Name: Siyanobakteriler yüksek gerilim Cryo-elektron tomografi tarafından DNA sıkıştırma görselleştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Öğrenin, siyanobakterilerde DNA sıkışmasını yüksek gerilim kriyojenik elektron tomografi ile görselleştirme yöntemini. Bu teknik, bakteri hücre döngüsü dinamiklerini canlı duruma yakın çözünürlükte incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Tammo Reisewitz el yazması ve hem Mako Hayashi ve Sayuri Hagiwara dikkatli ekimi için eleştirel okuma ve Siyanobakteriler, görüntü işleme için Yoshitaka Kimori, Chihong şarkı, Naoyuki Miyazaki ve Miyoko gözlem için teşekkür ederiz Nagayoşi yapıları bölümleme ile yardım ettiğin için. Bu eser için Fizyolojik Bilimler (NIPS) Y.K. için ulusal Enstitü ortak çalışma programı tarafından desteklenen

1. zaman uyumlu Siyanobakteriler kültürünün
<ol><li>S. elongatus PCC 7942 %1,5 (w/v) agar ve %0,3 (w/v) sodyum thiosulfate8içeren steril BG 11 plaka (içinde 9 cm steril plastik petri kabına) üzerinde kültür.</li>
	<li>Tabakları bir büyüme Odası 23 ° c ile 50 µE/m2/s ve 12 h ışık/12 s karanlık döngüleri tabi bir ışık şiddeti yerleştirin.</li>
	<li>Hücreleri üzerine taze BG11 ağar kaplamalar haftada bir kez transfer. Not: Kültürler agar üzerinde yeşil şeritler halinde görünür bu kültür koşul altında bir hafta sonra aktif Proliferasyona hücreleri.</li>
	<li>Yeşil kümeleri bir alev sterilize tel döngü ve çizgi içeren hücrelerin hücre bir taze BG11 agar plaka üzerine al. Temiz bir bankta bunu.</li>
</ol>2. izleme tarafından floresans mikroskobu
<ol><li>6 gün agar tabakta kültürlü hücreleri DNA sıkıştırma gözlemlemek için kullanın. Hücreleri plaka ışık dönemin sonunda hücrenin üzerine dökülen 1 mL tarafından 0.2 M Sükroz çözeltisi toplamak. Böylece hücrelerin çoğu toplanan çözüm hücreleri dökülen yineleyin. Askıya-hücre çözümü DNA boyama için mikro bir tüp içine aktarın.</li>
	<li>DNA 500 µL askıya alınan hücre çözüm 1 µg/ml nihai bir konsantrasyon için mikro bir tüp boya (Örneğin Höchst 33342) çözüm boyama ekleyin. Daha sonra tüp 10 min için karanlıkta tutmak.</li>
	<li>2.000 x g tortu için de 1 dk. için hücreleri santrifüj kapasitesi. Süpernatant atmak ve bir yoğun hücre süspansiyon elde etmek için 0.2 M Sükroz çözüm 10 µL ekleyin.</li>
	<li>Bir slayt cam için lekeli hücreleri içeren çözüm 1 µL transfer için bir kapak kayma koymak ve 100 X ve daldırma yağ bir büyütme ile bir objektif lens kullanarak UV filtre ile donatılmış bir floresan mikroskop ile gözlemlemek.</li>
	<li>DNA sıkıştırma en hücreleri bu noktasında görülmektedir onaylayın, sonra örnek dondurucu adım için hazır olun.</li>
</ol>3. örnek Cryo-HVET için dondurma
<ol><li>Dalma-donma aygıtı ayarlama. Sıvı azot ile tank doldurmak ve cryo-odası soğutma tankı ve odası ile bir Teflon tüp bağlandıktan sonra başlar.</li>
	<li>Sıvı azot sıcaklık odasına aşağı soğutma sonra odanın içinde bir küçük bakır pota sıvı etan doldurun. Sıvı etan patlayıcı olduğu için işlem sırasında gözlük.</li>
	<li>Kızdırma boşaltma delikli bir karbon kaplı icin karbon tarafında kılavuz (delikli ızgara) 30 s 50 plazma iyon bombarder kullanarak anne.</li>
