Name: Bir hızlı gümüş boyama Protokolü etkinleştirme basit ve SSR bir sigara denaturing Polyacrylamide jel kullanarak işaretleri, verimli algılama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Öğrenin, hızlı gümüş boyama yöntemiyle non-denaturing poliakrilamid jel üzerinde SSR işaretleyicilerini kolayca ve düşük maliyetle tespit etmeyi. Bu protokol, genetik çeşitlilik analizi ve moleküler ıslah çalışmaları için yüksek kaliteli sonuçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Guangdong doğal Bilim Vakfı Çin (2015A030313500), il anahtar uluslararası kooperatif araştırma platformu ve büyük bilimsel araştırma projesi, Guangdong Yükseköğretim (2015KGJHZ015), bilim tarafından finanse edildi ve Teknoloji planı Guangdong tütün tekel Yönetim (201403, 201705), bilim ve teknoloji planı Guangdong, Çin (2016B020201001), Ulusal İnovasyon eğitimi projesi için lisans öğrencileri (201711078001). Ticari adlar veya ticari ürünler bu yayındaki söz yalnızca belirli bilgileri sağlamak amacıyla ve tavsiye veya bize Tarım Bakanlığı tarafından onaylandığı anlamına gelmez. USDA bir fırsat eşitliği sağlayıcı ve işveren olduğunu.

