaktiflerle birlikte 207.45 mililitre S Bazal ortamı ekleyin. Mililitre Karbenisilin başına 50 mikrogram nihai konsantrasyon ve bir milimolar IPTG ekleyin ve şişeyi bir membran vidalı kapakla kapatın.L1'leri 25 santigrat derece inkübatörden çıkarın ve 15 mililitrelik tüplere aktarın. L1'leri üç dakika boyunca 1.900 kez g'de santrifüjleyin. Döndürdükten sonra süpernatanı çıkarın.Mikroskop altınd

methods-to-study-changes-inherent-protein-aggregation-with-age

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, yaşlanmaya bağlı proteostaz düşüşünü belirlemek için in vivo görüntülemeye dayalı bir testi göstermektedir. Test, yaşa bağlı poliglutamin agregasyonunu ve proteotoksisitenin indüksiyonunu ölçmek için vücut duvarı kaslarında poliglutamin YFP-füzyon proteinini eksprese eden Caenorhabditis elegans'ı kullanır ve felce yol açar.

Floresan Raportör Tabanlı Felç Testi: Poliglutamin Floresan Raportörünün Yaşa Bağlı Progresif Oluşumunu ve İlişkili Felci Değerlendirmek İçin Bir Teknik Caenorhabditis elegans

Protein homeostazı, stres ve yaşlanma arasındaki ilişkiyi incelemek için, genetik olarak izlenebilir metazoan Caenorhabditis elegans'ı model sistem olarak kullanarak, protein disfonksiyonunu, hücredeki protein lokalizasyonunu ve organizma, hücresel ve protein seviyelerinde protein stabilitesini takip ederek protein katlanmasındaki değişiklikleri izledik.

Caenorhabditis elegans'ın Çok Hücreli Bir Organizmada Protein Homeostazını İncelemek için Model Sistem Olarak Kullanılması

Floresan yaşam boyu görüntüleme, proteinlerin yaşam, yaşlanma ve stresli C. elegans hastalık modellerinde toplama eğilimlerini ölçer, ölçer ve ayırt eder.

Yaşlanma C. Floresan Yaşam Boyu Görüntüleme Kullanarak Elegans Amiloid Yapıların Karakterizasyonu

Proteostatik düşüş, nörodejeneratif hastalıkların başlangıcını kolaylaştıran yaşlanmanın ayırt edici bir özelliğidir. İki farklı Caenorhabditis elegans dokularındaki proteostazları, floresan bir muhabire kaynaşmış poliglutamin tekrarlarının heterolog ifadesiyle ölçülebilir bir şekilde ölçmek için bir protokol özetliyoruz. Bu model proteostazın hızlı in vivo genetik analizine izin verir.

Caenorhabditis eleganlarında Dokuya Özgü Proteostatik Düşüşün Ölçülmesi

Burada, yaşla ilişkili nörodejeneratif hastalıkların hücresel ve moleküler temellerini izlemek ve incelemek için hiperaktive iyon kanal kaynaklı nekroz ve protein agrega kaynaklı nörotoksisite gibi çok yönlü nematod modellerini kullanan yaygın olarak erişilebilir metodolojileri tanıtıyor ve tanımlıyoruz.

Caenorhabditis elegans Yaş İlişkili Nörodejeneratif Hastalıkların Modellendirilmesi

Aşağıdaki protokol, proteostazdaki değişikliklerin bir değerlendirmesi olarak poliglutamin agregalarını ölçmek için solucan kültürleme, floresan görüntüleme ve otomatik görüntü işleme için yüksek verimli bir iş akışının geliştirilmesini ve optimizasyonunu açıklamaktadır.

Caenorhabditis elegans'ta Agrega Niceliğinin Otomatikleştirilmesi

Burada, nematod Caenorhabditis elegans'ta protein agregasyon kinetiğinin analizi için bir yöntem sunulmuştur. Yaş senkronize edilmiş bir popülasyondan gelen hayvanlar farklı zaman noktalarında görüntülenir, ardından CellProfiler'da yarı otomatik dahil etme sayımı ve AmyloFit'teki matematiksel bir modele uyar.

Caenorhabditis elegans'ta Otomatik Inklüzyon Sayımı Kullanarak Protein Agregasyon Kinetiğinin In Vivo'da İzlenmesi

Burada plaka tabanlı katı diyet kısıtlaması yapmak için bir protokol...

Katı Plaka tabanlı Diyet Kısıtlama Caenorhabditis elegans</em

Bu makale, nematod embriyogenezisin erken olayların görselleştirme için kullanılan bir...

Erken Embriyo Oluşumu Zaman atlamalı Mikroskopi Caenorhabditis elegans

Temel<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Yöntem: Senkronizasyon ve Gözlem

Öğrenin, Caenorhabditis elegans yaşlanması sırasında protein çözünmezliğindeki değişiklikleri ve gen susturmanın bu sürece etkisini nasıl değerlendireceğinizi. Bu yöntem, yaşlanma ve proteostaz araştırmalarında sağlıklı proteomun korunmasına dair temel soruları yanıtlamanıza yardımcı olur.

Yöntemleri ile Caenorhabditis elegans çağda doğal Protein toplama çalışma değişikliklere

Daha fazla video keşfet