Bir hızlı gümüş boyama Protokolü etkinleştirme basit ve SSR bir sigara denaturing Polyacrylamide jel kullanarak işaretleri, verimli algılama

Bu protokolün genel amacı, denatüre olmayan poliakrilamid jellerde SSR belirteçlerinin hızlı, kolay ve düşük maliyetli tespiti için optimize edilmiş bir gümüş boyama yöntemi sunmaktır. SSR belirteçlerinin hızlı genotiplenmesi, moleküler ıslah programlarında genetik çeşitlilik analizi ve belirteç destekli seçim gibi genetik araştırma ve uygulama alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, SSR belirteçlerinin tespiti için diğer protokollere göre daha az zaman alması ve daha az kimyasal reaktif kullanmasıdır.

Bu yöntem, geleneksel protokollerde bulunan sabitleme, durdurma ve birkaç yıkama adımını önler. Ve sadece emprenye ve geliştirmenin iki ana adımını gerektirir. SSR bantlama modellerinin kesin olarak algılanması için arka plan gürültüsü olmadığı için bu protokol kullanılarak net görüntüler üretilebilir.

Bu teknik kullanılarak günde yaklaşık 800 DNA örneği taranabilir ve tütün ve çiçekli Çin lahanası araştırmalarında başarıyla kullanılmıştır. PCR ürünlerini ve jel solüsyonlarını metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, bir set cam plaka ve ara parçayı yıkamak için musluk suyunda deterjan kullanın ve ardından damıtılmış su ile tam bir durulama yapın. Plakaları havayla kuruması için bir plaka kurutma rafına yerleştirin.

Dikdörtgen bir cam plakanın iç yüzeyine bir mililitre Bind-silan çözeltisi dağıtın ve beş dakika kurutun. Daha sonra, bir çubukla çentikli bir cam plakanın iç yüzeyine bir mililitre Repel-silan dağıtın ve plakanın beş dakika boyunca kurumasına izin vermeden önce fazla çözeltiyi silmek için bir kağıt mendil kullanın. Cam plakaları, çentikli plaka üstte olacak şekilde ara parçalarla birleştirin.

Ve montajın her iki tarafını da sıkıştırmak için döküm kelepçeleri kullanın. Daha sonra, plaka seti için bir behere uygun miktarda %6 denatüre olmayan poliakrilamid jel çözeltisi dökün. 20 mikrolitre TEMED ve 200 mikrolitre taze %20 APS ekleyin ve hafifçe karıştırın.

Çözeltiyi, çentikli plakanın kenarı boyunca monte edilmiş cam plakalara hemen ve dikkatlice dökün ve boşluğu neredeyse tepeye kadar doldurun. Ve tarağı yerleştirin. Daha sonra tarağın üzerine küçük bir hacimde jel solüsyonu ekleyin ve jelin oda sıcaklığında 30 dakika bekletin.

Jel tamamen polimerize olduğunda, döküm kelepçelerini çıkarın ve plaka setini, çentikli plaka üst tampon rezervuarına bakacak şekilde elektroforez tankı ünitesine yerleştirin. Plaka setini tank ünitesine takmak için büyük kelepçeler kullanın. Üst ve alt bölmelerin her birine bir litre 0,5 X TBE tamponu dökün.

Ardından tarağı çıkarın ve tüm kuyucukları iyice yıkamak için tamponla doldurulmuş bir pipet veya şırınga kullanın. Poliakrilamid jeli çalıştırmak için her kuyucuğa yaklaşık bir mikrolitre PCR ürünü yükleyin. Ayrıca, her iki ucuna da bir DNA merdiveni yükleyin.

Ardından güvenlik kapağını üst tampon bölmesine sabitleyin. Kırmızıdan kırmızıya ve siyahtan siyaha kodlu rengi eşleştirerek kabloları güç kaynağına bağlayın. Boya tanımlanmış bir konuma ulaşana kadar jeli 110 voltluk sabit bir voltajda çalıştırın.

Normalde, yaklaşık 70 dakika. Elektroforezin ardından valfi açın ve tamponu üst hazneden büyük bir behere boşaltın. Yan kelepçeleri ayırın ve plakayı cihazdan çıkarın.

