Siyanobakteriler yüksek gerilim Cryo-elektron tomografi tarafından DNA sıkıştırma görselleştirme
17 Temmuz 2018
Bu iletişim kuralı, siyanobakteriler geçici DNA sıkıştırma görselleştirmek açıklar. Zaman uyumlu ekimi, floresans mikroskobu, Hızlı dondurma ve yüksek tarafından izleme gerilim cryo-elektron tomografi kullanılır. Bu metodolojileri için bir protokol sundu ve gelecekteki uygulamalar ve gelişmeler ele alınmıştır.
Bu yöntem, bakterilerin hücre döngüsü sırasında DNA yapısının nasıl değiştiği gibi mikrobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en önemli avantajı, herhangi bir ek işlem gerektirmeden uygun zaman noktalarında canlı duruma yakın tüm bakteri hücrelerinin üst yapısının görüntülenebilmesidir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir doktora sonrası olan Chihong Song ve Dr.Kaneko'nun laboratuvarından bir yüksek lisans öğrencisi olan Mako Hayashi olacak.
% 1.5 agar ve% 0.3 sodyum tiyosülfat içeren dokuz santimetrelik, sterilize edilmiş BG-11 plakalarında büyüyen siyanobakterilerle başlayın. Plakaları, saniyede metrekare başına 50 mikro-E ışıkla 12-12 ışık döngüsü altında 23 santigrat derecede inkübe edin. Hücreleri korumak için, bunları haftada bir taze BG-11 agar plakalarına aktarın.
Bir hafta içinde kültürler yeşil bantlar olarak ortaya çıkar. Yeşil hücre kümelerini alevle sterilize edilmiş bir halka kullanarak aktarın ve bunları yeni plakaya çizin. DNA sıkışmasını gözlemlemek için, ışık periyodunun sonunda altı gün boyunca kültürlenen hücreleri toplayın.
Hücreleri plakadan serbest bırakmak için, bir mililitre 0.2 molar sükroz ekleyin. Ardından, hücre süspansiyonunu toplayın ve çözelti yeşile dönene kadar sakaroz ilavesini ve çıkarmasını tekrarlayın. Renk değişimi, çoğu hücrenin serbest bırakıldığını gösterir.
Şimdi, 500 mikrolitre askıda hücre çözeltisini bir Mikrofüj tüpüne aktarın ve mililitre başına bir mikrogramlık nihai konsantrasyon için Hoechst boyası ekleyin. Ardından, hücrelerin karanlıkta 10 dakika kuluçkaya yatmasına izin verin. Daha sonra, hücreleri döndürün, süpernatanı atın ve 10 mikrolitre 0.2 molar sükroz içinde yeniden süspanse edin.
Daha sonra, süspansiyonun bir mikrolitresini bir cam slayta aktarın, bir kapak fişi koyun ve hücreleri bir UV filtresi ile donatılmış bir floresan mikroskobu altında gözlemleyin. 100 kez yağa daldırma hedefi kullanarak, hücrelerin çoğunda gözlemlenebilir olması gereken DNA sıkışmasının kanıtlarını arayın. İlk olarak, daldırmalı dondurma cihazını hazırlayın.
Ardından, etan kabını ve soğutma çubuğu ekini yerleştirerek sıvı nitrojen kabını kurun. Ardından, kabı sıvı nitrojenle doldurun ve sıvı nitrojen sıcaklığına soğutun. Bundan sonra, kabın içine etan gazı yükleyin.
Sıvı etan patlayıcı olduğu için koruyucu gözlük taktığınızdan emin olun. Son olarak, soğutma çubuğu ekini çıkarın ve donmayı önlemek için kabı plastik bir kapakla örtün. Devam etmek için, bir plazma iyon bariyeri kullanarak karbon kaplı bir EM ızgarasının karbon tarafını 30 miliamperde 50 saniye boyunca kızdırma deşarjı yapın.
Ardından Vitrobot'u test protokolüne göre hazırlayın. Ön işlem görmüş EM ızgarasını hazneye ayarlamak için cımbız kullanın. Numuneyi uygulamadan önce referans olarak hizmet etmesi için EM ızgarasına bir mikrolitre, 15 nanometre BSA altın izleyici uygulayın.
