Bacillus subtilis tek hücreli mikrosıvısal analizi

Bu mikroakışkan deney düzeneğinin genel amacı, tek tek bakteri hücrelerinin sabit, yüksek kontrollü çevresel koşullar altında uzun vadeli gözlemini sağlamaktır. Bu yöntem, bakteri fizyolojisi alanında, tek tek hücrelerin strese uzun vadeli tepki kalıplarının neler olduğu veya bir popülasyon boyunca heterojen bir fenotipin zamanla nasıl değiştiği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, sabit, tekdüze ve yüksek düzeyde kontrollü çevre koşulları altında onlarca hatta yüzlerce nesil boyunca bireysel hücre soylarını gözlemleyebilmemizdir.

PDMS polimerini metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, bir polistiren Petri kabındaki kırılmamış alüminyum folyo parçasına bir silikon master yerleştirin. Gazdan arındırılmış PDMS karışımını master'ın üzerine yaklaşık beş milimetre derinliğe kadar dökün. Ardından tabağın gazını en az 10 dakika alın.

PDMS'yi 60 derecelik bir fırında en az bir saat kürleyin ve oda sıcaklığına soğutun. Ardından, ana ve kürlenmiş PDMS'yi içeren alüminyum folyoyu plakadan çıkarın. Dikkatlice puanlayın ve alüminyum folyoyu master'ın arkasından soyun.

Ardından PDMS'yi master'dan dikkatlice soyun. Bir gofret olarak, tipik olarak biraz farklı boyutlara sahip birkaç mikroakışkan cihaz içerir. Tek bir cihazı uygun boyutta kesmek için temiz, keskin bir neşter kullanın.

Desenli özelliklerin görünürlüğünü artırmak için cihazın desenli tarafının üzerine bir parça yarı saydam ofis bandı yerleştirin. Giriş ve çıkış portları, görünür akışkan kanallarının zıt uçlarında dairesel alanlar olarak tanımlanır. PDMS cihazını desen tarafı aşağı bakacak şekilde çevirin ve cihazı işaretli noktalara delmek için 0,75 milimetrelik bir biyopsi zımbası kullanın.

Ardından zımbaları atın. Zımbaları cihazdan çıkarmak için bir cımbız gerekebilir. Temizlenmiş ve kurutulmuş kapak camını ve PDMS cihazını bir oksijen plazma temizleyiciye yerleştirin ve cihazı burada gösterilen ayarlarla plazma işlemine tabi tutun.

Plazma işlemi bittikten hemen sonra, cihazı çıkarın ve camı plazma temizleyiciden kapatın. PDMS'yi ters çevirin ve desen tarafı cama temas edecek şekilde kapak camının ortasına yerleştirin. Besleme kanallarının, kapak camının uzun erişimi ile hizalandığından emin olun.

PDMS'nin cama karşı sızdırmaz olduğundan emin olmak için çok nazikçe bastırın. Monte edilmiş cihazı en az bir saat boyunca 60 santigrat derecelik bir fırında pişirin. Pişirdikten sonra, cihazın bir köşesine hafifçe iterek PDMS'nin cama yapıştığını manuel olarak doğrulayın.

Polimer boruları metin protokolüne göre kestikten sonra, kullanılıyorsa, iki santimetre uzunluğunda esnek silikon boruyu Y'nin üst dikenlerine ve bir santimetre uzunluğunda silikon boruyu kesip Y'nin alt dikenine bağlayarak sıkıştırma valfleri için Y-bağlantılarını monte edin.Ardından, 10 santimetre uzunluğunda polimer boru kesin ve ardından bunları bir santimetre uzunluğundaki silikon boru segmentlerine yerleştirerek bir ucundan anahtar bağlantısına bağlayın. Y.'nin alt dikeni. Diğer uçtaki boru uzunluklarını, plastik şırınga adaptörlerinden çıkarılmış ve iğne ucundan yaklaşık dokuz milimetre yaklaşık 90 derece bükülmüş 21 gauge iğnelere bağlayın. Şırıngalardan anahtar aparatına geçecek boru segmentlerinin bir ucuna, iğneleri borunun içine sokarak 21 gauge künt iğneleri bağlayın. Her bir boru uzunluğunun diğer uçlarını, Y bağlantılarının giriş dikenlerindeki silikon boru segmentlerine yerleştirin.

Şırıngaları metin protokolüne göre BSA ile desteklenmiş bakteri üreme ortamı ile doldurduktan sonra, yüklenen şırıngaları hazırlanan 21 gauge iğnelere bağlayın, giriş borusuna takın ve şırıngaları şırınga pompalarına yükleyin. Şırınga pompalarını yüksek akış hızında çalıştırarak ve şırınga pompalarını dikey olarak yönlendirerek, hava kabarcıklarını en üste getirmek için şırıngalara vurarak giriş tesisatındaki havayı boşaltın. Şırıngadan hava tahliye edildikten sonra, şırınga pompasını yatay olarak konumlandırın ve hava kabarcıklarını çıkarmak ve boşaltmak için şırıngalardan polimer hatlarına anahtar aparatından yukarı doğru kademeli olarak hafifçe vurun veya hafifçe vurun.

