Name: Elektrofizyoloji ölçüm uygulanması elektro-tarafsız taşıyıcılar etkinlik çalışması için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Öğrenin, dev yamaç ve iyon seçici mikroelektrotlar kullanarak NHE aktivitesini ölçme yöntemini. Bu teknik, hücre zarındaki proton akışını hassasiyetle tespit eder ve sinirbilim araştırmalarında iyon taşıma mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Eric Fishback (Des Moines Üniversitesi, Des Moines, Iowa, ABD) çekim ve düzenleme video ile onun yardım için teşekkür etmek istiyorum. Stabil NHE3-wt veya NHE3-YRK ifade PS120 fibroblast benzeri hücreleri nazikçe Dr Mark Donowitz (Johns Hopkins Üniversitesi Tıp Fakültesi, Baltimore, MD, ABD) tarafından temin edilmiştir.

Not: İki amplifikatörler sıkma, tüm hücreli yapılandırma ve bir yüksek impendence amplifikatör (hücrede korumak için bir yama kelepçe amplifikatör yama ile birlikte electroneutral taşıyıcılar self-referencing İMKB tarafından etkinliği kaydetmek için gerekli olan electrometer İMKB yoluyla ışınlama etkinliklerini kaydetmek için) (tablo malzemeleri görmek). Yama kelepçe amplifikatör satın alma kurulu terminal doğrudan bağlıdır. Electrometer filtre ve sinyali yükseltmek için kullanılan fark amplifikatör bağlıdır. Fark amplifikatör terminal edinme kuruluna bağlı. Capmeter, hücre kapasitesi, izler yama kelepçe yazılım önceki çalışmalar20 dakika içinde kullanılan (tablo malzemeleri görmek). Kayıt odası ve perfüzyon çözümleri 37 ° C'de tutulur
1. hazırlanması Pipetler sorunum için
<ol><li>Borosilikat cam kılcal üzerinden Pipetler bir dış çap 1.2 mm için çek ( Tablo malzemelerigörmek) pipet çektirme2 kullanarak.</li>
	<li>Microforge kullanarak pipet Lehçe. Pipet ucu çapının 2-3 µm olmalıdır.</li>
	<li>Pipetler bir kavanoz tutucu Pipetler için (bkz: Malzemeler tablo) karşı karşıya pipet ucu yerleştirin. Dikkat: 1.4-1.6 iyi havalandırılmış kimyasal duman mahallede adımları izleyerek.</li>
	<li>BIS (dimetilamino) Dimetil silane ve karbon tetraklorür 10 damla 1 damla (~ 150 µL) oluşan siliconization karışımı karışımı ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>Siliconization karışımı kavanozun içine dökün ve kapağını sıkıca kapatın.</li>
	<li>Karışım tamamen buharlaşıp kadar kavanoz için 24-48 h kimyasal duman başlıklı oda sıcaklığında siliconization karışımı ile kuluçkaya.</li>
	<li>Yaklaşık 2-4 mm bir sütun oluşturmak için uygun iyon-seçici reçine ile pipet tamamlanmıyor. Not: Hidrojen ionophore ben kokteyl B usedfor kayıt NHE etkinlik olabilir ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>Pipet ucu iyon-seçici reçine dağıtmak için ucu dokunun ve pipet pipet ucu kavanoz tutucu dikey olarak yerleştirin.</li>
	<li>Checkunder reçine kokteyl ucunu sonuna ulaştı diseksiyon mikroskop. Gerekirse, reçine sonuna kadar itmek için pozitif basınç uygulayın.</li>
	<li>Backfill yarı-pipet ile uygun bir çözüm (~ 100 μL). Burada, 100 mM KCl ve 10 mM HEPES pH 7,0 ionophore kullanıyorsanız kullanın ben kokteyl B.</li>
	<li>İMKB için electrometer bağlamak ve kayıt için kullanılan banyo çözüm İMKB ucu yerleştirin. Electrometer sıfır.</li>
	<li>H+test-banyo çözüm pH değiştirerek seçici İMKB yanıt. Ortalama H+-seçici İMKB yanıttır ~ 58 mV pH birimi başına.</li>
	<li>Düzenli olarak kalibrasyon İMKB yanıtı değerlendirmek.</li>
</ol>2. yama kelepçe hazırlanması için kayıt Pipetler
Not: Donald Hilgemann tarafından yazısında tek kanallı kayıt21 tarihinde açıklanan yöntemi önerilir.
<ol><li>Pipetler borosilikat cam kılcal gelen dev yama için çek (2.0 mmOD / 1.5 mm kimlik) pipet çektirme2,22,23.</li>
	<li>Kullanım bir microforge geniş pipet ucu (10-22 mikron)23yapmak ters bir mikroskop sahnede monte. Bir boncuk erime (~ 0.5 mL) microforge yumuşak cam kalın Platin tel üzerine. Not: Nispeten kalın bir platin tel gereklidir (dev yama Pipetler imal etmek ~0.5 mm).</li>
	<li>Yumuşak cam boncuk yakın yama pipet getirin ve çekilmek belgili tanımlık uç başlayana kadar tam ısı uygulayın. Platin tel biraz Isıtma centerduring doğru hareket eder.</li>
	<li>Isı kapatın ve pipet ucu yumuşatılmış cam boncuk itin. Soğutma tel geri çekmek ve pipet ucu kesin.</li>
	<li>Pipet ucu düz ve istenilen çap pipet ucu oluşturmak için ısı yeniden uygulayın. Uç çapı bağlı olmak hücre boyutunu (Bu çalışmada 8-10 mikron) yamalı.</li>
</ol>3. hücre hazırlanması
<ol><li>Fosfat tampon serum (PBS) Ca2 + ve Mg2 +, tripsin-EDTA çözüm ve büyüme Orta olarak 37 ° C'de ısıtın</li>
	<li>Hücreleri iki kez PBS ile yıkayın. Arabellek 1 mL 35 mm çap hücre kültür plaka için kullanın.</li>
	<li>Tripsin 0.5 mL 35 mm çap hücre kültür plaka için hücreleri ekleyin. Not: hücreler yuvarlak-up, de-hücreleri eklemek plaka sallamak başlattığınızda.</li>
	<li>Tripsin eylem 5 mL (35 mm çap hücre kültür plaka için tutar) % 10 fetal sığır serum ile desteklenmiş tam büyüme ortamının ekleyerek durdurun. Not: Tripsin reaksiyon zamanında hücre-türüdür bağımlı.</li>
