Elektrofizyoloji ölçüm uygulanması elektro-tarafsız taşıyıcılar etkinlik çalışması için

İyon seçici mikroelektrotlarla birleştirilmiş dev yamalar yöntemi, iyon akışlarını tespit etmek ve miktarını belirlemek için kullanılan çok yönlü bir yöntemdir. Spesifik olarak, hücre zarı üzerinde eksprese edilen elektro-nötr iyon taşıyıcısı, sodyum-hidrojen değiştiricisi veya NHE'nin aktivitesi tarafından üretilen proton akışlarını ölçmek için kullanılır. Sodyum-hidrojen değiştirici, plazma zarına yakın bir yerde, burada turuncu bir halka olarak gösterilen bir proton gradyanı üretir.

Hücre zarı boyunca bu proton gradyanı, bir proton seçici mikroelektrot kullanan bir teknikle birleştirilmiş tüm hücre yama kelepçesi kaydı ile ölçülür. Proton seçici mikroelektrot, hücre yüzeyine yakın bir yere hareket ettirilir, burada hücrelerden dışarı çıkan protonların akısını kaydeder, burada A konumunda gösterilir. Ve hücre yüzeyinden uzağa, burada B konumu ile gösterilen çözeltide bulunan serbest proton konsantrasyonunu kaydeder. Ve sonra, hücre zarına yakın A konumuna geri döner, tekrarlayan, salınımlı bir harekette. A'dan B'ye voltaj farkı kaydedilir ve NHE aktivitesinin temsilcisine bağlıdır.

Hücre zarı boyunca protonlar gibi taşıyıcı iyonlar, yaşam için gerekli olan süreci etkiler. Bu nedenle, pH'daki değişiklikler, bir plazma zarı proton dışlama sistemi olan sodyum-proton değiştirici dahil olmak üzere bir dizi molekül tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir. Tüm hücre yaması klempleme ile birleştirilmiş salınımlı pH mikroelektrodu, sodyum-proton değiştirici aktivitesinin aracılık ettiği proton akısını incelemek için yeni bir yaklaşımdır.

Bu yöntemlerin uygulanması, orta derecede hassasiyet ve zaman çözünürlüğü ve hücre içi ortamın bir başka iyi kontrolü gibi sodyum-proton değiştirici aktivitesini ölçmek için tipik olarak kullanılan tekniklerin bazı önemli sınırlamalarının üstesinden gelir. İş arkadaşım Dr. Victor Babich ile birlikte yöntemlerin bir gösterimini yapacağım. Dr Matthew Henry anlatıcı olacak.

Bu yöntemin bir uygulamasını, bağırsak ve renal epitilyum boyunca sudaki tuzun emiliminin önemli bir düzenleyicisi olan sodyum-proton değiştirici izoform üç'ün aktivitesini ölçerek göstereceğiz. Proton konsantrasyonunun ölçümü için proton seçici mikroelektrotlar, standart borosilikatlı cam borudan imal edilmiştir. 1.2 milimetre dış çapa sahip ve filamentsiz borosilikat cam elektrotlar, geleneksel bir çift çekme protokolü kullanılarak dikey bir çektirme ile çekilir.

İki ila üç mikrometre çapında bir pipet ucu elde edilir. Pipetler, pipet ucu yukarı bakacak şekilde bir kavanoz tutucuya yerleştirilir. Daha sonra, pipetleri silisyonize etmek için bir karışım hazırlanır.

Bir kavanoza dökülür ve kapağı sıkıca kapatılır. Pipetler, silikonizasyon karışımı ile 24 ila 48 saat inkübe edilir. Dikkatli olun, karışımı hazırladığınızdan ve pipetleri oda sıcaklığında iyi havalandırılan bir kimyasal davlumbazda siliklonladığınızdan emin olun.

Pipeti uygun iyon seçici reçine ile geri doldurun ve pipet ucu aşağı bakacak şekilde bir kavanoz tutucuya dikey olarak dikkatlice yerleştirin. Yama sıkıştırmaya hazırlanmak için, geleneksel çift çekme protokolünü kullanarak dikey bir çektirmede dış çapı iki milimetre ve iç çapı 1,4 milimetre olan ince duvarlı borosilikat camdan yama sıkıştırma pipetlerini çekerek başlayın. Geniş bir pipet ucu yapmak için ters çevrilmiş bir mikroskop tablasına monte edilmiş bir mikro dövme kullanın.

Pipeti microforge'un kalın platin teline yakın bir yere yerleştirin. Akımı açıp kapatan bir ayak pedalı kullanarak ısıyı açın. Microforge'un kalın platin telinin ortasını kaplayan düşük erime noktalı camı ısıtın ve ardından pipet ucunu erimiş yumuşak cama yaklaştırın.

Isıtma, platin teli hafifçe merkeze doğru hareket ettirir. Platin tel başlangıç konumuna geri döner ve pipet ucu kırılır. İstenilen uç çapı elde edilene kadar işlemi tekrarlayın ve son olarak ucu düzleştirmek için ısı uygulayın.

Pipet uçları, microforge ile parlatıldıktan sonra 10 mikrometre çapındadır. Kalın platin telin kullanılması, elektriği açtıktan sonra çok az genleşme olması ve telin ve pipetin aşırı akımla aşırı ısınma olasılığının daha az olması açısından bir avantajdır. Hücreler tripsin kullanılarak ayrıştıktan ve tripsinizasyon bloke edildikten sonra, küme oluşumunu önlemek için hücreler sallanan bir çalkalayıcı üzerinde tutulur.