	<li>1 µL BSA altın izleme uygulamak (15 nm) delikli ızgarasına indirgeme bir işaretleyici olarak.</li>
	<li>2.5 µL aliquot hücrelerinin DNA düzenleme aşamasında delikli ızgarasına uygulanır. Bir filtre kağıdı fazlalık çözümüyle kapalı leke. Kılavuz kullanarak bir dalgıç dalma dondurucu cihaz hemen sıvı etan Dalma.</li>
	<li>Onlar incelenir kadar donmuş ızgaralar sıvı azot depoda saklamak.</li>
</ol>4. Cryo-HVET
<ol><li>1 yüksek gerilim, HVEM kurmak MV.</li>
	<li>Cryo-numune tutucu-150 ° c cryo-iş istasyonu içinde sıvı azot ile precooled HVEM için dondurulmuş kılavuzunda mount ve HVEM yükleyin. Buz tarafından kirlenmesini önlemek için dikkatli olun.</li>
	<li>1, daha düşük büyütmede görüntüleme alanı seçme 000 X. Eucentric z ekseni yüksekliğini ayarla.</li>
	<li>Örneği Sahne Alanı'na-60 ° eğim ve tepki devirme dönme kaldırın.</li>
	<li>Bir büyütme 10, hedef konumda yakın odak ayarlamak 000 X. Ayarla bir 6-10 µm odaklı görüntü sapma tarafından odak noktası altında. Görüntüleme için doz 2 e-/Å-2 için ayarla veya önceden numune üzerinde daha az.</li>
	<li>HVEM görüntü ekranda akım yoğunluğu tarafından elektron doz ölçmek. Fotoðraf bir elektron film veya dijital kamera odaklama işleminin olduğu gibi aynı büyütmede tarafından.</li>
	<li>Tilt görüntüleri el ile (4.5) olduğu gibi aynı yordam tarafından-60 ° ila + 60 ° 2 ° ila 4 ° tilt açı artışı, toplamak. Not: içinde birçok modern elektron mikroskoplar, tilt serisi edinimi bir dijital fotoğraf makinesi kombinasyonu tarafından otomatikleştirilmiştir. Bu durumda, kullanım kılavuzu izleyin. Negatif ince tabaka için için bir su tankında tam güçte geliştirici kullanarak Geliştirici 20 ° C'de 12 dk filmler geliştirmek ve düzeltmek bir fixer 10 dk. dijital ortama için 4000 dpi (0.635 nm/piksel görüntü üzerinde) bir çözünürlükte filmler düz yataklı tarayıcı kullanarak. Bir dijital fotoğraf makinesi söz konusu olduğunda toplanan görüntüleri doğrudan sonraki görüntü işleme adımının için tabi. Gerekirse, iki ila dört binning (boyutu azaltma faktörü) ve ilgili yazılım (Örneğin ImageJ) kullanarak bir Medyan filtresi tarafından görüntü boyutunu azaltmak.</li>
</ol>5. tomografik imar
<ol><li>Komut "tif2mrc" veya "newstack" but yazılım9' kullanarak görüntüleri eğimli bir yığın görüntü dosyasından tek tek yapmak.</li>
	<li>BUT içinde eTomo GUI yazılım başlatın ve görüntü parametreleri ayarlayın: piksel boyutunu, indirgeme çapı, görüntü döndürme, vb. Daha sonra komut dosyaları oluşturun.</li>
	<li>Malzemeler, tablolarda listelenen yazılımlar göre bireysel programları çalıştırmak nerede tilt serisi (bir ortalama artık hata ile 0.5 daha az) indirgeme işaretçileri kullanarak hizalanır. Son olarak, but içinde SIRT algoritmasıyla bir 3D tomogram yeniden.</li>
	<li>Faiz (ROI) bölgesinin tomogram ayıklamak ve denoise filtre kullanarak denoise: bir anizotropik difüzyon but, EMAN10ikili bir filtre veya matematiksel bir morfoloji filtre11, vb, uygun parametrelerle birlikte karşıtlığı artırmak için.</li>
</ol>6. ayrılmasını faiz özelliği
Not: aşağıda açıklanan yordamı yazılım kullanılan (bkz: Malzemeler tablo) özgüdür ancak diğer yazılım paketleri yerine kullanılabilir. Onların Kullanıcı kılavuzuna başvurun.