	<li>Hücreleri kümeleri oluşumunu önlemek için sallanan ile bir sallamak yerleştirin.</li>
	<li>Hücreleri trypsinization sonra en fazla 2 saat için kullanın. Not: Zaman hücre kültürünü bağlı olarak değişebilir.</li>
</ol>4. bir Intra-pipet perfüzyon sistemi hazırlanması
<ol><li>Uygun bir boyut kuvars Boru kesme (150 µm OD / 75 µm kimliği) içi-pipet perfüzyon çizgi hazırlamak için.</li>
	<li>Kuvars hortumunun bir tarafı 200 µL pipet ucu yerleştirin. Kuvars boru ucu üzerine tutkal ve ucu keskin bir ustura ile sonunda kesti.</li>
	<li>Intra-pipet perfüzyon çözüm için bir depo olarak hizmet verecek silikon tüp küçük bir parça için perfüzyon hattı (kuvars boru ucuna kadar yapıştırılmış) bağlayın.</li>
	<li>Silikon tüp artı basınç için bir şırınga bağlayın.</li>
	<li>Kuvars boru polietilen boru perfüzyon pipet sahibinin aracılığıyla ücretsiz sonu port ( Tablo malzemelerigörmek) Ekle.</li>
	<li>Pipet çözüm perfüzyon satırıyla değerlendirin.</li>
</ol>5. hazırlık çözümleri
<ol><li>Bir ağır tamponlu pipet çözüm NHE (115 mM potasyum Aspartat (KAsp), 1 mM EGTA, 0,5 mM MgCl2, 10 mM Mg-ATP, 12,5 mM HEPES, 12,5 mM borular, 12,5 mM BEZLERİ ve 12.5 mM MES, aspartik asit ile ayarlanır pH 6.0) kaydetmek için hazır olun. Not: stok pipet çözüm ve filtre hazırlayın. MG-ATP kayıt önce ekleyin.</li>
	<li>Bir taze banyo çözüm (140 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2ve 0,1 mM Tris-HCl pH 8.2) her zaman hazır olun.</li>
</ol>6. kayıt ışınlama aktivitesi
<ol><li>Işınlama aktivitesi sıcaklık bağımlı olduğundan kayıt odası ve 37 ° C'de tüm çözümleri korumak.</li>
	<li>Hücreleri kayıt odasına koyun. Beklemek-e kadar onlar odası altına bırakın ama izin verme odasına iliştirin.</li>
	<li>Uygun bir hücre seçin. Hücre çapı ile oküler mikrometre ölçmek. Benzer çapları içeren hücreleri seçin. Not: Genellikle, büyük bir hücre daha hücresel yüzey ve muhtemelen daha fazla taşıyıcı böylece da daha fazla ışınlama aktivitesi having onun plazma membran üzerinde ifade olacaktır. Belirli taşıyıcı ve hücre tipi altında eğitim ışınlama aktivitesi bağlıdır gibi Ancak, bu mutlaka doğru değildir.</li>
	<li>İyon-seçici elektrot pipet micromanipulator için mount, backfill yama sıkma pipet ile hücre içi çözüm çözüm2pipet ucu ulaştığından emin olun. Not: Pipet ucu kabarcıkları ortadan kaldırmak için birkaç nazik musluklar gerektirebilir.</li>
	<li>2,22,23kadar set Elektrofizyoloji baş aşaması için yama sıkma pipet bağlayın. Not: Bu son derece dayanıklı bir mühür oluşumu için uygundur pipet için bir giriş açısı sağlar gibi bu baş aşamada 45 derecelik bir açı hakkında yatay eksenine tutmak önemlidir.</li>
	<li>Küçük bir pozitif basınç uygulayın (~ 5 cm H2O) için belgili tanımlık uç engelleme olasılığını azaltmak ve banyo çözüm içine yerleştirmek için yama pipet.</li>
	<li>Ucu yakın hücre olduğunda yama kelepçe pipet hareket etmeyi kes.</li>
	<li>Pipet hücre dokunur ise pozitif basınç rahatlatmak ve hafif negatif basınç uygulayın (~ 5 cm H2O) elde etmek için bir &gt; 1000 MΩ (Giga-ohm) mühür yama ile hücre zarı üzerinde pipet23.</li>
	<li>Yama pipet hücre ile aynı odak düzlemi İMKB olarak yerleştirin ve yama pipet ile İMKB yakınlığı hücreye taşımak (~ 5-10 µm)2,5 ama kaçının hücre İMKB (şekil 1A) iletişim için izin verir.</li>
	<li>Holding potansiyel 0 temin mV.</li>
	<li>Bütün hücre yapılandırmasını almak için kısa suctions serisi ile mühür rüptürü.</li>
	<li>İMKB (veya yama kelepçe pipet) hareket yavaş yavaş sağa ve sola veya yukarı-aşağı ışınlama (şekil 1B) etkinliklerini kaydetmek için.</li>
	<li>En az 5-8 doruklarına kaydetmek (şekil 1 c, B a).</li>
	<li>Kare dalga rezonans mühür ve hücre zarının kapasite (şekil 1) kalitesini izlemek için kayıt sırasında uygulanır.</li>
	<li>H+ akı tahmin (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq1.jpg">) ücretsiz H+ konsantrasyonu hücre yüzeyine ve toplu bir çözüm (ΔH+) arasındaki farkı üzerinden <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq3v2.jpg"> Not: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq4.jpg"> ve <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq5.jpg"> h+ ve Difüzyon katsayıları sırasıyla, tampon BT toplam arabellek konsantrasyon, KD arabelleği ayrılma sabittir, r hücre RADIUS, ve <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq6.jpg"> ilişkili H+ ücretsiz H+küçük bir değişiklik için konsantrasyon kararlı durum değişikliği belirler. H+ çözümünde ücretsiz bir proton gösterir. Önceki çalışmalar ile tutarlı olacak şekilde H+ Cerayanlar Elektrofizyolojik akı birimlerine Cerayanlar geçerli karşılıkları hesaplayarak dönüştürülür (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq1.jpg">/faraday) pA3,5].</li>
	<li>Hücre boyutu hesaplanan hücre yüzeyine veya membran kapasitans proton akı normalleştirmek.</li>
</ol>