1. SSR işaretleri PCR ürünlerinin hazırlanması
<ol><li>Tüm kimyasallar ve Kimyasalları şablon DNA içeren PCR reaksiyonları için hazırlamak (30 ng/µL), 2 × PCR ana mix (2 × PCR arabellek, her dNTP, 3 mM MgCl2, 0.1 U/µL Taq DNA polimeraz ve boyalar 0.4 mM içeren), her 10 µM ileriye ve geriye doğru astar ve distile veya deiyonize su (dH2O). Not: mevcut çalışmada kullanılan SSR işaretleri PT51333 idi (ileri astar sıra: 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' ve ters astar Sıralaması: 5 '- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3') ve PT50903 (ileri astar sıra: 5 ' - AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG - 3' ve ters astar sıra: 5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3 ') tütün ve CX-43 (ileri astar sıra: 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3' ve ters astar sıra: 5' - AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3') ve CX-157 (ileri astar sıra: 5 '- TCGACGCTGACTTCACTGAC-3 ' ve ters astar sıra: 5 '- GGACAGCTTCACACATTTGC - 3') için çiçekli Çin lahanası.</li>
	<li>2 µL şablonunun DNA, 2 × PCR ana karışımı, her ileri astar ve ters astar 0.2 µL ve dH2O. 2.6 µL 5 µL ekleyerek amplifikasyon için 10 µL PCR karışımı hazırlayın</li>
	<li>PCR güçlendirme tepki thermocycler 94 ° C 5 min için bir ilk adım ile gerçekleştirmek, 45 38 döngüsü tarafından takip için denatürasyon, 45 94 ° C'de s s astar tavlama için 55 ° c ve 1 dk. uzantılı 72 ° C'de ve son uzantısı adım 10 dk 72 ° C; o zaman PCR ürünleri daha sonra kullanmak için 4 ° C'de depolayın.</li>
</ol>2. Polyacrylamide için çözümler hazırlanması döküm jelleri
<ol><li>5 × TBE tampon 1 L 54 g Tris temel ve 27,5 g Borik asit dH2O içinde eriterek, 20 mL 0.5 M EDTA (pH 8.0) ekleme ve çözüm için 1, 000 mL dH2O. son hacmi ayarlama hazırlayın Not: TBE tampon oda sıcaklığında ay depolanabilir.</li>
	<li>0,5 × TBE tampon 2 L 200 mL 5 × TBE tampon dH2O 2 L son hacmiyle ekleyerek hazırlamak ve oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>29 g moleküler biyoloji sınıf Akrilamid ve moleküler biyoloji sınıf N, N 1 g çözülerek % 6 Sigara denaturing polyacrylamide jel çözüm hazır olun '-0,5 × TBE tampon son hacmiyle 500 mL methylenebisacrylamide. Alüminyum folyo ve daha sonra kullanmak için 4 ° C'de mağaza ile çözüm şişe kapağı. Dikkat: Akrilamid güçlü bir nörotoksin kabul edilir ve dikkatle ele alınmalıdır. Her zaman ne zaman toz ve o içermek işleme çözümleri tartı eldiven.</li>
	<li>Bir % 20 amonyum persülfat (APS) çözüm APS 2 g dH2O son hacmiyle 10 mL ile çözülerek hazırlayın. -20 ° C'de ay depolanabilir. Not: kolaylık sağlamak için 10 mL % 20 APS çözeltisi 1,5 mL veya santrifüj tüpleri için depolama-20 ° C'de 2 mL bölünmemeli olabilir Çözülme ve de kullanmadan önce karıştırın.</li>
	<li>Seyreltilmiş bağlama-silane çözüm bağlama-silane %0,5 Asetik asit içeren % 95 etanol 0.997 ml 3 µL çözülerek hazırlayın. Bu hafta için 4 ° C'de muhafaza edilebilir. Dikkat: Bind-silane zehirlidir, çözüm işlerken eldiven giymek ve havalandırılmış Oda tutmak.</li>
</ol>3. hazırlanması Polyacrylamide Jel Elektroforez için
<ol><li>Musluk suyu, bir tam dH2ile O. hava kuru plakaları raf kurutma bir tabak içinde ayarlayarak durulama tarafından takip bir dizi cam plakanın ve çubukları deterjan ile yıkayın.</li>
	<li>1 mL bağlama-silane çözeltisi bir dikdörtgen cam levha ve 5 min için Kuru iç yüzeyine dağıtmak. Not: bind-silane çözüm plaka yüzeyinde düzgün yaymamak jel boyama sırasında ayrılmış olarak ve tatmin edici bir boyama etkisi sonucunda.</li>
	<li>Çentikli cam levha bir bez ile iç yüzeyine püskürtmek-silane 1 mL dağıtmak, aşırı püskürtmek-silane kağıt mendil ile yok etmek ve 5 min için kurutma. Not: repel-silane cam levha yüzeyine eşit şekilde kat değil, jel kısmen sıyırma tarafından zarar verebilir.</li>
	<li>Çentikli plakalı Paspayı ile cam plakanın üzerine montajı ve montaj kelepçeleri döküm ile her iki kelepçe.</li>