Şimdi, ızgaraya 2.5 mikrolitre hücre süspansiyonu alikot. Fazla çözeltiyi filtre kağıdı kullanarak kurulayın ve ızgarayı hemen sıvı etan içinde dondurun. Donmuş ızgarayı, incelenene kadar sıvı nitrojen içinde saklayın.
Ardından, HVEM'i başlatın ve bir megavoltluk yüksek bir voltaja ayarlayın. Ardından, numune ızgara tutucusunu sıvı nitrojen kullanarak eksi 150 santigrat dereceye kadar soğutun. Soğuduktan sonra, donmuş ızgarayı soğutulmuş kriyo-numune tutucusuna monte edin ve HVEM'e yükleyin.
Kurulumu buzla kirletmemeye dikkat edin. Şimdi, 1.000 kat düşük büyütme oranında bir görüntüleme alanı seçin. Ardından, ösentrik z ekseni yüksekliğini ayarlayın ve numune aşamasını eksi 60 dereceye eğin.
Ardından, eğme dönüşünün boşluğunu çıkarın. Şimdi, 10.000 kat büyütme ile hedef konumun yakınına odaklanın. Odaklanılan görüntüden sapma ile altı ila 10 mikron arasında bir alt odak ayarlayın.
Görüntüleme için, dozu saniyede angstrom kare başına iki elektron veya daha azına ayarlayın. Akım yoğunluğu tarafından yansıtılan elektron dozuna dikkat edin ve dijital kamera veya bir elektron filmi üzerinde bir görüntü alın. Ardından, iki ila dört derecelik artışlarla eksi 60 ila pozitif 60 derece arasında eğim görüntüleri toplayın.
Mümkünse mikroskobun otomatik özelliklerini kullanın. Ticari yazılım paketini açın ve tomografik rekonstrüksiyon için eğim görüntülerini yükleyin. Ardından, tif2mrc veya newstack komutunu kullanarak tek tek görüntülerden bir görüntü yığını dosyası oluşturun.
Ardından, eTomo GUI yazılımını başlatın ve piksel boyutu, referans çapı, görüntü döndürme vb. için görüntü parametrelerini girin. Böylece, düzenleme komut dosyasını oluşturun. Şimdi, 0,5'ten daha az ortalama kalıntı hatasıyla referans işaretleyiciler kullanılarak hizalanmış bir eğim serisi oluşturmak için önerilen yazılımı kullanın.
Son olarak, SIRT algoritmasını kullanarak bir 3B tomogramı yeniden oluşturun. Şimdi, tomogramdan ilgilendiğiniz bir bölgeyi çıkarın ve anizotropik difüzyon filtresi, iki taraflı filtre veya matematiksel morfoloji filtresi gibi bir gürültü giderme filtresi uygulayın. Görüntü kontrastını artıran parametreleri kullanarak filtrelemeyi gerçekleştirin.
Ardından, ilgilendiğiniz bir özelliği segmentlere ayırın. Tomogramı açmak için dilimleme özelliğini kullanın. Ardından, Segmentasyon Düzenleyicisi penceresine gidin ve bir segmentasyon dosyası oluşturmak için yeni bir etiket alanı seçin.
Ardından, ilgilenilen özelliğin kenarlığını ilk dilimde ve ardından diğer dilimlerin her birinde el ile izleyin. Aynı işlemler kullanılarak ek ilgi çekici özellik eklenebilir. Şimdi, segmentli birimi görselleştirmek için SurfaceGen menüsündeki seçenekleri kullanarak bir yüzey işleme oluşturmak için SurfaceView menüsünü seçin.
3B cildi taşımak, döndürmek ve yakınlaştırmak için 3B Görüntüleyici penceresindeki araçları kullanın. Sihirli Değnek Aracı kullanılarak otomatik segmentasyon yapılabilir. Bir nesneye tıklayın ve Görüntüleme ve Maskeleme'deki kaydırıcıları, nesnenin özellikleri tamamen seçili olacak şekilde ayarlayın.