<ol><li>Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiating+SLC+transporter+activity%3A+Emerging+drug+discovery+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities.</a> Biochem Pharmacol. , (2017).</li>
<li>Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+fluxes+in+giant+excised+cardiac+membrane+patches+detected+and+quantified+with+ion-selective+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ion fluxes in giant excised cardiac membrane patches detected and quantified with ion-selective microelectrodes.</a> J Gen Physiol. 121 (4), 325-347 (2003).</li>
<li>Babich, V., Vadnagara, K., Di Sole, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biophysical+and+molecular+basis+of+intracellular+pH+sensing+by+Na%2B%2FH%2B+exchanger-3%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">The biophysical and molecular basis of intracellular pH sensing by Na+/H+ exchanger-3.</a> FASEB J. 27 (11), 4646-4658 (2013).</li>
<li>Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steady-state+function+of+the+ubiquitous+mammalian+Na%2FH+exchanger+%28NHE1%29+in+relation+to+dimer+coupling+models+with+2Na%2F2H+stoichiometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Steady-state function of the ubiquitous mammalian Na/H exchanger (NHE1) in relation to dimer coupling models with 2Na/2H stoichiometry.</a> J Gen Physiol. 132 (4), 465-480 (2008).</li>
<li>Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-+and+mechanosensitivities+of+sodium%2Fhydrogen+exchangers+analyzed+by+electrical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Lipid- and mechanosensitivities of sodium/hydrogen exchangers analyzed by electrical methods.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (28), 10482-10487 (2004).</li>
<li>Forster, I. C., Virkki, L., Bossi, E., Murer, H., Biber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrogenic+kinetics+of+a+mammalian+intestinal+type+IIb+Na%28%2B%29%2FP%28i%29+cotransporter%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrogenic kinetics of a mammalian intestinal type IIb Na(+)/P(i) cotransporter.</a> J Membr Biol. 212 (3), 177-190 (2006).</li>
<li>Smith, P. J., Trimarchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+measurement+of+hydrogen+and+potassium+ion+flux+from+single+cells+and+epithelial+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Noninvasive measurement of hydrogen and potassium ion flux from single cells and epithelial structures.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C1-C11 (2001).</li>
<li>Parker, M. D., Musa-Aziz, R., Boron, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+extracellular%2C+ion-selective+microelectrodes+to+study+the+function+of+heterologously+expressed+transporters+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The use of extracellular, ion-selective microelectrodes to study the function of heterologously expressed transporters in Xenopus oocytes.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 296 (5), C1243(2009).</li>
<li>Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmith%2C+PJS+%22Electrochemical+Methods+for+Neuroscience%22">Electrochemical Methods for Neuroscience</a>. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC Press/Taylor & Francis. 373-406 (2007).</li>
<li>Orlowski, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+the+mammalian+sodium%2Fproton+exchanger+SLC9+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Diversity of the mammalian sodium/proton exchanger SLC9 gene family.</a> Pflugers Arch. 447 (5), 549-565 (2004).</li>
<li>Brett, C. L., Donowitz, M., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+origins+of+eukaryotic+sodium%2Fproton+exchangers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 288 (2), C223-C239 (2005).</li>
<li>Bobulescu, I. A., Di Sole, F., Moe, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B%2FH%2B+exchangers%3A+physiology+and+link+to+hypertension+and+organ+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Nephrol+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Na+/H+ exchangers: physiology and link to hypertension and organ ischemia.</a> Curr Opin Nephrol Hypertens. 14 (5), 485-494 (2005).</li>
<li>Donowitz, M., Ming Tse, C., Fuster, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLC9%2FNHE+gene+family%2C+a+plasma+membrane+and+organellar+family+of+Na%28%2B%29%2FH%28%2B%29+exchangers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na(+)/H(+) exchangers.</a> Mol Aspects Med. 34 (2-3), 236-251 (2013).</li>
<li>Zachos, N. C., Tse, M., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+physiology+of+intestinal+Na%2B%2FH%2B+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Molecular physiology of intestinal Na+/H+ exchange.</a> Annu Rev Physiol. 67, 411-443 (2005).</li>
<li>Girardi, A. C., Di Sole, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+mechanisms+of+the+Na%2B%2FH%2B+exchanger-3+regulation+in+organ+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Deciphering the mechanisms of the Na+/H+ exchanger-3 regulation in organ dysfunction.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 302 (11), C1569-C1587 (2012).</li>
<li>Bobulescu, I. A., Moe, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B%2FH%2B+exchangers+in+renal+regulation+of+acid-base+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Na+/H+ exchangers in renal regulation of acid-base balance.</a> Semin Nephrol. 26 (5), 334-344 (2006).</li>
<li>Hilgemann, D. W., Feng, S., Nasuhoglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+and+intriguing+lives+of+PIP2+with+ion+channels+and+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">The complex and intriguing lives of PIP2 with ion channels and transporters.</a> Sci STKE. (111), re19(2001).</li>
<li>Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NHE3+activity+is+dependent+on+direct+phosphoinositide+binding+at+the+N+terminus+of+its+intracellular+cytosolic+region%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">NHE3 activity is dependent on direct phosphoinositide binding at the N terminus of its intracellular cytosolic region.</a> J Biol Chem. 285 (45), 34566-34578 (2010).</li>
<li>Alexander, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+surface+charge+dictates+the+structure+and+function+of+the+epithelial+Na%2B%2FH%2B+exchanger%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Membrane surface charge dictates the structure and function of the epithelial Na+/H+ exchanger.</a> EMBO J. 30 (4), 679-691 (2011).</li>
<li>Wang, T. M., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca-dependent+nonsecretory+vesicle+fusion+in+a+secretory+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ca-dependent nonsecretory vesicle fusion in a secretory cell.</a> J Gen Physiol. 132 (1), 51-65 (2008).</li>
<li>Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHilgemann%2C+DW+%22Single-Channel+Recording%22">Single-Channel Recording</a>. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 307-328 (1995).</li>
<li>Hilgemann, D. W., Lu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+membrane+patches%3A+improvements+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Giant membrane patches: improvements and applications.</a> Methods Enzymol. 293, 267-280 (1998).</li>
<li>Matsuoka, S., Takeuchi, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMatsuoka%2C+S+%22Patch+Clamp+Techniques%22">Patch Clamp Techniques</a>. Okada, Y. , Springer. 207-218 (2012).</li>
<li>Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+mutation+abolishing+Na%2B%2FH%2B+antiport+activity+in+hamster+fibroblasts+precludes+growth+at+neutral+and+acidic+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).</li>
<li>Ogden, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVoipio%2C+J+%22Microelectrode+Techniques+-+The+Plymouth+Workshop+Handbook%22">Microelectrode Techniques - The Plymouth Workshop Handbook</a>. , The Company of Biologists Ltd. 275-316 (1994).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Işınlayıcılar çok önemli işlevler rağmen faaliyetlerini incelemek kullanılabilir olan yöntemlerden etkisiz ve yetersiz. Kullanılabilir yöntemleri iyon hareketi sırasında deney4hücre içi iyon kompozisyon dalgalanmalar dikkate almadan ışınlama aktivitesi tarafından aracılı ölçmek bir kısıtlamadır. Sunulan yöntem ekstraselüler ve hücre içi iyon bestelerinden hassas kontrol sağlar ve hücre içi iyon, protein ve lipit kompozisyonları3,4,</s...