	<li>Uygun miktarda (40 mL) 33 cm genişlik × 10 cm yükseklik ve spacer kalınlığı 1.5 mm plaka kümesi için bir ölçek için % 6 Sigara denaturing polyacrylamide jel çözüm dökün, tetramethylethylenediamine (TEMED) 20 µL ve 200 µLfresh %20 eklemek APS ve karışımı yavaşça. Not: Uygun miktarda jel çözüm (40 mL) iki tabak iç birimden çubukları (30 cm × 8,5 cm × 0,15 cm) kalınlığı ile hesaplanır. Jel polimerizasyon için TEMED ve APS miktarı gelince jel eriyik-e doğru TEMED ve başvuru17tarihinde dayalı APS standart bir oran vardır. Yukarıda açıklanan jel çözüm 4 ° C'de depolanan Jel çözüm oda sıcaklığında, TEMED 20 µL ve APS kullanılması gereken % 20 100 µL depolanır. Jel çözüm çözüm içinde hava kabarcıkları önlemek için bir cam sopa ile karışımı hafifçe karıştırın.</li>
	<li>Hemen solüsyonu dökün ve dikkatle çentikli tabak kenarı boyunca monte cam kalıplara neredeyse tepeye boşluğu doldurmak ve tarak ekleyin. Jel çözüm küçük hacmi tarak ekleyin. Not: cam plakanın jel sızıntı gelen önlemek için yatay tutun. Herhangi bir kabarcıklar balonu kanca ile kaldırın.</li>
	<li>Jel 30 dk için oda sıcaklığında ayarlamak izin verir. Not: Jel çözüm ve ortam sıcaklıklarında polimerizasyon süre değişebilir.</li>
	<li>Sonra jel tamamen polimerizasyonu, döküm kelepçeler kaldırmak ve üst arabellek rezervuar doğru bakan çentikli plakalı Elektroforez tankı biriminde tabak seti getirin ve büyük kelepçeler tank birimine ayarla plaka bağlamak için kullanın.</li>
	<li>1 L 0,5 × TBE tampon her üst ve alt rampaları dökün. Tarak kaldırmak ve tüm wells bir pipet veya şırınga kullanarak arabellek ile kanül. Not: jel sandviç alt plaka tamamen olmadan herhangi bir kabarcıklar arabellekte batırılmış olun.</li>
</ol>4. koşma jelleri
<ol><li>Yaklaşık 1 µL PCR ürününün polyacrylamide jel her kuyunun içine yükleyin. DNA boyutu merdivenle jel örnekleri PCR ürünlerinin yanı sıra her iki taraf için yükleyin. Emniyet kapak üst arabellek odasına düzeltmek.</li>
	<li>Müşteri adaylarını kırmızı-kırmızı ve siyah-siyah renk kodlu eşleşen güç kaynağına bağlayın. Jel boya normal ~ 70 dk için tanımlanmış bir konuma ulaşana kadar 110 V sabit bir gerilim çalıştırın. Not: Gerilim ve çalışan zaman PCR ürünleri büyüklüğüne göre ayarlanabilir.</li>
</ol>5. gümüş sigara-Polyacrylamide jel içinde SSR işaretleri algılamak için boyama
<ol><li>Elektroforez sonra bir büyük kabı üzerinden kapak üst odası arabelleğinden drenaj. Yan kelepçeler ayırmak, tabakları cihazları kaldırmak, dikkatle çentikli cam levha bir kenarı boyunca bir spatula ile ayırmak ve diğer cam levha bağlı jel kalır bağlama silane ile kaplı olduğundan emin olun.</li>
	<li>AgNO3 ' te 1 litre dH2O. hazırlamak 1 L / taze geliştirme çözümü 1,5 g NaOH 10 g dH2O 900 ml çözülerek çözülerek taze emprenye çözüm 1 L yapmak, 1 mL % 37 formaldehit ekleyin ve 1 L dH2O. kullanarak son bir seviyesini ayarlamak Not: eldiven giymek ve yukarıdaki kimyasallar ve çözümleri itina ile başa. Çözümler ve çözümleri ile ilgili adımlar bıraktığımız gerek yoktur.</li>
	<li>Dikkatle jel ve cam plaka Elektroforez arabellek kaldırma sonra plaka jel plastik bir tepsi yukarı dönük olacak şekilde yerleştirin ve emprenye çözüm 1 litre jel daldırın geniş dH2O ile yıkayın. Tepsiyi bir shaker koymak.</li>
	<li>Tepsiyi hafifçe 60 r/dk 3-4 dk için salla. Not: Saat sallayarak jel kalınlığı ve emprenye çözümde gümüş nitrat yoğunluğuna göre ayarlanabilir.</li>
	<li>Emprenye çözüm dışarı plaka taşımak ve başka bir tepsi koydu. Plaka ve geniş dH2O iki kez 3-5 s için her kullanarak jel yüzeyi kapalı kalan emprenye çözümden durulayın.</li>
	<li>Yukarı dönük olacak şekilde başka bir tepsi jel ile plaka koyun, geliştirme çözüm, 1 L plaka daldırın sonra tepsiyi hafifçe 50 r/dak ~ 3 dakika DNA görünümünü parçaları monitör süreyle sallamak. ve en yüksek oranı sinyal DNA parçaları geliştirme durdurur arka plan gürültü görülmektedir (Bu adım ~ 3 dakika sürer).</li>
	<li>Plaka ve jel ile geniş dH2O iki kez durulama ve jel tabak kağıt mendil ile kurulayın.</li>
	<li>Uygun bir tarayıcı kullanarak jel inceden inceye gözden geçirmek. 300 dpi çözünürlüğe DNA parçalarının açık bir görselleştirme verir. Jel de bir kamera ile fotoğrafı olabilir.</li>
	<li>SSR işaretleri bantlama deseni tabanlı görüntü DNA parçalarının üzerinde toplam.</li>
</ol>