<ol><li>3B görüntüleyici penceresinde Amira yazılım tomogram dosyasını açın ve bir OrthoSlice oluşturmak.</li>
	<li>Segmentasyon Düzenleyicisi penceresinde, yeni bir "etiket alan" seçerek bir bölümleme dosyası oluşturun.</li>
	<li>El ile ilgi (FOI) özelliğinin kenarlığı izleyin. Bütün tomogram dilimleri ile FOI izleyin. İkinci FOI için yeni bir "malzeme" oluşturmak ve aynı işlemi yineleyin.</li>
	<li>"SurfaceGen" menüsünden seçerek bir yüzey işleme oluşturmak. Kesimli birimin görselleştirmek için "SurfaceView" menü. Taşımak, döndürmek ve 3B cilt yakınlaştırmak için 3D Görüntüleyici penceresinde araçları kullanın.</li>
	<li>Otomatik bölümleme için Sihirli Değnek aracını kullanın. Bir nesne üzerinde tıklatın ve görüntü ve maskeleme böylece tam özellikleri tarafından seçilen değer aralığını kapsayacak şekilde kaydırıcıları ayarlayın.</li>
</ol>

<ol><li>Smith, R. M., Williams, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythms+in+gene+transcription+imparted+by+chromosome+compaction+in+the+cyanobacterium+Synechococcus+elongatus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythms in gene transcription imparted by chromosome compaction in the cyanobacterium Synechococcus elongatus.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 103 (22), 8564-8569 (2006).</li>
<li>Kondo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cyanobacterial+circadian+clock+based+on+the+kai+oscillator%5BTitle%5D)+AND+%22CSHS+Quant.+Biol%22%5BJournal%5D)">A cyanobacterial circadian clock based on the kai oscillator.</a> CSHS Quant. Biol. 72, 47-55 (2007).</li>
<li>Seki, Y., Nitta, K., Kaneko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+polyphosphate+bodies+and+DNA+during+the+cell+division+cycle+of+Synechococcus+elongatus+PCC+7942%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+biol%22%5BJournal%5D)">Observation of polyphosphate bodies and DNA during the cell division cycle of Synechococcus elongatus PCC 7942.</a> Plant biol. 16 (1), Stuttgart, Germany. 258-263 (2014).</li>
<li>Murata, K., Hagiwara, S., Kimori, Y., Kaneko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+compacted+DNA+in+cyanobacteria+by+high-voltage+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of compacted DNA in cyanobacteria by high-voltage cryo-electron tomography.</a> Sci. Rep. 6, 34934(2016).</li>
<li>Koster, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+of+molecular+and+cellular+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+struct.+boil%22%5BJournal%5D)">Perspectives of molecular and cellular electron tomography.</a> J. struct. boil. 120 (3), 276-308 (1997).</li>
<li>Lučić, V., Rigort, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography%3A+The+challenge+of+doing+structural+biology+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography: The challenge of doing structural biology in situ.</a> J. Cell Biol. 202 (3), 407-419 (2013).</li>
<li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Adsorption+of+Cyanophage+P-SSP7+onto+Marine+Prochlorococcus%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Visualizing Adsorption of Cyanophage P-SSP7 onto Marine Prochlorococcus.</a> Sci. Rep. 7, 44176(2017).</li>
<li>Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://mic.microbiologyresearch.org/content/journal/micro/10.1099/00221287-111-1-1">Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of Cyanobacteria.</a> J. Gen. Microbiol. 111, 1-61 (1979).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J.+struct.+boil%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J. struct. boil. 116, 71-76 (1996).</li>
<li>Jiang, W., Baker, M. L., Wu, Q., Bajaj, C., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+a+bilateral+denoising+filter+in+biological+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Applications of a bilateral denoising filter in biological electron microscopy.</a> J. Struct. Biol. 144, 114-122 (2003).</li>
<li>Kimori, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+image+processing+for+quantitative+shape+analysis+of+biomedical+structures%3A+effective+contrast+enhancement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Sync.+Rad%22%5BJournal%5D)">Morphological image processing for quantitative shape analysis of biomedical structures: effective contrast enhancement.</a> J. Sync. Rad. 20, 848-853 (2013).</li>