Taşıma iyonları ve solutes plazma zarı arasında hücre ve dolayısıyla, organizmalar1yaşam için önemlidir. Seçici taşıma iyonları ve solutes bir dizi özel kanal ve taşıyıcı proteinler tarafından sağlanır. Bu proteinler mutasyonların kez klinik koşulları, kanal ve taşıyıcı proteinler potansiyel hedefleri farmakolojik tedavi1için işleme çeşitli neden. Ne yazık ki, kanal ve ışınlama işlevi ve yönetmelik temel mekanizmaları anlama kez onların etkinlik2,3,4eğitim kullanılabilir yaklaşımlar tarafından sınırlıdır.
Özellikle, ışınlayıcılar kabaca olup onlar solutes taşıma sırasında hücre transmembran potansiyel alter bağlı olarak iki büyük gruba alt ayrılabilir: değiştirmek aşağıdaki sonuçlara yolaçabilir electrogenic iyon taşıyıcıları [Örneğin, sodyum-fosfat Co ışınlama 2a (NaPi2a), sodyum kalsiyum Eşanjör (NCX), vs.] veya electroneutral iyon değiştirme Işınlayıcılar [Örneğin, sodyum-proton Eşanjör (NHE), Sodyum Klorür co ışınlama odası, NaPi2c, vb.]. Taşıma araçları her iki çeşit faaliyetlerinin yoğun alımını radyoaktif izotoplar kullanılarak incelenmiştir ve floresan membran-permeant2boya. Her iki yaklaşımın belirli sitoplazmik iyonları toplu konsantrasyonu değişiklikleri ölçerek taşıyıcılar aktivitesini tahmin etmek, ve her iki yöntem kısıtlamaları, ılımlı duyarlılık ve zaman çözünürlüğü ve hücre içi yetersiz kontrolü gibi çevre. Gerçekten de, birçok taşıyıcıları etkinliği (Örneğin, NHE3, NCX) taşınan iyonların sitoplazmik konsantrasyon bağımlı olduğunu ve bu iyon konsantrasyonlarının değişimler ışınlama aktivitesi2 düzenlenmesinde önemli bir rol oynaması bekleniyor , 3 , 5. bu düzenleyici mekanizmaları hassas ölçümdür klasik yöntemlerle sınırlı.
Bu sınırlamalar üstesinden gelmek için yama kelepçe yöntemleri ışınlama aktivitesi2,6incelemek için kullanılır. Özellikle, sistem sıkma yama ile kombine self-referencing iyon-seçici elektrot (sorunum)7,8 son zamanlarda electroneutral ışınlama aktivitesi3,4 ölçümü sağladı , 5. sorunum vardır yakınında hücre membran bir iyon degrade ışınlama aktivitesi oluşturur gerçeğine dayanır. Taşımak ve hücre zarının bir tekrarlayan içinde uzak bir İMKB salınım moda bir gerilim farkı (µV) kaydeder. Gerilim farkları Difüzyon2,9Fick'ın ilk hukuk uygulayan bir kalibrasyon yöntemiyle iyon akı değerleri dönüştürülebilir. Sorunum ise dışarı-in hareket iyonları akı algılamak, hücreleri yama kelepçe yöntemi her iki bütün hücredeki veya iç-out yapılandırmaları membran potansiyeli ve hücre içi iyon kompozisyon denetlemek için kullanılır. Ayrıca, dev yama klemp tekniği uygulama sadece da lipidler ve proteinler3,5iyonları hücre içi bileşimi modifikasyonu sağlar.
Özetle, yama kelepçe yöntemi çok yönlülüğü ile çalışmak için diğer yöntemleri yama bu yöntemlerin ortak sınırlamaları aşmak uygun sıkma ışınlama aktivitesi yaptı karşılaştırıldığında. Kendi kendine referans sorunum ve yama kelepçe teknikleri ile birlikte electroneutral taşıyıcılar sıkı şekilde denetlenen bir deneysel ortamda etkinliğini ölçmek için ve roman biyofiziksel ve moleküler keşfetmek için benzersiz imkanı sunuyor Hücre zarı özellikleri3,4,5ulaşım. Bu yaklaşım, etkinliği NHE ile çalışmaya başarıyla kullanılmıştır. Memeli NHE protein ailesi ekstraselüler sodyum (Na+) electroneutral net değişimi için hücre içi proton (H+)10,11 bir içe Na+ degrade kullanan tromboksan. Memelilerde, 11 ilgili proteinler (NHE1-9 ve NHA1-2) ve sperm özgü NHE10,12,13NHE protein ailesi içerir.
NHEs (SLC9a aile) ubiquitously basit prokaryot gelen en canlı organizmalar daha yüksek Ökaryotlar bulunur ve hücre tuzluluk savunmak için kontrol dahil olmak üzere önemli hücre fonksiyonları10,11, çeşitli yer alırlar prokaryot, asit-baz homeostazı ve hücre Cilt Bakımı ve çeşitli özel epiteli10,12,14,15dakika sonra tuz ve su emilimini düzenleyen. NHEs kilit biyolojik rolü ve önemi işlevlerini çeşitli çalışmalar sayesinde tespit edilmiştir; Ancak, birkaç çalışmaları metodolojik sınırlamalar4nedeniyle memeli NHEs biyofiziksel ve moleküler özelliklerini araştırdı. Son zamanlarda, sorunum bütün hücreli yama sıkma sırasında kendi kendine başvuru uygulama değişiklikleri iyonları, proteinler ve fosfolipitler3hücre içi konsantrasyonlarda sahiplenilip NHE izoformlarının roman moleküler mekanizmaları ortaya koymuştur, 4.
Özellikle, bu el yazması gelen doğrulama yöntemleri ve etkinlik düzenlenmesi ve NHE izoformu 3 (NHE3), Na+, Cl-, HCO3- ve sıvı emme önemli bir oyuncu eğitimi için yaklaşımlar önerilmektedir Fırça sınır membran böbrek ve bağırsak epiteli14,16. NHE3 faaliyet duyarlılık farklar için hücre içi phosphoinositides içine yeni bir bakış açısı (phosphatidylinositide 4, 5-bisphosphate [PI (4,5) P2] ve phosphatidylinositide 3,4,5-trifosfat [PI(3,4,5]P3]) bildirdi. Cep taşıma proteinler, kanallar ve ışınlayıcılar, gibi phosphoinositides17tarafından düzenlenir ve NHE3 doğrudan PI (4,5) P2 ve PI (3,4,5) P318bağlar. Geçerli edebiyat bağlı olarak, her iki fosfoinositid NHE35,18,19fizyolojik veya patofizyolojik düzenleme için ilgili olabilir. Cihazla ilgili izlenimlerimizi PI (4,5) P2 ve PI (3,4,5) P3 NHE3 faaliyetinin yönetmelikte ayrı roller destekler. Bu ayrım yüzünden bütün hücreli yama kelepçe kayıt ile birlikte İMKB tekniklerin uygulanması. Bu teknik aynı zamanda fosfoinositid hücresel memnun yolu ile farklı phosphoinositides hücre içi perfüzyon NHE3 etkinlik ölçümü sırasında kontrolünü sağlar.