Kesin bir senkron kültürde, Hoechst ile etiketlenmiş DNA, karanlık durumda normal bir homojen dağılım gösterir ve daha sonra ışık periyodu boyunca hücre içinde aşamalı olarak sıkışır ve ışık periyodunun sonunda dalgalı çubuk benzeri bir yapı alır. Son olarak, çubuk merkezde bölünür ve iki parçası yavru hücrelere dağıtılır. Hücre bölünmesinden sonra, sıkıştırılmış DNA hemen kaybolur ve DNA normal bir homojen dağılıma geri döner.
DNA sıkıştırmasının son aşamasındaki hücreler dondurulduğunda ve yüksek voltajlı elektron mikroskobu kullanılarak gözlemlendiğinde, birçoğu normal hücrelerden kolayca ayırt edilebilen farklı DNA sıkışması gösterdi. Bazıları, hücre bölünmesinden önce beklendiği gibi hücrelerin merkezinde bir daralma sergiledi. 3D tomogramlardan, kompakt DNA sitoplazmada gözle görülür şekilde ayrılır ve düşük yoğunluklu bir malzeme ile çevrilidir.
Tilakoid zar katmanları, sıkıştırılmış DNA'nın dalgalı çubuğu boyunca bozulur. İlginç bir şekilde, birçok küçük fosfat cismi sıkıştırılmış DNA'ya yapışır ve genellikle çiftler halinde görünür. Bu polifosfat cisimleri, DNA sentezi için fosfat tedarikçileri olabilir.
Bu videoyu izledikten sonra, kriyo-yüksek voltajlı elektron mikroskobu ile kriyo-yüksek voltajlı elektron mikroskobu ile canlı duruma yakın tüm bakteri hücrelerinin üst yapısını, boyama gibi ek bir işlem yapmadan nasıl görüntüleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü denerken, DNA sıkıştırma durumunun ışık döngüsünün sonunda her dakika değiştiğini hatırlamak önemlidir. Numuneyi dondurmak için en iyi zamanlamayı kaçırmadığınızdan emin olun.
Bu prosedürü takiben, sıkıştırılmış DNA'daki spesifik proteinlerin veya nükleotidlerin lokalizasyonu hakkında ek soruları yanıtlamak için CLEM gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, mikrobiyoloji alanındaki araştırmacıların bakterilerde veya küçük ökaryotlarda hücre bölünmesi, DNA ayrışması ve viral enfeksiyonu keşfetmelerinin önünü açmalıdır.
Genel Bakış
Bu protokol, floresan mikroskopi ve kriyo-elektron tomografi kullanarak siyanobakterilerde geçici DNA sıkışmasını görselleştirme yöntemi tanımlamaktadır. Çalışma, hücre döngüsü sırasında DNA yapısı değişikliklerini gözlemlemenin önemini vurgulayarak, siyanobakteri hücrelerinin görüntüleme için ekilmesi ve hazırlanmasını ana hatlarıyla belirtmektedir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Hücre Biyolojisi
- Yapısal Biyoloji
Arka Plan
- DNA sıkışmasının anlaşılması, bakteri hücre döngüleri hakkında bilgiler sağlamak için kritik öneme sahiptir.
- Floresan mikroskopi, hücresel süreçlerin gerçek zamanlı gözlemlenmesini sağlar.
- Kriyo-elektron tomografi, hücresel ultrayapının yüksek çözünürlüklü görüntülemesini sağlar.
- Bu yöntem, ek işlemler olmadan canlı duruma yakın görselleştirmeyi sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Hücre döngüsü sırasında siyanobakterilerde DNA sıkışmasını görselleştirmek.
- Floresan mikroskopi ve kriyo-elektron tomografi kullanımı için bir protokol geliştirmek.
- Bu görüntüleme tekniğinin gelecekteki uygulamalarını tartışmak.
Kullanılan Yöntemler
- BG-11 agar plaklarında siyanobakterilerin ekilmesi.