<ol><li>Jiang, G. L. Molecular markers and marker-assisted breeding in plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJiang%2C+GL+%22Plant+breeding+from+laboratories+to+fields%22">Plant breeding from laboratories to fields</a>. Anderson, S. B. , InTech Press. Croatia. 45-83 (2013).</li>
<li>Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/1360138596868981">Polymorphism revealed by simple sequence repeats.</a> Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).</li>
<li>Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genic+microsatellite+markers+in+plants%3A+features+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genic microsatellite markers in plants: features and applications.</a> Trend Biotechnol. 23, 48-55 (2005).</li>
<li>Tuler, A. C., Carrijo, T. T., Nóia, L. R., Ferreira, A., Peixoto, A. L., da Silva Ferreira, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SSR+markers%3A+a+tool+for+species+identification+in+Psidium+%28Myrtaceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Rep%22%5BJournal%5D)">SSR markers: a tool for species identification in Psidium (Myrtaceae).</a> Mol. Biol. Rep. 42, 1501-1513 (2015).</li>
<li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+protein+silver+staining+in+polyacrylamide+gels%3A+a+10-year+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis.</a> Electrophoresis. 11, 785-794 (1990).</li>
<li>Bassam, B. J., Caetano-Anollés, G., Gresshoff, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+sensitive+silver+staining+of+DNA+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels.</a> Anal. Biochem. 196, 80-83 (1991).</li>
<li>Liang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+effective+method+for+silver+staining+of+PCR+products+separated+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">A rapid and effective method for silver staining of PCR products separated in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 35, 2520-2523 (2014).</li>
<li>Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+silver+stain+for+detecting+proteins+and+peptides+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels.</a> Anal. Biochem. 98, 231-237 (1979).</li>
<li>Sanguinetti, C., Dias, N., Simpson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+silver+staining+and+recovery+of+PCR+products+separated+on+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels.</a> Biotechniques. 17, PMID:7840973 915-919 (1994).</li>
<li>Ji, Y., Qu, C., Cao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimal+method+of+DNA+silver+staining+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">An optimal method of DNA silver staining in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 28, 1173-1175 (2007).</li>
<li>Qu, L., Li, X., Wu, G., Yang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+sensitive+method+of+DNA+silver+staining+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Efficient and sensitive method of DNA silver staining in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 26, 99-101 (2005).</li>
<li>An, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+silver+staining+procedure+for+nucleic+acids+in+polyacrylamide+gels+without+fixation+and+pretreatment%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A silver staining procedure for nucleic acids in polyacrylamide gels without fixation and pretreatment.</a> Anal. Biochem. 391, 77-79 (2009).</li>
<li>Byun, S. O., Fang, Q., Zhou, H., Hickford, J. G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effective+method+for+silver-staining+DNA+in+large+numbers+of+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels.</a> Anal. Biochem. 385, 174-175 (2009).</li>
<li>Kumar, M., Kim, S. R., Sharma, P. C., Pareek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+efficient+way+to+detect+small+polymorphic+bands+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Data%22%5BJournal%5D)">Simple and efficient way to detect small polymorphic bands in plants.</a> Genome Data. 5, 218-222 (2015).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+simple+and+effective+silver+staining+protocol+for+detection+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Development of a simple and effective silver staining protocol for detection of DNA fragments.</a> Electrophoresis. 38, 1175-1178 (2017).</li>
<li>Wang, D., Shi, J., Carlson, S. R., Cregan, P. B., Ward, R. W., Diers, B. W. <a target="_blank" href="https://scholars.opb.msu.edu/en/publications/a-low-cost-high-throughput-polyacrylamide-gel-electrophoresis-sys-3">A low-cost, high-throughput polyacrylamide gel electrophoresis system for genotyping with microsatellite DNA markers.</a> Crop Sci. 43, 1828-1832 (2003).</li>
<li>Echt, C. S., May-Marquardt, P., Hseih, M., Zahorchak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+microsatellite+markers+in+eastern+white+pine%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">Characterization of microsatellite markers in eastern white pine.</a> Genome. 39, PMID: 8983182 1102-1108 (1996).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Jel yıkandıktan sonra emprenye kritik bir adımdır. Yetersiz yıkama zaman ve su hacmi plaka ve jel yüzeyi üzerinde emprenye çözüm eksik kaldırılmasına neden ve karanlık bir arka planda neden. Uygun gelişmekte olan zaman başka bir önemli adım, aşırı geliştirme koyu kahverengi arka plan DNA parçalarının düşük kontrast görüntü ile sonuçlanabilir. Buna ek olarak, emprenye adım DNA parçalarının boyama verimliliğini önemli ölçüde etkiler. Her ne kadar boyama kalite emprenye süresi 5 dk genişletme veya AgNO3 toplamına...