<li>Jun, S., Zhao, G., Ning, J., Ga Gibson,, Watkins, S. C., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+microscopy+for+3D+structural+analysis+of+dynamic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Visual.+Exper%22%5BJournal%5D)">Correlative microscopy for 3D structural analysis of dynamic interactions.</a> J. Visual. Exper. 76, e50386(2013).</li>
<li>Murata, K., Esaki, M., Ogura, T., Arai, S., Yamamoto, Y., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+imaging+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+by+high-voltage+scanning+transmission+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicros%22%5BJournal%5D)">Whole-cell imaging of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by high-voltage scanning transmission electron tomography.</a> Ultramicros. 146, 39-45 (2014).</li>
<li>Kortje, K. H., Paulus, U., Ibsch, M., Rahmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+thick+sections+of+nervous+tissue+with+energy-filtering+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Imaging of thick sections of nervous tissue with energy-filtering transmission electron microscopy.</a> J. Microsc. 183, 89-101 (1996).</li>
<li>Bouwer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+most-probable+loss+tomography+of+thick+selectively+stained+biological+specimens+with+quantitative+measurement+of+resolution+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated most-probable loss tomography of thick selectively stained biological specimens with quantitative measurement of resolution improvement.</a> J. Struct. Biol. 148 (3), 297-306 (2004).</li>
<li>Egerton, R. F., Li, P., Malac, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+damage+in+the+TEM+and+SEM%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Radiation damage in the TEM and SEM.</a> Micron. 35 (6), 399-409 (2004).</li>
<li>Danev, R., Buijsse, B., Khoshouei, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volta+potential+phase+plate+for+in-focus+phase+contrast+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Volta potential phase plate for in-focus phase contrast transmission electron microscopy.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 111 (44), 15635-15640 (2014).</li>
<li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zernike+phase+contrast+cryo-electron+microscopy+and+tomography+for+structure+determination+at+nanometer+and+subnanometer+resolutions%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Zernike phase contrast cryo-electron microscopy and tomography for structure determination at nanometer and subnanometer resolutions.</a> Structure. 18 (8), 903-912 (2010).</li>
<li>Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nmeth/journal/v11/n4/abs/nmeth.2842.html">Cryo-scanning transmission electron tomography of biological cells.</a> Nat. Methods. 11 (4), 423-428 (2014).</li>
<li>Ophus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+linear+phase+contrast+in+scanning+transmission+electron+microscopy+with+matched+illumination+and+detector+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Comm%22%5BJournal%5D)">Efficient linear phase contrast in scanning transmission electron microscopy with matched illumination and detector interferometry.</a> Nat. Comm. 7, 1-7 (2016).</li>
<li>Schertel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo+FIB-SEM%3A+Volume+imaging+of+cellular+ultrastructure+in+native+frozen+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens.</a> J. Struct. Biol. 184 (2), 355-360 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

Biz bir sıra geçici DNA sıkıştırma Siyanobakteriler içinde görüntülenmesi için iletişim kurallarının sundu. Temel kavram bağdaşık ışık ve elektron mikroskobu (CLEM)12benzemektedir. Buna ek olarak, bu yöntemde, canlı Siyanobakteriler floresans mikroskobu tarafından izlenen, hızla EM ızgaralar donmuş ve doğrudan yüksek gerilim cryo-elektron tomografi ile görüntülenir. İlk uygulama, DNA'ın ayrıntılı yapısı bakteri hücreleri sıkıştırılmış gibi başarılı bir şekilde 3D görselleştirildiği. Şu anda, bu konuya özel bir işlemdir ama daha kapsamlı, bazı durumlarda değiştirilmiş metodolojisi ile uygulanacaktır. Burada, avantajları, sınırlamaları ve bu yöntemi gelecekteki olanakları ele alınmıştır.