Bu, tripsinizasyonu takiben iki saate kadar yapılır. Elektrofizyoloji kurulumu, perfüzyon sistemindeki çözeltinin sıcaklığını düzenlemek için bir sıcaklık kontrol cihazından oluşur. Tüm deneyler yaklaşık 37 santigrat derecede gerçekleştirilir.

Ve floresan görüntüleme için filtre tekerleğini kontrol etmek için bir optik filtre değiştirici. Perfüzyon sistemi valflerinin açılıp kapanmasını düzenlemek için bir perfüzyon sistemi valf kontrolörü. Ve kayıt odasının sıcaklığını düzenlemek için sıcaklık kontrolörü.

Dalga formlarını gözlemlemek için bir osiloskop ve bir yama kelepçesi amplifikatörü. Bu Capmeter yazılımını çalıştıran bir bilgisayar. Ve iyon seçici mikroelektrot sinyalini kaydetmek için bir elektrometre.

Ve elektrometrenin sinyalini yükseltmek için bir diferansiyel amplifikatör. Elektrofizyoloji kurulumu ayrıca sahne kontrolörlü ters çevrilmiş bir mikroskop, mikroskobun sol ve sağ bölgelerine yerleştirilmiş kontrolörlü iki mikro manipülatör, inline solüsyon ısıtıcılı perfüzyon sistemi ile donatılmıştır. İyon seçici mikroelektrot pipeti mikromanipülatöre monte edildikten sonra, yama sıkıştırma pipetini hücre içi çözelti ile geri doldurun.

Solüsyonun pipetin ucuna ulaştığından emin olun. Pipetin ucundaki kabarcıkları ortadan kaldırmak için birkaç hafif dokunuş gerekebilir. Ardından yama sıkıştırma pipetini elektrofizyoloji kurulumunun baş aşamasına monte edin.

Sağlıklı görünen hücreleri, belirli bir hacimde banyo solüsyonu ile doldurulmuş kayıt odasına nazikçe aktarın. Baş aşamasını yatay eksene 45 derecelik bir açıda tutmak önemlidir. Bu, pipet için son derece dirençli bir sızdırmazlık oluşturmak için uygun bir giriş açısı sağlar.

Yama kelepçeli pipet banyo solüsyonunda indirilirken, ucu tıkama olasılığını azaltmak için pipete az miktarda pozitif basınç uygulayın. Bir hücre seçin ve ona az miktarda pozitif basınçla yaklaşın. Uç hücreye yaklaştığında yama kelepçesi pipetini hareket ettirmeyi bırakın.

Banyo solüsyonundaki iyon seçici mikroelektrodu, yama kelepçesi pipet ucunun odak düzlemi ile aynı olana kadar indirin. Pipet hücrenin üzerine merkezi olarak yerleştirildiğinde, az miktarda negatif basınç uygulayarak sızdırmazlığı başlatın. Birkaç saniye içinde mega ohm'luk bir conta elde edilir.

Tutma potansiyelinin amplifikatör tarafından sıfır milivoltta tutulduğundan emin olun. Son olarak, hücre zarını bir dizi kısa emme darbesi ile yırtın ve kayda başlayın. Dev yama kayıt yöntemini kullanarak, iyonların, lipitlerin ve proteinlerin hücre içi içeriğini değiştirmek için bir intrapipet perfüzyon sistemi aracılığıyla solüsyonları cam pipette hızlı bir şekilde perfüze etmek mümkündür.

İyon seçici mikroelektrot pipetini, yama kelepçeli pipet tarafından tutulan hücreye yakın bir yere yerleştirin ve iyon seçici mikroelektrot pipetini hücreye ve hücreden hareket ettirerek salınımını başlatın. Bu tekniğin uygulanması, sodyum-hidrojen değiştiricinin moleküler regülasyonunun incelenmesine izin verir. Dev yamalar yönteminden yararlanılarak, ATP ve lipitlerin hücre içi bileşimi bir intrapipet perfüzyon sistemi ile modifiye edildi.

Hücre içi ATP'yi hidrolize eden ve fosfoinositid içeriğini azaltan apirazın hücre içi perfüzyonu, NHE izoform üç aktivitesinde %50'lik bir azalmaya neden olmuştur. NHE3 aktivitesi üzerindeki apiraz etkisi, fosfoinositid, PIP2'nin hücre içi perfüzyonu ile tersine çevrilmedi. Bununla birlikte, fofoinositid, PIP3'ün hücre içi perfüzyonu ile tersine çevrildi.

NHE aktivitesinin ölçümü, proton seçici mikroelektrot ve yama sıkıştırma yöntemlerinin birleştirilmesinden yararlanır. Bu, NHE'nin fosfoinositidler ve aşağı akış sinyal kaskadları tarafından diferansiyel regülasyonunun arkasındaki moleküler temelin incelenmesine izin verir. Bu videoyu izledikten sonra, tüm hücre yaması kenetleme ile birlikte salınımlı bir pH mikroelektrodu kullanarak sodyum-proton değiştiricinin aktivitesini nasıl ölçeceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Ve yöntemlerin olası uygulamasına bir örnek.