- DNA sıkışmasını gözlemlemek için Hoechst boyamalı floresan mikroskopi.
- Kriyo-elektron tomografi için numunelerin hızlı dondurulması.
- Hücresel yapıları analiz etmek için tomogramların 3D yeniden yapılandırılması.
Ana Sonuçlar
- Hoechst ile etiketlenen DNA, karanlıkta homojen bir dağılım gösterir.
- Işık döneminde, DNA kademeli olarak dalgalı çubuk benzeri bir yapıya sıkışır.
- Sıkıştırılmış DNA, yavru hücrelere bölünür ve dağılır.
- Yüksek çözünürlüklü görüntüleme, ayrıntılı hücresel ultrayapıyı ortaya çıkarır.
Sonuçlar
- Bu yöntem, siyanobakterilerde DNA sıkışmasını etkili bir şekilde görselleştirir.
- Bakteryal hücre döngülerinin dinamiği hakkında bilgiler sağlar.
- Protokol, mikrobiyoloji alanında çeşitli uygulamalar için uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables visualization of transient DNA compaction in cyanobacteria, a dynamic process linked to cell division. By combining fluorescence monitoring with high-voltage cryo-electron tomography, it provides a reproducible workflow to capture and resolve short-lived subcellular events in near-native state. The approach supports mechanistic de-risking in antimicrobial target validation by revealing structural dynamics of bacterial chromosome segregation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of DNA structural dynamics during bacterial cell cycle, supporting target validation for chromosome segregation mechanisms.
- Operational Value: Provides a correlative light and electron microscopy (CLEM)-compatible workflow to link functional fluorescence signals with ultrastructural context.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of synchronized bacterial cultures for time-resolved imaging, enabling assay-ready systems for compound-induced structural perturbations.
- Operational Value: Standardizes sample preparation via sucrose-based release and Hoechst staining, improving reproducibility across microscopy platforms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Visualizes DNA-protein interactions and membrane remodeling during compaction, informing translational biomarker discovery related to cell division fidelity.
- Operational Value: Supports continuity from discovery to preclinical by providing a platform to evaluate genetic or chemical perturbations on DNA dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing in early biology to mechanistic validation in lead optimization, particularly for targets involved in bacterial cell cycle regulation.
- Discovery Biology: Enables direct observation of DNA compaction dynamics, supporting hypothesis testing of cell cycle regulators and structural proteins.
- Screening: Produces synchronized, fluorescence-competent cells suitable for high-content imaging and compound screening assays.
- Analytics: Generates quantitative 3D tomograms and segmentation data enabling morphometric analysis of DNA structure, membrane distortion, and phosphate body association.
- Translational Research: Links observed DNA compaction phenotypes to downstream phenotypes like division fidelity, supporting biomarker alignment in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for investigating transient bacterial structures such as phage infection, septum formation, or plasmid segregation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target mechanism by visualizing native-state DNA architecture and its temporal changes.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized synchronization, staining, and cryo-fixation protocols.
- Strategic Value: Reduces biological de-risking uncertainty in antibiotic target validation by providing direct structural evidence of target engagement effects.
- Portfolio Impact: Enables data-driven go/no-go decisions based on ultrastructural phenotypes linked to essential cellular processes.
Implementation Considerations
- Expertise in microbial culture synchronization, fluorescence microscopy, and cryo-electron tomography instrumentation.
- Access to high-voltage electron microscope (HVEM) capable of 1 MV operation and cryo-specimen handling.
- Standardization of fluorescence timing and freezing protocols across laboratories to capture transient events.
- Adaptation considerations for other bacterial species with varying cell size, wall structure, or DNA dynamics.
- Practical limitations include the transient nature of DNA compaction requiring precise timing and the need for specialized HVEM infrastructure.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:43
Synchronous Culture of Cyanobacteria and Monitoring by Fluorescence Microscopy
2:31
Sample Freezing and Cryo-HVET
5:16
Tomographic Reconstruction and Segmentation of the Feature of Interest
7:20
Results: Observations of Compacted DNA in Cyanobacteria
8:36
Conclusion