Bu yöntemin avantajları, biri bütün hücre 3D görselleştirme. 1 MV HVEM başarıyla görüntülenir Dinamik DNA hücre altı organelleri yapısını sıkıştırılmış hücreleri. Ancak, normal hücrelere ince yapısı nedeniyle düşük görüntü kontrastı ayırt edilebilir değil. Esnek olmayan artan ve kalın numuneler birden çok saçılma bulanıklaştırır görüntü13. Sıfır-kaybı ve en olası kaybı görüntü bir enerji filtresi yoluyla filtre elastik saçılma14,15azaltarak görüntü kontrastı artırabilir ama numuneler iMFP kalın için çalışmaz. Sıfır-kaybı ve en olası kaybı doruklarına numune kalınlığı ile büyük ölçüde azaltır. Elektron hassas buz gömülü numuneler için yeterli bir sinyal-gürültü oranı elde etmek özellikle zordur. Murata vd göstermiştir bu 1MV tarama iletim plastik parlak alan görüntüde daha yüksek görüntü kontrastı Maya hücreleri 5 µm kalınlık ile gömülü mikroskobu (kök) verir nerede görüntü kontrastı öncelikle genlik kontrast13 tarafından verilir . Ancak, daha yüksek hızlandırılmış elektron Knock hasar etkisi zarar duyarlı cryo-numune16için ışınlama doz için başka bir sınırlama oluşturur bekleniyor. Faz plaka17,18 Volta ve Frits kullanma HVEM için toplam doz gelecekte azaltarak Knock zarar azaltmak mümkün olabilir. HVEM için kalın örnekler kullanarak başka bir sınırlama HVEM sağlamak Kullanıcı Özellikleri dünya çapında kıt olduğu gerçeği gelir.
Kalın numuneler, cryo-kök tomografi vasıl 300 gözlemlemek için alternatif bir yöntem kullanarak kV yüksek kontrastlı görüntüler dondurulmuş-sulu numuneler üzerinde birkaç yüz nanometre19aşan kalınlı¤ında göstermiştir. Cryo-kök faz kontrast almak için elektron pthychographic mikroskobu Ayrıca, faz plaka kondansatör objektif bir faz modülasyonlu kırınım pixelated 2D dedektörü20transposes girmiştir. Görüntüleri birden çok diffractions hesaplamadan tarafından alınır. Doğrudan ve hızlı 3D cryo-görüntüleme büyük yerli cryo-yalan-SEM örnekleri, donmuş Ayrıca kullanılan21, seri nerede ile odaklı iyon kiriş kesit ve yüz görüntüleme engellemek için görüntüleme tamamen donmuş numuneler sulu için uygulanır. Bu teknolojiler Biyolojik örneklerin görüş yelpazesini genişletmek, bakteri, hedef konumunu bulmak zor olsa da Örneğin etiketli bakteri, çünkü hedef tamamen buz altında ve kırpma önce tanımlanamıyor.
DNA sıkıştırma Siyanobakteriler farklı bir yapıda üretir. DNA sıkıştırılmış hücreleri bile normal hücrelerde mevcut değil bir büyük yoğunluk önyargı hücrelerindeki nedeniyle lekeli olmadan kolayca ayırt edilirler. Ancak, hücre içinde daha fazla yerel etkinlikler görselleştirmek için fluorescently etiketli ROI elektron mikroskobu aktarmak gereklidir. Bağdaşık ışık ve elektron mikroskobu (CLEM) için ışık mikroskobu görüntüler ve elektron mikroskobu görüntüleri genellikle EM Bulucu ızgaralar12tarihinde floresan lateks boncuk veya kuantum nokta kullanarak correlated. Etiketleme parçacıklar yüksek elektron yoğunluğu floresans yanı sıra olması gerekir. Doğru ve güvenilir bir şekilde iki görüntü arasında pozisyonlar ilişkilendirmek. Ayrıca, etiketli alanı cryo-ışık mikroskobu ile teyit ederek, Roi tam örtüşme arasında iki mikroskoplar elde edilebilir. Bu parçacıklar ve cryo-ışık mikroskobu DNA sıkıştırma daha ayrıntılı yapısal olaylar karakterize, daha sağlam ve doğru bir ilişki içinde belgili tanımlık gelecek için vazgeçilmez bir araç olacaktır.
Bu makalede, siyanobakteriler DNA sıkıştırma geçici yapısını zaman uyumlu kültür, floresans mikroskobu ve yüksek gerilim cryo-elektron tomografi birleşimiyle karakterize gösterilmiştir. Bu iletişim kuralı sıkıştırılmış DNA gözlem üzerinde duruluyor. Bu yöntem yukarıda bahsedilen diğer yeni teknolojilerle birleştirildiğinde, bu DNA sıkıştırma daha ayrıntılı süreci araştırmak mümkün ve uygun değiştirilmiş yöntemleri yaygın olarak bakteri diğer dinamik yapısal olaylara tabidir.