PCR tabanlı işaretleri gelişimi bilim üreme1ve bitki genetik devrim yarattı. Basit sıralı tekrar (SSR) işaretleri arasında en sık kullanılan ve en çok yönlü DNA işaretlerine vardır. Onların geniş genom kapsamı, bereket, genom özgüllük ve tekrarlanabilirlik heterozigoz genotip2tespiti için ek olarak kendi codominant devralma SSR işaretleri yararları bazılarıdır. Çeşitli çalışmalarda SSR işaretleri genetik çeşitlilik araştırmak, soy izlemek, genetik bağlantı haritalar oluşturmak ve ekonomik açıdan önemli özellikleri3,4için gen eşlemek için kullandık.
PCR ürünleri SSR işaretleri kullanarak özel veya polyacrylamide Jel Elektroforez ve etidyum bromür ile boyama sonra gümüş boyama ile veya UV ışığı altında görüntülenir yaygın olarak ayrılır. Polyacrylamide jeller DNA parçalarının gümüş boyama diğer boyama yöntemleri5,'6 dan daha duyarlı ve yaygın olarak DNA parçalarının SSR işaretleri7gibi algılamak için kullanılan.
Gibi birçok biyolojik laboratuvar teknikleri, gümüş polyacrylamide jeller boyama giderek onun ilk bir parçası görselleştirme teknik 19798' olarak rapor ediliyor beri geliştirdi. Teknik DNA parçalarının tespiti için başlangıçta Bassam vd tarafından güncellenmiştir 6 1991 ve 1994 yılında Sanguinetti ve iş arkadaşlarınızla9 tarafından geliştirilmiş. Yöntem daha son birkaç on yıl6,7,9,10,11,12,13,14 ' te optimize , 15. ancak, iletişim kurallarının Güncellenme Zamanı bu sürümleri çoğu hala bu protokolleri7uygulama sınırı, yüksek teknik talep ve uzun süre fiksasyon için işleme ve6, montaj gibi bazı dezavantajları var 11. DNA parçası algılama yüksek verimlilik ile düşük maliyetli birleştiren bir en iyi Protokolü acilen biyolojik araştırmada boyama gümüş rutin uygulama için gereklidir.
Buna ek olarak, polyacrylamide jel denaturing ve sigara denaturing polyacrylamide jeller bölünmüş olabilir ve her ikisi de gümüş boyama yöntemi kullanarak SSR işaretleri tespiti için kullanılabilir. Etkisi ve kararlılık-in hangi önemli ölçüde farklı değildir, ama sigara denaturing polyacrylamide jeller süreci daha kolay ve daha az zaman16almak.
Önceki araştırma15temel alınarak, geçerli çalışmanın amacı ayrıntılı SSR işaretleri bir sigara denaturing polyacrylamide jel içinde hızlı, kolay ve düşük maliyetli algılanması için protokol boyama en iyi duruma getirilmiş bir gümüş tarif etmektir.