Ortamı değiştiriyorsanız, ikinci şırınga sırası için bu işlemi tekrarlayın. Hava kabarcıkları temizlendikten sonra, ikinci faz şırınga pompasını dakikada 1,5 mikrolitreye ayarlayın ve ardından akışı duraklatın. İkinci orta faza karşılık gelen Y bağlantılarının dalındaki esnek boru segmentlerine küçük bağlayıcı klipsler yerleştirin ve ikinci ortamı Y bağlantısının aşağı akışında boşaltmak için birinci faz pompasını çalıştırmaya devam edin.

PDMS cihazını yüklemek için, boş, ince jel yüklemeli mikropipet uçlarını mikroakışkan cihazın çıkış deliklerine nazikçe yerleştirerek başlayın. P200 mikropipet ile ince jel yükleme uçları kullanarak, mililitre BSA başına bir miligram içeren ortamı giriş deliklerine enjekte ederek, mikroakışkan kanalların doldurulmasını izlemek için uçları ve çıkış deliklerini gözlemleyerek cihazı pasifleştirin. Cihazı oda sıcaklığında yaklaşık beş dakika inkübe edin.

Daha sonra, benzer uçları kullanarak, hücrelerin cihaz boyunca ilerlemesini izlemek için çıkış kanalındaki uçları kullanarak her bir kanalı yeniden askıya alınmış hücrelerle yükleyin. Cihaza zarar vermemek için jel yükleme uçlarını çıkış deliklerinden nazikçe çıkarın. Cihazı, 10 dakika boyunca yaklaşık 6.000 kez g'de uygun bir rotor adaptöründe tezgah üstü bir mikrosantrifüjde santrifüjleyin.

Mikroskop altında, ancak cihazı kayar tutucu sahne ekine takmadan başarılı yüklemeyi doğrulayın. PDMS'nin her iki yanındaki kapak camını sahne ekinin altına bantlayarak yüklenen cihazı bir sahne ekine dikkatlice monte edin. Stage yerleştirme cihazı düzeneğini, PDMS yukarı bakacak şekilde ters çevirin ve tozsuz bir mendil gibi yumuşak bir yüzeye yerleştirin.

Birinci faz şırınga pompasının akış hızını dakikada 35 mikrolitreye ayarlayın. Daha sonra her seferinde bir şeritle çalışarak, giriş iğnesini ve ardından atık kabına giden çıkış iğnesini yerleştirin. Cihazı sızıntı açısından görsel olarak inceledikten sonra, orta menisküste bulanık bir şerit olarak görünen ve yavaşça atık kabına doğru hareket edecek olan fazla hücrelerin görünümü için çıkış borusunu inceleyin.

Cihaz yaklaşık 15 dakika çalıştıktan sonra, birinci faz şırınga pompasını dakikada 1,5 mikrolitreye ayarlayın ve akışı duraklatın. Tüm pompa ve cihaz aparatını ters çevrilmiş bir floresan mikroskoba getirin ve birinci faz orta akışını dakikada 1,5 mikrolitre hızla yeniden başlatın. Giriş ve çıkış borularını yönlendirmek için gerektiği gibi bant kullanarak, sahne ekini cihazla birlikte mikroskoba dikkatlice monte edin.

Görüntüleme için cihazda uygun konumları bulun ve istediğiniz gibi görüntülemeye başlayın. Hücrelerin kararlı durum, üstel faz büyümesini okumak için tipik olarak birkaç saat gerektirdiğini ve görüntü alımının başlangıcının istenildiği gibi geciktirilebileceğini, böylece görüntülemenin dengeleme periyodundan sonra başlayabileceğini unutmayın. Ardışık görüntüleme turları arasında ortamı değiştirmek için, faz bir şırınga pompasının akışını duraklatın, bağlayıcı klipsleri faz iki silikon borudan dikkatlice açın, her birini Y bağlantısının faz birinci dalındaki silikon boruya hareket ettirin, ardından faz iki şırınga pompasının akışını duraklatın ve görüntülemeye devam edin.

Faz kontrast mikroskobu ile değerlendirildiği gibi, mikroakışkan tesisatı cihaza takmadan önce, mikroakışkan yan kanalların tamamı veya neredeyse tamamı bir veya daha fazla bakteri hücresi içeriyorsa, ilk hücre yüklemesi başarılı olarak kabul edilecektir. Cihaz ilk yüklendikten sonra, nispeten yüksek bir akış hızında dengelenir. Burada gösterildiği gibi, dengelenmiş bir cihazın mikroskobik incelemesi, yan kanalların çoğunda tek bir eğe içinde hapsedilmiş birkaç hücreyi ortaya çıkarmalıdır.

Dengelenmiş bir cihaz, 37 santigrat derecede dakikada 1,5 mikrolitre akış altında mikroskop üzerine yerleştirildiğinde, hücreler yaklaşık iki saat boyunca düzgün ve sabit üstel faz büyümesine devam edecektir. Üstel faz büyümesine devam eden hücreler, en az 24 saat boyunca parlak alan veya floresan mikroskobu kullanılarak güvenilir bir şekilde görüntülenebilir. Bir orta anahtarının tanıtılması, yürütülebilecek deney yelpazesini genişletir, ancak aynı zamanda girişte yerinden çıkan ve besleme kanalından geçen hava kabarcıkları veya hücre kümelerinin varlığı yoluyla katastrofik hücre ölümü olaylarının sıklığını artırır.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa yaklaşık beş saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü kullanarak, farklı floresan raportörler, suşlar ve çevresel koşullarla, çok nadir veya geçici olaylar da dahil olmak üzere çok çeşitli fizyolojik olaylar incelenebilir.