Kromatin fare oosit ilerleme profaz metafaz II analizi için hazırlıklar yaymak

Bu kromatin yayılma preparatının genel amacı, memeli oogenezi boyunca kromatine bağlı proteinlerin dinamik lokalizasyon modellerini ve oositlerin kromozom morfolojisini kronolojik olarak görselleştirmektir. Bu yöntem, homolog kromozom eşleşmesi, sinapsis, DNA onarımı ve mayotik kromozom ayrışması gibi kadın üreme biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kromozomlarla ilişkili proteinlerin net bir şekilde immünoetiketlenmesine ve görselleştirilmesine ve oosit ploidisinin değerlendirilmesine izin vermesidir.

Oogenez hataya açıktır ve kromozom yanlış ayrışması sıklıkla genetik hastalığa neden olur. Bu yöntem, anöploidi ve infertilitenin maternal nedenleri hakkındaki anlayışımızı geliştirmek için kullanılabilir. Koitumdan 14 ila 19 gün sonra dişi bir fareye ötenazi yaptıktan sonra, abdominopelvik boşluğa V şeklinde bir açıklık açın.

Sonra maternal uterus boynuzunu çıkarın. Daha sonra embriyoları plasentadan ayırın ve embriyoları dekapitasyon ile kurban edin. Daha sonra bunları 37 santigrat derecede üç mililitre PBS içeren 35 milimetrelik Petri kabına aktarın.

Ardından bir yavruyu yine ılık PBS ile doldurulmuş ayrı bir tabağa taşıyın. Fetüsü ötenazi yaptıktan sonra, arka yarının ventral orta hattı boyunca, ön ayakların altındaki ön yarısı boyunca ve doğrudan arka ayakların ve kuyruğun üzerinde bir kesim yapın. Daha sonra 3,5 inçlik makas kullanarak embriyonun karnını açın.

İnce uçlu forseps kullanarak, gonadları açığa çıkararak karaciğeri ve bağırsak halkalarını yerinden çıkarın veya çıkarın. Şimdi gonadların erkek mi yoksa dişi gonad mı olduğunu belirleyin. Yumurtalıklar böbreğin hemen altında ve arkasında, periton boşluğunun arka duvarına doğru bulunur.

Bir çift ince uçlu forseps kullanarak her iki yumurtalığı da çıkarın ve bunları 37 santigrat derecede tutulan PBS içeren küçük bir kaba aktarın. Tüm fetüslerden yumurtalıkları toplamak için hızlı bir şekilde ilerleyin. Daha sonra yeni bir küçük kapta, her bir ayrı yumurtalık setini yarım mililitre taze yapılmış hipo-ekstraksiyon tamponuna tamamen daldırın.

25 santigrat derecede en az 15 dakika, ancak 30 dakikadan fazla olmamak üzere kuluçkaya yatmalarına izin verin. Kuluçka sırasında, temiz bir cam slayt üzerine iki adet 22 x 22 milimetre kare çizmek için hidrofobik bir bariyer PAP kalemi kullanın. Her yumurtalık seti için bir slayt hazırlayın.

Kuluçka tamamlandığında, temiz bir slayta 50 mikrolitrelik bir damla 100 milimolar sükroz ekleyin ve bir çift yumurtalığı damlaya aktarın. Şimdi yumurtalıkları kızdırmak ve içindeki hücreleri serbest bırakmak için iki adet 27 gauge iğne kullanın. Forseps ile büyük yumurtalık parçalarını çıkarın ve atın.

Ardından, salınan hücreleri dağıtmak için sükroz çözeltisini dikkatlice pipetleyin. Daha sonra, her kareyi %0,2 Triton X-100 ile 40 mikrolitre %1 PFA içeren bir slayta yükleyin. Bir pipet ucu kullanarak veya sürgüyü ileri geri sallayarak çözeltiyi karenin etrafına yayın.

Daha sonra, hücreli her bir sükroz çözeltisi havuzu için, 20 mikrolitre askıya alınmış hücre içeren iki fiksatif su birikintisi yükleyin, böylece her slaytta bir yumurtalık setinden hücreler bulunur. MI veya MII oosit koleksiyonları için önce donör fareyi hazırlayın ve ötenazi yapın. Daha sonra abdominopelvik boşlukta V şeklinde büyük bir açıklık açın ve her bir uterus boynuzunu bulmak için bağırsakları yerinden çıkarmak için forseps kullanın.

Göğüs kafesinin proksimalindeki yumurtalıkları bulun. Yumurta kanalını ince forseps ile tutun ve diseksiyon makası kullanarak yumurtalıktan üst yağı kesin. Yumurta kanalını tutmaya devam ederken, yumurtalığı bursadan serbest bırakmak için ince forseps kullanın ve yumurtalıkları 37 santigrat derecede tutulan ortam içeren bir toplama kabına aktarın.

GV evreli oositleri toplamak için, büyük antral folikülleri manuel olarak delerek kümülüs-oosit komplekslerini serbest bırakmak için 27 gauge iğneli bir mililitrelik bir şırınga kullanın. MII evre oositlerini toplamak için, sadece bir delik açmak yerine onları serbest bırakmak için yumurta kanalının ampullasında bir delik açın. Şimdi ağızla çalıştırılan bir cam pipet veya kılcal damar kullanarak oositleri toplayın veya elle çalıştırılan bir mikrometre şırıngası kullanın.