<table><tbody><tr><td>PCR ana karışımı (Yeşil Taq Karışımı)</td><td>Vazyme Biotech Co. Ltd, Çin</td><td>#P131-03</td><td></td></tr><tr><td>50-2000 bp DNA Merdiven</td><td>Bio-Rad, ABD</td> <td># 170-8200</td><td></td></tr><tr><td>DL500 DNA işaretleyici</td><td>Takara Bio Inc., Japonya</td><td>#3590A</td><td></td></tr><tr><td>Tris üssü</td><td>Sangon Biotech Şangay, Çin</td> <td># 77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Borik asit</td><td>Sangon Biotech Şangay, Çin</td> <td># 10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-Na2</td><td>Guangzhou Kimyasal Reaktif Fabrikası, Çin</td> <td># 6381-92-6</td><td></td></tr><tr><td>Akrilamid</td><td>Sangon Biotech Şangay, Çin</td> <td># 79-06-1</td><td></td></tr><tr><td>N, N'-metilen-bis-akrilamid</td><td>Sangon Biotech Şangay, Çin</td> <td># 110-26-9</td><td></td></tr><tr><td>N, N, N ', N'-Tetrametiletilendiamin</td><td>Sangon Biotech Şangay, Çin</td> <td># 110-18-9</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum persülfat</td><td>Guangzhou Kimyasal Reaktif Fabrikası, Çin</td> <td># 7727-54-0</td><td></td></tr><tr><td>Bind-silan</td><td>Solarbio Pekin, Çin</td><td>#B8150</td><td></td></tr><tr><td>AgNO3</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Beijing Co., Ltd, Çin</td> <td># 7761-88-8</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td>Tianjin DaMao Kimyasal Reaktif Fabrikası, Çin</td> <td># 50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Guangzhou Kimyasal Reaktif Fabrikası, Çin</td> <td># 1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>Guangzhou Kimyasal Reaktif Fabrikası, Çin</td> <td># 64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>Na < > 2 CO 3 </td> <td>Tianjin DaMao Kimyasal Reaktif Fabrikası, Çin</td> <td># 497-19-8</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Guangzhou Kimyasal Reaktif Fabrikası, Çin</td> <td># 64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>HNO3</td><td>Guangzhou Kimyasal Reaktif Fabrikası, Çin</td> <td># 7697-37-2</td><td></td></tr><tr><td>Na 2 S 2 O 3.5H 2 O</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Beijing Co., Ltd, Çin</td> <td># 10102-17-7</td><td></td></tr><tr><td>Eriokrom siyah T (EBT)</td> <td>Tianjin DaMao Kimyasal Reaktif Fabrikası, Çin</td> <td># 1787-61-7</td><td></td></tr><tr><td>Plastik tepsi</td><td>Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd,</td> <td>Çin-TS-1</td><td></td></tr> <tr><td>Shaker</td><td>Qilinbeter JiangSu,</td> <td>Çin-BenQ</td><td></td></tr> <tr><td>M800 Tarayıcı</td><td>BenQ,</td><td></td> Çin-DYY-6C <td></td></tr><tr><td>Güç kaynağı</td><td>Pekin Liuyi Enstrüman Fabrikası,</td> <td>Çin-Dikey</td><td></td></tr> <tr><td>jel sistemleri boyunca yüksek, JY-SCZF</td><td>Pekin Tunyi Elektroforez Co, Ltd, Çin</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

bir hızlı gümüş boyama protokolü etkinleştirme basit ve ssr bir sigara denaturing polyacrylamide jel kullanarak işaretleri, verimli algılama

A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel

Basit dizi tekrar (SSR) bitki ve hayvan genetik araştırma ve moleküler ıslah programlarında kullanılan en etkili işaretleri biridir. Gümüş boyama SSR işaretleri polyacrylamide jel içinde tespiti için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Ancak, gümüş boyama için geleneksel teknik olarak zor ve zaman alıcı iletişim kurallarıdır. Gibi birçok biyolojik laboratuvar teknikleri, iletişim kuralları boyama gümüş sürekli algılama verimliliği artırmak için optimize edilmiştir. Burada, önemli ölçüde reaktif maliyetlerini azaltır ve algılama çözünürlük ve görüntü netliğini artırır yöntem boyama basitleştirilmiş bir gümüş raporu. Yeni yöntem için sigara denaturing polyacrylamide jel iki önemli adım (emprenye ve geliştirme) ve üç reaktifler (Gümüş nitrat, sodyum hidroksit ve formaldehit) ve sadece 7 dakika işleme gerektirir. Daha önce raporlanmış iletişim kurallarına göre bu yeni yöntem daha hızlı, daha kolaydır ve daha az kimyasal reaktifler SSR algılama için kullanır. Bu nedenle, bu basit, düşük maliyetli ve verimli gümüş Protokolü boyama genetik haritalama ve marker-yardım etmek üreme SSR işaretçisi veri hızlı bir nesil tarafından yararlanacaktır.

PCR amplicons çiçekli Çin lahanası ve tütün ilgili SSR astar çiftleri kullanılarak üretildi. Elektroforez sonra belirsizliğe yer bırakmadan SSR işaretleri (şekil 1) bantlama şekillerinin Algılandı iletişim kuralı boyama yukarıdaki gümüş kullanarak polyacrylamide jeller lekeli.
Farklı gümüş protokolleri boyama algılama verimliliğini karşılaştırmak için PCR ürünleri SSR işaretleri tütün ve çiçekli Çin...