<table><tbody><tr><td>Yama kelepçesi Amplifikatör Moleküler</td><td>Cihazlar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çift Kanallı Diferansiyel Elektrometre (HiZ-223)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1650</td><td></td></tr><tr><td>Diferansiyel Amplifikatör (DP-301)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0044</td><td></td></tr><tr><td>MatLab Tabanlı Yama Kelepçesi Yazılımı</td><td>MatLab edinme araç kutusu</td><td></td> ile <td>Kapmetre yazılımı önerilir</td></tr><tr><td>ThermoClamp-1 Sıcaklık Kontrol Sistemi</td><td>&nbsp; AutoMate Scientific</td><td>03-11-LL</td><td>Sıralı ısıtıcı</td></tr><tr><td>Tek Kanallı Sıcaklık Kontrol Cihazı (TC-324C)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-2400</td><td></td></tr><tr><td>Tek Namlulu Standart Borosilikat Cam Boru</td><td>Dünyası Hassas Aletler</td><td>1B120F-3&nbsp; &nbsp;</td><td>İyon seçici elektrotlar için kullanılır</td></tr><tr><td>Mikropipet Saklama Kavanozu</td><td>Dünyası Hassas Aletler</td><td>E212</td><td></td></tr><tr><td>Bis (dimetilamino) dimetilsilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14755-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Karbon tetraklorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319961-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Hidrojen iyonofor I - kokteyl B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95293</td><td></td></tr><tr><td>İnce Duvar Borosilikat Boru</td><td>&nbsp; Sutter Instrument</td><td>B200-156-15</td><td>Yama kelepçesi pipeti için kullanılır&nbsp;</td></tr><tr><td>Yumuşak cam (Corning 8161 Yama Camı)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0815</td><td></td></tr><tr><td>Silika Kılcal Boru (150um OD / 75um ID)</td><td>Molex (Polymicro Technologies)</td><td>106815-0018</td><td>Pipet içi perfüzyon sistemi için kullanılır</td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum aspartat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6558</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4880</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>BORULAR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6535</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatidilinositol(4,5) bifosfat diC8</td><td>Echelon Biyolojik Bilimler</td><td>P-4508</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatidilinositol 3,4,5-trisfosfat diC8</td><td>Echelon Biosciences</td><td>P-3908</td><td></td></tr></tbody></table>

