Meme kanseri arşivleme malzeme kullanarak bir Multiplex RNA temel ifade tahlil duruma getirilmesi

Bu yöntem, meme kanseri hastalarını bilinen ve bilinmeyen terapötik gruplara ayırmak için başarıyla optimize edilmiştir. Bu testin yüksek hassasiyeti, lazer mikrodiseksiyon kullanılarak daha fazla incelenebilecek heterojen numuneleri tanımlar. RNA bazlı multipleks testin ana avantajı, yüksek çözünürlüklü çıktılara ve biyobelirteç doğrulamasına izin veren Hematoksilen ve Eozin ile boyanmış formalin ile sabitlenmiş parafine gömülü arşiv materyali kullanılarak sonuçların tekrarlanabilirliğidir.

Dokuyu metin protokolünde anlatıldığı gibi hazırlayın. Diseksiyona başlamak için slayt limitlerini ayarlayın ve mikroskobun aşama hareketini kalibre edin. Şimdi 4X objektifi kullanarak lekeli membran slaytlarını tarayın.

Membran lamı üzerinde mikrodiseksiyon için hedef alanları seçin ve daire içine alın. Toplam alanı takip edin. Yeterli aşağı akış RNA analizi için en az 42 milimetre kare gereklidir.

Ardından tanımlanan parametrelerde lazer kesimi başlatın. Ardından, diseke edilen bölümü almak için kapak kaldırma mekanizmasını kullanın ve bölümü, mekanik bir eke bağlı etiketli bir tüpün difüzör kapağına yerleştirin. Kesilen bölüm kapağa alınmazsa, hedef alanın diseksiyonunu tekrarlayın.

Mikrodiseksiyonun doğruluğu kritik bir adımdır ve kapak üzerinde bulunan mikrodiseksiyonlu alanın işaretlenmiş, taranmış görüntü ile çakıştığından her zaman emin olunmalıdır. Her biri ayrı bir tüpte olmak üzere istediğiniz kadar doku kesiti toplayın, ardından doku örneklerini parçalamaya devam edin. Lizis için, her numuneye milimetre kare doku alanına 2.4 mikrolitre homojenleştirme solüsyonu uygulayın, ardından numuneleri maksimum hızda 10 saniye boyunca girdaplayın.

Ardından, numuneleri 2.500 g'da beş saniye boyunca döndürün. Daha sonra gerekirse numuneleri 1,5 mililitrelik tüplere aktarın ve 65 santigrat derecede sallanan bir ısıtma bloğuna yerleştirin. 600 rpm'de 12 ila 18 saat çalkalayın.

Daha sonra lizatları oda sıcaklığında beş dakika boyunca 21.000 g'da santrifüjleyin. Berrak süpernatanı dikkatlice yeni bir etiketli tüpe toplayın. Herhangi bir doku parçasını aktarmaktan kaçının.

Süpernatanlar eksi 80 santigrat derecede saklanabilir. Hibridizasyon bazlı test için tüm reaktifleri hazırladıktan sonra, 25 mikrolitre doku homojenatı ile 90 oyuklu bir manyetik ayırma 96 oyuklu plakaya kadar yükleyin. Belirlenen üç kuyucuğa 25 mikrolitre kontrol numunesi yükleyin ve boşluklar olarak üç kuyucuğa 25 mikrolitrelik bir homojenizasyon çözeltisi yükleyin.

Daha sonra manyetik ayırma plakasını şeffaf bir plastik basınç contası kullanarak kapatın ve plakayı çalkalayarak 18 ila 22 saat boyunca 54 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Ertesi gün, plakayı el tipi bir manyetik plaka yıkayıcıya monte edin ve kilitleyin, ardından basınç contasını çıkarın ve manyetik boncukların oturması için bir dakika bekleyin. Şimdi bir yıkama yapın.

Plakayı bir lavabonun üzerine boşaltın ve nazikçe kurulamak için bir kağıt mendil kullanın, ardından tüm kuyucukları 100 mikrolitre 1X yıkama tamponu ile doldurun ve 15 saniye bekleyin. Yıkama adımını tamamlamak için bu işlemi üç kez tekrarlayın. Son yıkamayı çıkardıktan sonra, kuyucukları 50 mikrolitre ön amplifikatör reaktifi ile yeniden doldurun, ardından plakayı bir alüminyum plaka kapatıcı ile kapatın ve plakayı oda sıcaklığında bir dakika boyunca 800 rpm'de sallayın.

Ardından plakayı bir saat boyunca 50 santigrat derecede sallamaya devam edin. Bu tamamlandığında, başka bir yıkama adımı gerçekleştirin. Daha sonra, kuyucukları 50 mikrolitre amplifikatör reaktifi ile yeniden yükleyin, plakayı bir alüminyum plaka contası ile kapatın ve oda sıcaklığında bir dakika çalkalama inkübasyonunu tekrarlayın, ardından 50 santigrat derecede bir saat ve ardından başka bir yıkama adımı izleyin.