DNA sıkıştırma bazı Siyanobakteriler olduğu belirlendi dramatik bir sitoplazmik olaydır. Ne zaman Synechococcus elongatus altında 12 h her ışık/karanlık döngüsü, görünümü diğer zaman açıkça farklı ışık süresi kısaltılmış göründü DNA kültürlü1puan. Bu işlem tarafından Kai proteinler2dayalı bir sirkadiyen saat denetlenir sürülmüştür. Seki ve ark. Höchst 33342 ile lekeli DNA ışık döneminin sonuna doğru S. elongatus hücrelerdeki sıkıştırılmış ve floresan mikroskop altında dalgalı bir çubuk şekli gösterdi bildirdin. Sıkıştırılmış DNA sonra çubuk ortasındaki ikiye bölünmüş ve nihayet her kızı hücre3normal tekdüze dağılım için döndürülen hücre olarak ayrılmış. Ancak, onun geçici doğası ve büyüklüğü elektron mikroskopi için yapısal analizi engellemiştir. Murata vd. kombine zaman uyumlu kültür, floresans mikroskobu, Hızlı dondurma ve yüksek de dahil olmak üzere çeşitli yöntemler gerilim elektron cryo-tomografi (cryo-HVET) ve geçici DNA sıkıştırma, yapısını belirlenmesinde başarılı oldu polifosfat organları (PPBs)4kinetik dahil olmak üzere. El yazması deneysel prosedürler birleştirerek görsel zor bir malzeme ayrıntılı açıklamasını sağlar.
S. elongatus kapsül bir şekli vardır, canlı hücreler çok kısa bir süre için sadece 2-5 µm, 0.5 µm hakkında bir genişliği ve mükemmel DNA sıkıştırma uzunluğu görünür. Bu nedenle, siyanobakteriyel DNA sıkıştırma içinde meydana gelen yapısal değişiklikler ayrıntılı olarak bilinmiyordu. Bu yapıların elektron mikroskobu tarafından araştırmak için iki ana teknik sorunların üstesinden gelmek gereklidir. Bir yerel koşullar yakınındaki bakteri bütün kalın bir örnek gözlem ve diğer dinamik bir yapısı hızlı fiksasyonu. İlk sorun gelince, esnek olmayan ortalama özgür keçiyolu (iMFP) elektron elektron mikroskobu5hızlanan voltajı bağlıdır. 300 transmisyon elektron mikroskobu (TEM) içinde kV, sanki daha az 350 nm. Örneğin, bir buz gömülü cyanobacterium zaman (numune kalınlığı ≈ 600 nm) 200kV TEM görülmektedir (iMFP ≈ 250 nm), hücre içindeki yapıları gözlemlemek zordur. Buna karşılık, 1 MV TEM (iMFP ≈ 500 nm) vermek ve görüntü hücre (Şekil 1) boyunca sitoplazmik yapısının. Bu iletişim kuralı ' belgili tanımlık eriyik, 1 hızlanan bir gerilim, bir yüksek gerilim elektron mikroskobu (HVEM) bir parçası olarak MV istihdam. Ancak, HVEM uygulamak İmkanlar dünya çapında sınırlıdır. Olası alternatif çözümler de tartışma bölümde ele alınmıştır. İkinci sorun cryo-elektron mikroskobu (cryo-EM) tarafından çözüldü. Bu dinamik yapılar yerel koşullar, nerede örnek sıvı etan hızlı dondurucu cihaz kullanarak hızla dondurulur ve donmuş an doğrudan değişiklikler6minimum görülmektedir yakınındaki görüntülenmesi için güçlü bir araçtır. Tomografi ile birleştirerek, üç boyutlu (3D) yapıları bir anlık görüntü tilt serisi7' den yeniden olabilir. Bu deneyde, DNA sıkıştırma zaman uyumlu kültür altında 12 h her açık/koyu döngüsü kullanarak elongatus S. yeniden oluşturulmalı ve numune dondurulması zamanlaması floresan mikroskop altında izleyerek tespit edildi.