elektrofizyoloji ölçüm uygulanması elektro-tarafsız taşıyıcılar etkinlik çalışması için

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

İyonlarının hücre membranlar yoluyla taşıma iyon içeriği içinde ve hücre yaşam için vazgeçilmez bir hücre dışında ayrıntılı denetimini sağlar. Bu taşıma mekanizmaları özel taşıyıcı proteinler faaliyetleri tarafından aracılık. Özellikle, pH dynamics ince Na+gibi plazma zarı proton (H+) ekstrüzyon sistemleri tarafından kontrol edilir/h+ Eşanjör (NHE) protein ailesi. NHE yönetmelik temel mekanizmaları incelemek için kapsamlı çabalarına rağmen geçerli anlayışımız NHE aile biyofiziksel ve moleküler özelliklerinin etkili NHE etkinliği ölçmek için yöntemler sınırlı yer nedeniyle yetersiz . Bu makale, kullandığımız H+-bütün hücreli sırasında seçici elektrot yama NHE kaynaklı H+ akı ölçmek için sıkma kayıt. Biz genellikle bazı sınırlamaları aşmak için bu yaklaşım yöntemleri radyoaktif uptake ve floresan membran permeants gibi NHE etkinliği ölçmek için kullanılan önerdi. Açıklanan yöntemi kullanarak NHE etkinliğini ölçümü yüksek hassasiyet ve zaman çözünürlüğü ve hücre içi H+ konsantrasyonları daha verimli kontrolünü sağlar. H+-seçici elektrotlar vardır yakınında hücre membran bir iyon degrade ışınlama aktivitesi oluşturur gerçeğine dayanır. Bir H+-seçici elektrot kadar hareketli ve hücre zarının bir tekrarlayan, salınım moda uzakları H+ akı üzerinde bağımlı bir gerilim farkı kaydeder. Süre H+-seçici elektrot hareketli hücreden yama kelepçe yöntemi tüm hücreli yapılandırma hücre içi iyon kompozisyon denetlemek için kullanılır H+ akı algılamak için kullanılır. Ayrıca, dev yama klemp tekniği uygulanması sadece da lipidler iyonları hücre içi bileşimi modifikasyonu sağlar. Işınlama aktivitesi NHE izoformu 3 (NHE3), moleküler temelini NHE3 yönetmelik çalışması için bu teknik yaklaşım kullanarak phosphoinositides tarafından ölçüldü.