Şimdi etiket probunu maksimum hızda 10 saniye boyunca girdaplayın ve ardından her bir oyuğa 50 mikrolitre etiket probu ekleyin. Ardından plakayı tekrar kapatın ve çalkalama inkübasyonunu daha önce olduğu gibi tekrarlayın, ardından başka bir yıkama adımı izleyin. Daha sonra kuyucukları 50 mikrolitre taze karıştırılmış Streptavidin fikoeritrin ile doldurun, daha sonra oda sıcaklığında 600 rpm'de çalkalama inkübasyonu yapın, ardından Streptavidin yıkama tamponu kullanarak bir yıkama adımı uygulayın.

Yıkama adımını tamamladıktan sonra, her bir kuyucuğa 100 mikrolitre Streptavidin yıkama tamponu yükleyin ve plakayı bir alüminyum plaka contası ile kapatın, ardından plakayı oda sıcaklığında 800 rpm'de üç dakika çalkalayın. Son inkübasyon adımı sırasında, manyetik boncuk analizörünü başlatın ve cihazın kalibre edildiğinden ve doğrulama protokollerinin gerçekleştirildiğinden emin olun. Yazılımda, Batches sekmesinden Create Batch using an existing protocol using an existing protocol (Toplu İş Oluştur) seçeneğini belirleyerek yeni bir analiz ekleyin.

Ardından, plaka düzeninde, kuyucukları bilinmeyen veya boş olarak belirleyin ve Numune panelinde her biri için bir etiket sağlayın. Şimdi alüminyum contayı reaksiyon plakasından çıkarın, plaka yükleyici tepsisini çıkarın ve plakayı analizöre yükleyin. Ardından, analizörü başlatmak için Geri Çek'e ve ardından Toplu İşlemi Çalıştır'a tıklayın.

Okumadan sonra, plakayı çıkarın ve manyetik boncuk analizörünü üretici tarafından önerildiği şekilde temizleyin. Analiz için Toplu İş Sonuçları sekmesine gidin. İlgili analiz dosyasını seçin ve bunu bir csv dosyası olarak dışa aktarma seçeneğini kullanın, ardından bir elektronik tablo yazılımı kullanarak ortalamalar ve ham puanlar oluşturun.

Kontrollerin beklenen sinyalleri gösterdiğinden emin olun. Örnek ham verileri normalleştirin ve bir veri bilimi platformu kullanarak veya temel bileşen analizi yürütmek için tanımlanmış algoritmalar kullanarak veri dağıtımını analiz edin. Multipleks boncuk okuyucunun ve tahlilin performansı kritik öneme sahiptir ve değerli hasta numunelerinden önce iyi açıklamalı kontrol numunelerinin seri seyreltmelerinin çalıştırılması doğru sonuçları sağlar.

Öznitelikler için, normalleştirilmiş gen verilerinin alt kümesini ve meme kanseri alt tipi gibi nominal bir değişkeni seçin. Bilinmeyen örnekleri karakterize etmek için eğitilmiş ve doğrulanmış bir sınıflandırma algoritması uygulayın. Tarif edilen yöntem, H&E ile boyanmış, mikrodiseke edilmiş, yüksek oranda bozulmuş FFPE materyalinde 40 transkriptin eş zamanlı ölçümü için uygulanmıştır.

Bu yöntemi kullanarak, çeşitli reseptör pozitif ve negatif alt tiplerinde tümör ve eşleşen kontrol dokusunu karşılaştırırken reseptör durumunun doğru karakterizasyonunu ve mezenkimal belirteç FN1'in diferansiyel ekspresyonunu göstermek mümkündür. Tümörler içindeki heterojenlik bu yöntem kullanılarak karakterize edilebilir. ER pozitif bir tümör, farklı tümör morfolojisi ve mitotik aktivite gösteren alanlar içinde FN1'in uzamsal diferansiyel ekspresyonunu sergiler.

Bu videoyu izledikten sonra, hedef RNA'nın boncuklara hibridizasyonunu, sinyal amplifikasyonunu ve miktar tayinini takiben doğrudan doku lizatlarından birden fazla genin nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Test hassasiyeti, lazer mikrodiseke edilmiş materyalin kullanımına izin verir. Bu prosedürü denerken, her testten önce ekipmanı kalibre etmeyi ve değerli hasta numunelerini çalıştırmadan önce kalite kontrol materyali kullanarak hassasiyet aralığını belirlemeyi unutmamak önemlidir.

Tahlil iş akışı klinik laboratuvarlara kolayca uyarlanabilir. İki gün boyunca 12 saat içinde 90 örneğe kadar RNA profillemesi gerçekleştirilebilir. Bir patoloji laboratuvarında meme kanseri reseptör durumunun ölçülmesi zaman alıcıdır ve deneyimli patologlar gerektirir.

Bu dijitalleştirilmiş, multipleks boncuk bazlı testi kullanarak, RNA ekspresyonunu doğru bir şekilde ölçer. Primer tanıda biyopsilerde fraksiyonel biyobelirteçlerin analizi, tümörün bir prezentasyonudur. Bu metodolojiyi daha geniş bir biyobelirteç paneli ile kullanmak ve ayrıca tüm bölümleri kullanmak heterojen örnekleri tanımlar.

Bu metodoloji kullanılarak tahlillerin geliştirilmesi çok yönlüdür ve düşük numune girdisi gerektirir. Örnek, biyobelirteç validasyonu için önemli olan klinik açıklamalı örnekleri ve ayrıca hasta gözetimi ve erken tanı için önemli olan sıvı biyopsileri içerir.