Bazı oositler kümülüs hücreleri ile çevrili olabilir, diğerleri olmayabilir. MI oositleri için, çevredeki kümülüs hücrelerinin oositlerini yok etmek için MEM-alfa / BSA'da taze hyaluronidaz hazırlayın. Her oosit koleksiyonu için, üç dakika boyunca 2.5 mililitre hazırlanmış hyaluronidaz içeren bir inkübatörde tedavi edin.

Daha sonra MI oositlerini taze yapılmış ılık MEM-alfa / BSA ortamına aktarın. Orada, kümülüs hücrelerini tamamen ayırmak için gereken kesme kuvvetini sağlamak için ağızla çalıştırılan bir cam pipet kullanın. Genel olarak, bu prosedürün başarısı, ağızla çalıştırılan cam pipetler veya kılcal damarlar kullanılarak oosit toplama ve manipülasyon konusunda ustalık gerektirir.

Oositlerin inkübatörde iyileşmesine izin verin. Bu arada, ısıtılmış dokuz oyuklu bir cam plakaya 300 mikrolitre ılık Tyrode solüsyonu yükleyin. İki kuyuyu 300 mikrolitre ılık MEM-alpha / BSA ile yükleyin ve bir kuyuyu 300 mikrolitre sıcak Waymouth ortamı ile yükleyin.

Zona pellucida'yı çıkarmak için, diseksiyon mikroskobu altında izlerken beş ila 10 MI veya MII evreli oositleri Tyrode çözeltisinin banyosuna sadece 30 ila 45 saniye boyunca aktarın. Zona pellucida gözle görülür şekilde çözüldüğünde, MEM-alfa / BSA ortamı ile önceden ıslatılmış bir pipet kullanarak oositleri hemen ortama aktarın. Daha sonra oositleri ısıtılmış ortamın ikinci bir banyosuna aktarın.

İkinci banyodan sonra, oositleri ılık Waymouth'un ortamına aktarın ve 30 dakika boyunca bir inkübatörde iyileşmelerine izin verin. Bir kromatin yayılımına hazırlanmak için, bir cam slayt üzerine 11 x 44 milimetrelik bir dikdörtgen çizmek için bir PAP kalemi kullanın. Daha sonra slaydı su içinde% 0.2 Triton X-100 ile% 1 PFA'lık ince bir tabaka ile kaplayın ve ardından çözeltiyi yaymak için slaytı ileri geri sallayın.

Ardından, fazlalığı gidermek için slayta dokunun. Şimdi minimum miktarda ortam ile beş ila 10 oosit arasında sifon çekin. Daha sonra, bir pipet ucunu aynı anda sabitleyici solüsyondan sürükleyerek ve oositleri yaklaşık bir santimetre yukarıdan slaytın üzerine bırakarak oositleri hazırlanan slayta aktarın.

Oositler hemen patlamalı ve lam üzerine kromatin yaymalıdır. Şimdi slaytları oda sıcaklığında kapalı bir nemlendirilmiş odada inkübe edin. Kromatinin slayta yapışması için gece boyunca yerleşmelerine izin verin.

Tarif edilen embriyonik kromatin koleksiyonu, C57 siyah/6J embriyolarından hasat edilen oositlerde çaprazlama oluşumunu kantitatif olarak analiz etmek için kullanıldı. Profaz kromatin yayılma preparatları, SYCP3, SYCP1 ve MLH1'i tespit etmek için immüno-etiketlendi ve DAPI ile boyandı. Pakiten aşaması kromozomları, tamamen monte edilmiş 20 SC yapısı boyunca dağıtılmış 27 MLH1 odağına sahipti.

Yayılma hazırlığı yetersiz olduğunda ve bireysel kromozomlar ayırt edilemez olduğunda, hazırlık değerlendirmeye dahil edilmedi. İyi preparatlarda, SMC6 perisentromerik heterokromatin bölgesinde ve kromozom kolları boyunca zenginleştirildi ve MLH1 odakları pakiten aşamasında SC boyunca dağıtıldı. 15 iyi vahşi tip preparattan elde edilen MLH1 pozitif geçişlerin sayısı yaklaşık 24 idi.

Oosit toplama yöntemi, mayotik rektasyonu takiben oositlerdeki kromatin morfolojisini değerlendirmek için kullanıldı. Protein lokalizasyonu ve ploidi kolayca değerlendirildi ve kromozom ayrışma hatalarının potansiyel nedenlerini ortaya çıkardı. Topoizomeraz II-alfa, kromozom kolları ve perisentromerik heterokromatin boyunca görülebilir.

MII oositlerinde, eşleştirilmiş kardeş kromatitler kromozom ve sentromer morfolojisi ile ayırt edilebilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, kültürleme olmadan veya kültürlemeden sonra bu teknikler fare başına bir veya iki saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü takiben, hücre bağlamında homolog kromozomları ve kardeş kromatitleri değerlendirmek için tüm hücre oosit immünoetiketleme ve canlı hücre görüntüleme gibi diğer tamamlayıcı yöntemler gerçekleştirilebilir.

Toplu olarak, burada açıklanan kromatin yayılma yöntemleri, mayoz bölünme sırasında memeli oogenezini ve kromozom ve protein dinamiklerinin cinsel olarak dimorfik özelliklerini değerlendirmek için kolayca uygulanabilir.