Bütün hücre yama kelepçe kayıt sırasında self-referencing İMKB NHE3 etkinlik düzenlenmesi çalışmaya phosphoinositides tarafından uygulanmıştır. Endojen plazma zarı NHEs ifade eksikliği, PS120 fibroblast benzeri hücreler24, kullanılmıştır. NHE3 vahşi-türü (NHE3-wt) veya NHE3 mutantlar bunu yapmamalıydın [tirozin 501, arginin 503 ve lizin 505 yerine alanin ile Y501A/R503A/K505A (NHE3-YRK)] bind phosphoinositides stabil PS120 fibroblast benzeri hücreler<sup class="xre...

Bu el yazması proton taşıma sistemlerinin etkinliğini ölçmek için proton-seçici elektrot ve yöntemleri sıkma yama uygulamaları açıklar. Bu yöntemleri teknikleri proton taşıma etkinlik, ılımlı duyarlılık, zaman çözünürlüğü ve yetersiz hücre içi ortam denetimi gibi çalışma için yaygın olarak kullanılan bazı sınırlamalarının üstesinden gelir.

Elektrofizyoloji ölçüm uygulanması elektro-tarafsız taşıyıcılar etkinlik çalışması için

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

İyon seçici mikroelektrotlarla birleştirilmiş dev yamalar yöntemi, iyon akışlarını tespit etmek ve miktarını belirlemek için kullanılan çok yönlü bir yöntemdir. Spesifik olarak, hücre zarı üzerinde eksprese edilen elektro-nötr iyon taşıyıcısı, sodyum-hidrojen değiştiricisi veya NHE'nin aktivitesi tarafından üretilen proton akışlarını ölçmek için kullanılır. Sodyum-hidrojen değiştirici, plazma zarına yakın bir yerde, burada turuncu bir halka olarak gösterilen bir proton gradyanı üretir.Hücre zarı boyunca bu proton gradyanı, bir proton seçici mikroelektrot kullanan bir teknikle birleştirilmiş tüm hücre yama kelepçesi kaydı ile ölçülür. Proton seçici mikroelektrot, hücre yüzeyine yakın bir yere hareket ettirilir, burada hücrelerden dışarı çıkan protonların akısını kaydeder, burada A konumunda gösterilir. Ve hücre yüzeyinden uzağa, burada B konumu ile gösterilen çözeltide bulunan serbest proton konsantrasyonunu kaydeder. Ve sonra, hücre zarına yakın A konumuna geri döner, tekrarlayan, salınımlı bir harekette. A'dan B'ye voltaj farkı kaydedilir ve NHE aktivitesinin temsilcisine bağlıdır.Hücre zarı boyunca protonlar gibi taşıyıcı iyonlar, yaşam için gerekli olan süreci etkiler. Bu nedenl

application-electrophysiology-measurement-to-study-activity-electro

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Aynı anda birden fazla iyon kanalları aracılığıyla mevcut akı ölçüm teknik engeller ve transmembran akım daha sonra seçici hangi bölümünü her kanal tipi nedeniyle. Bu ihtiyacı karşılamak için, bu yöntem belirli frekans bileşenleri kullanarak tek tek kanal türleri IV eğrisi oluşturmak için bir yol sunar.

Frekans Bileşenleri kullanarak bir İyon Kanal IV Eğrisi, Rekapitülasyon

Xenopus oositlerindeki enzimlerin heterolog ekspresyonu ve atomik absorpsiyon spektrofotometrisi ile tek tek hücrelere Rb+ veya Li+ alımını ölçerek K+-karşı taşıyıcı P-tipi ATPazların aktivitesini ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz. Yöntem, karmaşık kinetik çalışmaları kolaylaştıran radyoizotop akı deneylerine hassas ve güvenli bir alternatiftir.

Na, K ve H, K-ATPaz bölgesindeki tarafından Katyon Taşıma Ölçüm<em&gt; Xenopus</emAtomik Absorpsiyon Spektrofotometresi ile&gt; Oosit: Radyoizotop Tahliller Alternatif Bir

Burada Elektrojenik membran nakil karakterizasyonu için uygulamaları odaklı sağlam desteklenen membranlar dayalı bir elektrofizyolojik yöntem mevcut.