Burada açıklanan yaklaşım yaygın olarak bakteri hücreleri, Örneğin hücre bölünmesi, kromozom segregasyon ve faj enfeksiyon dinamik yapıları incelenmesi için geçerlidir ve mikrobiyolojik araştırmada yeni yollar açmak için bir potansiyele sahiptir.

<table><tbody><tr><td>Hoechst 33342 çözeltisi</td><td>Dojindo</td><td>346-07951</td><td>H 2O Agar Tozu içinde 1mg / mL</td></tr><tr><td>(bitki kültürü için)</td> <td>Wako</td><td>016-11875</td><td></td></tr><tr><td>Borik asit</td><td>Wako</td><td>027-02192</td><td>% 99,5</td></tr> <tr><td>Manganez klorür tetrahidrat</td><td>Wako</td><td>139-00722</td><td>% 99</td></tr> <tr><td>Çinko sülfat heptahidrat</td><td>Wako</td><td>264-00405</td><td>% 99,5</td></tr> <tr><td>Sodyum molibdat</td><td>Wako</td><td>196-02472</td><td>% 99</td></tr> <tr><td>Bakır sülfat pentahidrat</td><td>Wako</td><td>039-04412</td>% <td>99,5</td></tr> <tr><td>Kobalt nitrat hekzahidrat</td><td>Wako</td><td>031-03752</td><td>% 99,5</td></tr> <tr><td>Sodyum nitrat</td><td>Wako</td><td>191-02542</td><td>% 99</td></tr> <tr><td>Magnezyum sülfat heptahidrat</td><td>Wako</td><td>131-00405</td>% <td>99,5</td></tr> <tr><td>Kalsiyum klorür dehidrat</td><td>Wako</td><td>031-00435</td><td>%99,5</td></tr> <tr><td>Sitrik asit</td><td>Wako</td><td>036-05522</td><td>%98</td></tr> <tr><td>EDTA-2Na</td><td>Dojindo</td><td>343-01861</td><td>%99,5</td></tr> <tr><td>Sodyum karbonat</td><td>Wako</td><td>197-01581</td><td>%99,8</td></tr> <tr><td>Potasyum fosfat dibazik</td><td>Wako</td><td>164-04295</td><td>%99</td></tr> <tr><td>TES (İyi ' s tamponu)</td> <td>Dojindo</td><td>344-02653</td><td>% 99</td></tr> <tr><td>Ferrik amonyum sitrat</td><td>Wako</td><td>092-00802</td><td>1. Sınıf</td></tr><tr><td>Sodyum tiyosülfat pentahidrat</td><td>Wako</td><td>197-03585</td><td>% 99</td></tr> <tr><td>BSA altın izleyici 15nm</td><td>Aurion</td><td>215.133</td><td></td></tr><tr><td>Quantifoil EM ızgara</td><td>Quantifoil MicroTools</td><td>R3.5 / 1 Bakır ızgara</td><td></td></tr><tr><td>Elektron filmleri</td><td>Kodak</td><td>SO-163</td><td></td></tr><tr><td>Geliştirici</td><td>Kodak</td><td>D19</td><td></td></tr><tr><td>Düzeltici</td><td>Kodak</td><td>Hızlı düzeltici</td><td>Çözüm</td></tr><tr><td>Filtre kağıdı</td><td>Whatman</td><td>Sınıf 1</td><td></td></tr><tr><td>Büyüme odası</td><td>NKsystem</td><td>LH-100SP</td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskop</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE 50i</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek gerilim TEM</td><td>HItachi</td><td>H1250M</td><td></td></tr><tr>HVEM <td>Gatan</td><td></td><td></td>daldırmalı dondurma cihazı <td>için kriyo numune tutucu</td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>EM CPC</td><td></td></tr><tr><td>Plazma İyon bombardıman uçağı</td><td>Vakum cihazı</td><td>PIB-10</td><td></td></tr><tr><td>Sıvı nitrojen depolama</td><td>Taylor-Wharton</td><td>25LDB</td><td></td></tr><tr><td>Geliştirme tankı</td><td>Dosaka EM</td><td>TB-3-75</td><td></td></tr><tr><td>düz yataklı tarayıcı</td><td>Nikon</td><td>Coolscan 9000ED</td><td></td></tr><tr><td>Segmentasyon yazılımı</td><td>FEI</td><td>Amira</td><td>https://www.fei.com/software/amira</td></tr><tr><td>Tomografik Rekonstrüksiyon yazılımı</td><td>eTOMO</td><td></td><td>http://bio3d.colorado.edu/imod</td></tr></tbody></table>

