Floresan Gümüş Boyama: Poliakrilamid Jellerdeki Toplam Proteini Görselleştirmek İçin Bir Teknik

Poliakrilamid jellerdeki proteinlerin floresan gümüş boyaması, proteinleri tespit etmek ve miktarını belirlemek için florojenik problar kullanır.

Elektroforez yoluyla bantlara ayrılmış, proteinli bir poliakrilamid jel ile başlayın. Proteinleri denatüre ederek bantların yayılmasını önleyen fiksatif bir etanol ve asetik asit karışımına batırın.

Artık asetik asit ve etanolü çıkarmak için jeli yıkayın. Jeli gümüş nitrat lekesine batırın. Gümüş iyonları, proteinlerdeki negatif yüklü gruplara güçlü bir şekilde bağlanır.

Karanlıkta kuluçkaya yatın. Bağlanmamış gümüş iyon komplekslerini çıkarmak için jeli ultra saf suda durulayın.

Jeli, çok bileşenli bir florojenik prob - TPE-4TA içeren gelişmekte olan bir çözeltiye batırın. Bu anyonik prob, proteine bağlı gümüş iyonlarını hedef alır, probun florojenik özelliklerini aktive eden çözünmeyen agregalar oluşturur ve böylece floresan verir.

Floresan aktivasyonu agregasyona bağlı olduğundan, bağlanmamış problar herhangi bir sinyal yaymaz, bu da azaltılmış arka plan emisyonu ile toplam protein boyamasını mümkün kılar.

Jeli karanlıkta hafif çalkalama ile inkübe edin ve tam florojenik gelişme sağlayın. Bağlanmamış probları çıkarmak için jeli bir leke tamponuna aktarın. Son olarak, bant sinyal yoğunluğunu elde etmek için jeli görüntüleyin. Numunedeki toplam protein miktarını hesaplamak için floresan sinyal yoğunluğunu standart protein eğrisine göre çizin.

Elektroforezden sonra, jeli bir orbital çalkalayıcı üzerinde etanol ve asetik asit içeren 100 mililitrelik bir çözeltiye batırın ve 50 RPM'de çalkalarken oda sıcaklığında her biri 30 dakika boyunca iki kez inkübe edin. Daha sonra, jeli temiz bir kapta ultra saf suyla üç kez yıkayın ve her yıkama 10 dakika sürer.

İlk olarak,% 0.1'lik bir konsantrasyonda bir stok çözeltisi hazırlamak için 0.01 gram gümüş nitratı 10 mililitre ultra saf suda çözün. Gümüş nitrat çalışma çözeltisini yapmak için bu stok çözeltisinden 100 mikrolitre 100 mililitre ultra saf suya ekleyin. Bir davlumbazda, jeli kapalı bir cam hazneye 100 mililitre gümüş nitrat çalışma çözeltisine batırın.

Emprenye sırasında jeli ışıktan korumak için alüminyum folyo kullanın ve bir orbital çalkalayıcı üzerinde 50 RPM'de çalkalarken 1 saat inkübe edin. Bundan sonra, jeli temiz bir kapta iki kez ultra saf suyla yıkayın, her yıkamada yaklaşık 100 mililitre su kullanın ve 60 saniye sürün.

Arka plan lekelenmesini en aza indirmek için gümüş emprenye adımından sonra jeli temizlemek için ultra saf su kullanmak önemlidir.

İlk olarak, 3 miligram TPE-4TA boyasına 50 mililitre ultra saf su ekleyin. Çözeltiyi 3 dakika boyunca sonikleştirin ve boyanın çözülmesine yardımcı olmak için genellikle üç defaya kadar her sonikasyon seansı arasında 5 mikrolitre 1 molar sodyum hidroksit çözeltisi ekleyin. Ardından, boyanın tamamen çözündüğünden emin olmak için çözeltinin floresansını 365 nanometrelik bir UV lambası altında kontrol edin. Sadece zayıf veya yayıcı olmayan çözeltiler tam çözünmeyi gösterir.

Florojenik geliştirme solüsyonunu hazırlamak için, 90 mililitre ultra saf suya 10 mililitre TPE-4TA stok solüsyonu ekleyin. Çözeltinin pH'ını kontrol etmek için bir pH metre kullanın. PH aralığın dışındaysa, seyreltilmiş sodyum hidroksit çözeltisi veya asetik asit kullanarak çözeltiyi 7 ile 9 arasında bir pH'a ayarlayın.

Daha sonra, jeli 100 mililitre florojenik geliştirici solüsyon içeren temiz ve sızdırmaz bir kaba aktarın ve jelin tamamen daldırıldığından emin olun. Kabı kapatın ve ışıktan korumak için üzerini örtün. Kabı gece boyunca 50 RPM'de ve oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcı üzerinde çalkalayın.

Jeli temiz bir kaba aktarın ve 30 dakika boyunca 100 mililitre% 10 etanol içinde lekesini çıkarın. Ardından, jeli ultra saf suda 5 dakika durulayın. Jel, bir tezgah üstü aydınlatıcı üzerinde görselleştirilebilir veya 365 nanometre kanalında veya 302 nanometre kanalında bir jel dokümantasyon makinesinde görüntülenebilir.