Elektrofizyoloji Tabanlı Katı Desteklenen Membran Giriş

Kapalı döngü protokolleri günümüz elektrofizyolojisinde giderek yaygınlaşmaktadır. Kortikal piramidal nöronlarda in vitro olarak karmaşık elektrofizyolojik protokolleri gerçekleştirmenin basit, çok yönlü ve ucuz bir yolunu sunuyoruz.

Gerçek zamanlı Elektrofizyoloji: Probe Nöronal Dynamics ve Ötesi Kapalı çevrim Protokolleri Kullanma

Bu makalenin ilk bölümü, plazma zarlarında veziküler Na+/H+ değiştiricileri eksprese eden mutant hücre hatlarının nasıl seçileceğini gösterir. İkinci bölüm, bu değiştiricilerin iyon seçiciliğini ve kinetik parametrelerini belirlemek için kullanılan hücre içi pH ölçümlerine ve hızlı iyon alımına dayalı protokoller sağlar.

Na fonksiyonel karakterizasyonu<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Seçim Proton-öldürme Kullanma hücre içi Bölmeler ve Eşanjörleri Plazma Membran Them Express

Hücre zarlarındaki taşıyıcılar, iyonların hücre zarları veya hücre katmanları boyunca diferansiyel ayrışmasına izin verir ve doku fizyolojisi, onarımı ve patolojisi sırasında çok önemli roller oynar. Tek hücrelerde ve dokularda spesifik iyon akışlarının in vivo olarak ölçülmesine izin veren iyon seçici kendinden referanslı mikroelektrotu açıklıyoruz.

İyon seçici Kendinden referans Mikroelektrod Tekniği Ekstraselüler Ion eriticiler Ölçümü

Beyin dokusundaki iyon konsantrasyonlarının ölçümü için iki tip iyon seçici mikroelektrotun (çift namlulu ve eş merkezli) üretimini, kalibrasyonunu ve özelliklerini gösteriyoruz. Bunlar daha sonra uyarıcı aktivitenin hem hücre dışı potasyum hem de sodyum konsantrasyonlarını değiştirdiğini göstermek için fare hipokampal dilim hazırlığında kullanılır.

Beyin Dokusu Ölçme Ekstraselüler Ion Sinyalleri için Çift namlulu ve Konsantrik Mikroelektronlar

Elektrofizyolojik ölçümlerde ters potansiyel hassas ölçüm elektrot potansiyel değiştirerek bir difüzyon potansiyel varlığı rahatsız ediyor. Bir mikro-agar tuz Köprüsü kullanarak, potansiyel difüzyon etkisini, hangi Sulandırılan rekombinant membran proteinlerinin substrat ciro sayıda daha hassas bir ölçüm sağlar küçültülür.

Rekombinant membran proteinlerinin Proton ciro oranı analiz etmek için bir mikro-agar tuz Köprüsü elektrot

Nanobodies yapısal biyolojide önemli araçlardır ve tedavilerin gelişimi için büyük bir potansiyel oluşturur. Bununla birlikte, inhibitör özelliklere sahip nanobodies seçimi zor olabilir. Burada elektrojenik membran taşıyıcılarını hedefleyen inhibitör ve inhibitör olmayan nanobodların sınıflandırılması için katı destekli membran (SSM) tabanlı elektrofizyolojinin kullanımını gösteriyoruz.

Katı Destekli Membran (SSM) Tabanlı Elektrofizyoloji ile Taşıyıcı Hedefli inhibitör nanobodies seçimi

Mevcut protokol, nöronal K-Cl ko-transporter KCC2'nin fonksiyonlarını ve aktivitelerini incelemek için batı blotlama tekniğinin uygulanmasını vurgulamaktadır. Protokol, kinaz düzenleyici bölgeler Thr906/1007'de batı lekelenmesi yoluyla KCC2 fosforilasyonunun araştırılmasını açıklamaktadır. Ayrıca, KCC2 etkinliğini doğrulamak için ek yöntemler bu metinde kısaca vurgulanmıştır.

Western Blotting Kullanarak Nöronal K-Cl Co-Transporter KCC2'nin Fonksiyonlarının ve Aktivitelerinin İncelenmesi

Uyarılabilir hücrelerin tepkilerini in vitro olarak incelemek için protokol, genetik olarak tasarlanmış tet-on spiking HEK hücrelerinin basit bir uyarılabilir hücre modelinde elektroporasyona bağlı aksiyon potansiyeli üretimindeki değişikliklerin yanı sıra ilgili parametrelerin otomatik olarak çıkarılması ile transmembran voltajındaki değişikliklerin optik olarak izlenmesini açıklar.

Genetik Olarak Tasarlanmış Tet-On Spiking HEK Hücrelerinde Aksiyon Potansiyeli Üretiminde Elektroporasyona Bağlı Değişikliklerin İzlenmesi

Öğrenin, dev yamaç ve iyon seçici mikroelektrotlar kullanarak NHE aktivitesini ölçme yöntemini. Bu teknik, hücre zarındaki proton akışını hassasiyetle tespit eder ve sinirbilim araştırmalarında iyon taşıma mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

Elektrofizyoloji ölçüm uygulanması elektro-tarafsız taşıyıcılar etkinlik çalışması için

Daha fazla video keşfet