Burada, sadece üç reaktifler ve 7 min işleme gerektirir ve yüksek kaliteli SSR veri genetik analiz hızlı üretimi için uygundur Protokolü boyama basit ve düşük maliyetli bir gümüş raporu.

Bir hızlı gümüş boyama Protokolü etkinleştirme basit ve SSR bir sigara denaturing Polyacrylamide jel kullanarak işaretleri, verimli algılama

Simple Sequence Repeat (SSR) is one of the most effective markers used in plant and animal genetic research and molecular breeding programs. Silver ...

Bu protokolün genel amacı, denatüre olmayan poliakrilamid jellerde SSR belirteçlerinin hızlı, kolay ve düşük maliyetli tespiti için optimize edilmiş bir gümüş boyama yöntemi sunmaktır. SSR belirteçlerinin hızlı genotiplenmesi, moleküler ıslah programlarında genetik çeşitlilik analizi ve belirteç destekli seçim gibi genetik araştırma ve uygulama alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, SSR belirteçlerinin tespiti için diğer protokollere göre daha az zaman alması ve daha az kimyasal reaktif kullanmasıdır.Bu yöntem, geleneksel protokollerde bulunan sabitleme, durdurma ve birkaç yıkama adımını önler. Ve sadece emprenye ve geliştirmenin iki ana adımını gerektirir. SSR bantlama modellerinin kesin olarak algılanması için arka plan gürültüsü olmadığı için bu protokol kullanılarak net görüntüler üretilebilir.Bu teknik kullanılarak günde yaklaşık 800 DNA örneği taranabilir ve tütün ve çiçekli Çin lahanası araştırmalarında başarıyla kullanılmıştır. PCR ürünlerini ve jel solüsyonlarını metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, bir set cam plaka ve ara parçayı yıkamak için musluk suyunda deterjan kullanın ve ardından damıtılmış su ile tam bir durulama yapın. Plakaları havayla kuruması için bir plaka kurutma rafına yerleştirin.Dikdörtgen bir cam plakanın iç yüzeyine bir mililitre Bind-silan çözeltisi dağıtın ve beş dakika kurutun. Daha sonra, bir çubukla çentikli bir cam plakanın iç yüzeyine bir mililitre Repel-silan dağıtın ve plakanın beş dakika boyunca kurumasına izin vermeden önce fazla çözeltiyi silmek için bir kağıt mendil kullanın. Cam plakaları, çentikli plaka üstte olacak şekilde ara parçalarla birleştirin.Ve montajın her iki tarafını da sıkıştırmak için döküm kelepçeleri kullanın. Daha sonra, plaka seti için bir behere uygun miktarda %6 denatüre olmayan poliakrilamid jel çözeltisi dökün. 20 mikrolitre TEMED ve 200 mikrolitre taze %20 APS ekleyin ve hafifçe karıştırın.Çözeltiyi, çentikli plakanın kenarı boyunca monte edilmiş cam plakalara hemen ve dikkatlice dökün ve boşluğu neredeyse tepeye kadar doldurun. Ve tarağı yerleştirin. Daha sonra tarağın üzerine küçük bir hacimde jel solüsyonu ekleyin ve jelin oda sıcaklığında 30 dakika bekletin.Jel tamamen polimerize olduğunda, döküm kelepçelerini çıkarın ve plaka setini, çentikli plaka üst tampon rezervuarına bakacak şekilde elektroforez tankı ünitesine yerleştirin. Plaka setini tank ünitesine takmak için büyük kelepçeler kullanın. Üst ve alt bölmelerin her birine bir litre 0,5 X TBE tamponu dökün.Ardından tarağı çıkarın ve tüm kuyucukları iyice yıkamak için tamponla doldurulmuş bir pipet veya şırınga kullanın. Poliakrilamid jeli çalıştırmak için her kuyucuğa yaklaşık bir mikrolitre PCR ürünü yükleyin. Ayrıca, her iki ucuna da bir DNA merdiveni yükleyin.Ardından güvenlik kapağını üst tampon bölmesine sabitleyin. Kırmızıdan kırmızıya ve siyahtan siyaha kodlu rengi eşleştirerek kabloları güç kaynağına bağlayın. Boya tanımlanmış bir konuma ulaşana kadar jeli 110 voltluk sabit bir voltajda çalıştırın.Normalde, yaklaşık 70 dakika. Elektroforezin ardından valfi açın ve tamponu üst hazneden büyük bir behere boşaltın. Yan kelepçeleri ayırın ve plakayı cihazdan çıkarın.Ardından, çentikli cam plakayı bir taraf boyunca dikkatlice ayırmak için bir spatula kullanın ve jelin Bind-silan ile kaplanmış diğer cam plakaya bağlı kaldığından emin olun. Daha sonra, 1.5 gram gümüş nitratı bir litre damıtılmış suda çözerek bir litre taze emprenye çözeltisi hazırlayın. Daha sonra 10 gram sodyum hidroksiti 900 mililitre damıtılmış suda çözerek bir litre taze geliştirme çözeltisi hazırlayın.Bir mililitre %37 formaldehit ekleyin ve bir litrelik son hacme ayarlamak için damıtılmış su kullanın. Bol miktarda damıtılmış su ile, elektroforez tamponunu çıkarmak için jeli ve cam plakayı dikkatlice durulayın. Daha sonra plakayı jel yukarı bakacak şekilde plastik bir tepsiye yerleştirin ve jeli bir litre emprenye solüsyonuna batırın.Tepsiyi 60 RPM'de bir çalkalayıcı üzerinde üç ila dört dakika hafifçe sallayın. Plakayı emprenye solüsyonundan başka bir tepsiye aktarın. Daha sonra, kalan emprenye solüsyonunu plakanın yüzeyinden ve jeli her biri üç ila beş saniye boyunca iki kez durulamak için bol miktarda damıtılmış su kullanın.Emprenye işleminden sonra jel yıkama aşaması kritiktir. Yetersiz yıkama, nedenim, emprenye çözeltisinin eksik çıkarılması. Ve karanlık arka plan ile sonuçlanır.Yeri jel yukarı bakacak şekilde başka bir tepsiye yerleştirin. Plakayı bir litrelik geliştirme solüsyonuna batırın, ardından tepsiyi yaklaşık üç dakika boyunca 50 RPM'de hafifçe sallayın. DNA fragmanlarının görünümünü izleyin ve DNA fragmanlarının sinyalinin arka plan gürültüsüne en yüksek oranı gözlendiğinde gelişimi durdurun.Uygun geliştirme zamanı bir diğer önemli adımdır. Aşırı gelişme, DNA parçalarının düşük kontrastlı bir görüntüsüne sahip koyu kahverengi bir arka plana neden olabilir. Plakayı ve jeli bol damıtılmış su ile iki kez durulayın ve jel plakayı kurutmak için kağıt mendil kullanın.Ardından, jeli 300 DPI'da taramak için bir tarayıcı ve uygun yazılım kullanın ve DNA bantlarının net bir görselleştirmesini elde etmek için parlaklığı ve kontrastı ayarlayın. Son olarak, görüntüdeki DNA fragmanı boyutlarına göre SSR işaretleyicilerinin bantlama modelini puanlayın. Burada sunulan PCR amplikonları, çiçekli Çin lahanası ve tütününde karşılık gelen SSR primer çiftleri kullanılarak üretildi.Elektroforezden sonra, poliakrilamid jeller, bu videoda gösterilen gümüş boyama protokolü kullanılarak boyandı. Bu, SSR işaretleyicilerinin bantlama modellerini açık bir şekilde tespit etti. Farklı gümüş boyama protokollerinin tespit verimliliğini karşılaştırmak için, SSR belirteçlerinin PCR ürünleri PAGE kullanılarak ayrıldı ve yayınlanmış beş gümüş boyama protokolü ve bu videoda gösterilen altıncı bir yöntem kullanılarak görselleştirildi.Burada gösterilen protokol, en düşük arka plan gürültüsüne ve DNA parçalarının en yüksek kontrastına sahipti, böylece en yüksek görüntü netliğini üretti. Test edilen altı protokolden, burada gösterilen yöntem en az zaman alır ve en az sayıda kimyasal reaktif ve işlem adımı gerektirir. Son olarak, bu şekil, denatüre olmayan bir poliakrilamid jel üzerinde 50 ila 2000 bp'lik bir DNA markörünün seri seyreltilmesi kullanılarak ölçülen protokolün hassasiyetini göstermektedir.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa yedi dakika içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, emprenye ve geliştirme solüsyonlarının çapraz kontaminasyonunu önlemeyi unutmamak önemlidir. Geliştirildikten sonra, bu teknik araştırmacıların SSR belirteçlerini hızlı bir şekilde genotiplemesinin yolunu açtı.Bu videoyu izledikten sonra, gümüş boyama kullanarak denatüre olmayan bir poliakrilamid jeldeki SSR belirteçlerini nasıl basit ve verimli bir şekilde tespit edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Kimyasal reaktiflerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman eldiven gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