Ardından, çentikli cam plakayı bir taraf boyunca dikkatlice ayırmak için bir spatula kullanın ve jelin Bind-silan ile kaplanmış diğer cam plakaya bağlı kaldığından emin olun. Daha sonra, 1.5 gram gümüş nitratı bir litre damıtılmış suda çözerek bir litre taze emprenye çözeltisi hazırlayın. Daha sonra 10 gram sodyum hidroksiti 900 mililitre damıtılmış suda çözerek bir litre taze geliştirme çözeltisi hazırlayın.

Bir mililitre %37 formaldehit ekleyin ve bir litrelik son hacme ayarlamak için damıtılmış su kullanın. Bol miktarda damıtılmış su ile, elektroforez tamponunu çıkarmak için jeli ve cam plakayı dikkatlice durulayın. Daha sonra plakayı jel yukarı bakacak şekilde plastik bir tepsiye yerleştirin ve jeli bir litre emprenye solüsyonuna batırın.

Tepsiyi 60 RPM'de bir çalkalayıcı üzerinde üç ila dört dakika hafifçe sallayın. Plakayı emprenye solüsyonundan başka bir tepsiye aktarın. Daha sonra, kalan emprenye solüsyonunu plakanın yüzeyinden ve jeli her biri üç ila beş saniye boyunca iki kez durulamak için bol miktarda damıtılmış su kullanın.

Emprenye işleminden sonra jel yıkama aşaması kritiktir. Yetersiz yıkama, nedenim, emprenye çözeltisinin eksik çıkarılması. Ve karanlık arka plan ile sonuçlanır.

Yeri jel yukarı bakacak şekilde başka bir tepsiye yerleştirin. Plakayı bir litrelik geliştirme solüsyonuna batırın, ardından tepsiyi yaklaşık üç dakika boyunca 50 RPM'de hafifçe sallayın. DNA fragmanlarının görünümünü izleyin ve DNA fragmanlarının sinyalinin arka plan gürültüsüne en yüksek oranı gözlendiğinde gelişimi durdurun.

Uygun geliştirme zamanı bir diğer önemli adımdır. Aşırı gelişme, DNA parçalarının düşük kontrastlı bir görüntüsüne sahip koyu kahverengi bir arka plana neden olabilir. Plakayı ve jeli bol damıtılmış su ile iki kez durulayın ve jel plakayı kurutmak için kağıt mendil kullanın.

Ardından, jeli 300 DPI'da taramak için bir tarayıcı ve uygun yazılım kullanın ve DNA bantlarının net bir görselleştirmesini elde etmek için parlaklığı ve kontrastı ayarlayın. Son olarak, görüntüdeki DNA fragmanı boyutlarına göre SSR işaretleyicilerinin bantlama modelini puanlayın. Burada sunulan PCR amplikonları, çiçekli Çin lahanası ve tütününde karşılık gelen SSR primer çiftleri kullanılarak üretildi.

Elektroforezden sonra, poliakrilamid jeller, bu videoda gösterilen gümüş boyama protokolü kullanılarak boyandı. Bu, SSR işaretleyicilerinin bantlama modellerini açık bir şekilde tespit etti. Farklı gümüş boyama protokollerinin tespit verimliliğini karşılaştırmak için, SSR belirteçlerinin PCR ürünleri PAGE kullanılarak ayrıldı ve yayınlanmış beş gümüş boyama protokolü ve bu videoda gösterilen altıncı bir yöntem kullanılarak görselleştirildi.

Burada gösterilen protokol, en düşük arka plan gürültüsüne ve DNA parçalarının en yüksek kontrastına sahipti, böylece en yüksek görüntü netliğini üretti. Test edilen altı protokolden, burada gösterilen yöntem en az zaman alır ve en az sayıda kimyasal reaktif ve işlem adımı gerektirir. Son olarak, bu şekil, denatüre olmayan bir poliakrilamid jel üzerinde 50 ila 2000 bp'lik bir DNA markörünün seri seyreltilmesi kullanılarak ölçülen protokolün hassasiyetini göstermektedir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa yedi dakika içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, emprenye ve geliştirme solüsyonlarının çapraz kontaminasyonunu önlemeyi unutmamak önemlidir. Geliştirildikten sonra, bu teknik araştırmacıların SSR belirteçlerini hızlı bir şekilde genotiplemesinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, gümüş boyama kullanarak denatüre olmayan bir poliakrilamid jeldeki SSR belirteçlerini nasıl basit ve verimli bir şekilde tespit edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Kimyasal reaktiflerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman eldiven gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.