a-fast-silver-staining-protocol-enabling-simple-efficient-detection

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

, Jel proteinlerin elektroforetik yöntemlerle ayrılması ardından çeşitli boyama yöntemleri ile tespit edilebilir. Coomassie Mavi, Gümüş Boyama, SYPRO Turuncu, SYPRO Ruby ile proteinlerin Boyama Bu video gösterilmektedir.

Jeller içinde Proteinler Boyama

Bu video Kang göre kolloidal Coomassie G-250 boyama protokol sevdirmek...

Proteinler için Poliakrilamid Jeller Hızlı ve Hassas Kolloidal Coomassie G-250 Boyama

Biz son zamanlarda basit bir bakteriyel tespiti için floresan assay "mix-ve-okuma" kurmak için uygulanabilir Flourogenik DNAzyme probları üretmek için yeni bir yaklaşım bildirdin. Bu özel DNA sondaları böylece floresans sinyali kuşağa bakteriyel algılama çevirme belirli bakteri tarafından üretilen ham hücre dışı karışımı (CEM) varlığında, bir kromofor-değiştirilmiş-DNA RNA kimerik substratın bölünme katalize. Bu yazıda, "RFD-EC1" ifade belirli bir DNAzyme prob modeli bakterinin tespiti için...

Flourogenik DNAzymes kullanarak Bakterilerin Tespiti

Bu videoda, florojenik problar kullanarak toplam proteinin görselleştirilmesi için poliakrilamid jellerin gümüş boyama yöntemini gösteriyoruz.

Floresan Gümüş Boyama: Poliakrilamid Jellerdeki Toplam Proteini Görselleştirmek İçin Bir Teknik

Bu videoda, sülfatlanmış glikozaminoglikan oligosakkarit fragmanlarının kombine Alcian mavisi ve gümüş boyaması için bir prosedür gösteriyoruz. Bu kombine boyama tekniği, poliakrilamid jellerdeki farklı uzunluklardaki glikozaminoglikan polimerlerinin bantlarını önemli ölçüde çoğaltır.

Sülfatlanmış Glikozaminoglikanların Gümüş Boyanması: Poliakrilamid Jellerde Sülfatlanmış Glikozaminoglikanların Görselleştirilmesi İçin Bir Boyama Yöntemi

Bu video, proteinler için denatüre edici bir poliakrilamid bazlı ayırma tekniğini göstermektedir. Bu teknik, proteinlerin moleküler ağırlıklarına göre ön tanımlanmasına yardımcı olur.

Protein Analizi için Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi: Moleküler Ağırlığa Göre Proteinleri Ayırmak ve Görselleştirmek İçin Bir Teknik

Biz burada önemli bir biyolojik soruyu çözmek için bir vaka çalışması olarak kızılötesi floresan boya etiketli DNA probları ile birlikte saflaştırılmış SOX-2 proteinleri kullanılarak floresan Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Tahliller (FEMSA) optimize edilmiş bir protokol açıklar.

Kızılötesi Floresan Boya-etiketli oligonükleotidler kullanılarak Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi için optimize Protokol

En yaygın bağırsak içeriği macroinvertebrates, görsel analizlerdir. Av organizmaların morfolojik çeşitlilik hakkında yoğun bilgi gerektiren, onlar yumuşak gövdeli yırtıcı özledim ve, nedeniyle güçlü ezme yırtıcı solungaçlarınızı de dahil olmak üzere bazı organizmalar için neredeyse imkansız. Biz macroinvertebrate için detaylı, yeni genetik yaklaşımlar diyet tanımlaması solungaçlarınızı av sağlar.

Su Macroinvertebrates kullanma gruba özel rDNA astar genetik Gut içerik analizleri için laboratuvar iletişim kuralı

Bu yöntem bir SYBR yeşil jel ıslatarak seçici boyama ve jelleri içinde DNA'ın miktar sağlar ben / Nitro mavi Tetrazolium çözüm ve sonra güneş ışığı ya da mavi bir ışık kaynağına maruz. Bu işlem görünür bir çökelti oluşturur ve alan kullanımı için ideal hale neredeyse hiçbir ekipman.

DNA Formazan yağış mavi ışığa maruz tarafından indüklenen esas alarak yöntemini boyama

Burada, biz yeni bir floresan polyacrylamide jellerin toplam protein algılaması için teknik boyama özetleyen bir detaylı iletişim kuralı tanımlamak. Ag+algılar bir gümüş iyon özgü Floresans tahrik sonda protokol kullanır-protein kompleksleri ve geleneksel chromogenic gümüş lekeler belirli sınırlamaları ortadan kaldırır.

Floresan gümüş Polyacrylamide jeller proteinlerin boyama

Bu rapor, sülfatlı glikozaminolikanları (GAG) biyolojik örneklerden izole etme ve arındırma tekniklerini ve yaklaşık boyutlarına yönelik bir poliakrilamid jel elektroforez yaklaşımını açıklar. GAG'ler proteinlerle elektrostatik etkileşim yoluyla doku yapısına ve etki sinyalizasyon süreçlerine katkıda bulunur. GAG polimer uzunluğu, konyak ligandları için bağlayıcı yakınlıklarına katkıda bulunur.

Glikozamid Jel Elektroforez ve Gümüş Boyama ile Glikozaminolikanların Tespiti

Öğrenin, hızlı gümüş boyama yöntemiyle non-denaturing poliakrilamid jel üzerinde SSR işaretleyicilerini kolayca ve düşük maliyetle tespit etmeyi. Bu protokol, genetik çeşitlilik analizi ve moleküler ıslah çalışmaları için yüksek kaliteli sonuçlar sunar.

Bir hızlı gümüş boyama Protokolü etkinleştirme basit ve SSR bir sigara denaturing Polyacrylamide jel kullanarak işaretleri, verimli algılama (Video) | JoVE Journal

Bir hızlı gümüş boyama Protokolü etkinleştirme basit ve SSR bir sigara denaturing Polyacrylamide jel kullanarak işaretleri, verimli algılama

Daha fazla video keşfet