siyanobakteriler yüksek gerilim cryo-elektron tomografi tarafından dna sıkıştırma görselleştirme

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Bu iletişim kuralı, siyanobakteriler geçici DNA sıkıştırma görselleştirmek açıklar. DNA sıkıştırma son zamanlarda bazı Siyanobakteriler hücre bölünmesi önce gerçekleşmesi için bulundu dramatik sitoplazmik olaydır. Ancak, büyük hücre boyutu ve geçici karakteri nedeniyle yapısı ayrıntılı araştırmak zordur. Zorlukları aşmak için ilk olarak, DNA sıkıştırma tekrarlanarak cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 12 h her ışık/karanlık döngüsü kullanılarak zaman uyumlu kültür tarafından üretilmektedir. İkinci olarak, DNA sıkıştırma floresans mikroskobu tarafından izlenen ve hızlı donma tarafından ele geçirdi. Üçüncü olarak, hücre DNA'ın ayrıntılı yapısı sıkıştırılmış yüksek gerilim cryo-elektron tomografi tarafından üç boyutlu (3D) olarak görüntülenir. Bu yöntemler bakteri, Örneğin hücre bölünmesi, kromozom segregasyon, fajının enfeksiyon vbgeçici yapılarını araştırmak için yaygın olarak uygulanabilir ayarlanır., hangi floresans mikroskobu tarafından izlenen ve doğrudan tarafından görüntülenmiştir Cryo-elektron tomografi uygun zaman noktalarda.

Küçük 12 h her açık/koyu döngüsü bir kesin zaman uyumlu kültürde Höchst ile etiketli DNA karanlık durumda (Şekil 2a) normal tekdüze dağılım gösterir. Ancak, bu kademeli hücre içinde ışık döneminde düzenler ve ışık dönemin sonunda bir dalgalı çubuk benzeri yapı (Şekil 2b) olarak görünür. Son olarak, Merkezi ( Şekil 2c oklar) çubuk böler ve onun iki bölümden kızı hücreleri (Şekil 2B) dağıtılır. Hücre bölünmesi sonra sıkıştırılmış DNA hemen kaybolur ve DNA için normal bir üniforma dağılımı verir.
Ne zaman bir aliquot hücreleri DNA sıkıştırma son aşamasında içeren hücre hemen transfer delikli bir ızgara üzerine ve hızlı donmuş sıvı etan ve donmuş kılavuz 1 MV cryo-HVEM, siyanobakteriler dahil olmak üzere iç yapıları tarafından gözlenmiştir DNA, thylakoid membran katmanları, hücre duvarları ve PPBs, olduğu gibi bir anlık görüntü (Şekil 3a) dondurma anda ortaya çıktı. Birçok hücreler hücreleri ( Şekil 3a' beyaz ok) farklı DNA sıkıştırma gösterdi ve normal hücreleri ( Şekil 3biçinde beyaz ok uçları) kolayca ayırt edici olabilir. Bazı hücrelerin ortasındaki bir daralma önce hücre bölünmesi ( Şekil 3a' sarı ok) beklendiği gibi sergiledi.
3D tomograms içinde büyük organellerin hücre bölümlenmiş; hücre duvarı, thylakoid membran katmanları, DNA ve PPBs olabilir (Şekil 4) ayırt. Özellikle, sıkıştırılmış DNA nerede DNA düşük yoğunluklu malzeme ile çevrili ve thylakoid membran katmanlar düzenlenen DNA'ın çubuk dalgalı bozuk sitoplazma içinde ayrı bir boşluk ayrılmış. PPBs dinamik davranışı yeni gözlenen: DNA'sı hücreleri, sıkıştırılmış ise büyük birçok küçük PPBs DNA için uygun görüldü ve normal hücrelere daha az. Buna ek olarak, çoğu PPBs çiftleri olarak ortaya çıktı ve bazı DNA PPBs ayrılması bir süreçte olduğu ortaya çıktı. Bu PPBs kendilerini iki DNA ikilenmesi ve işlevi tarafından fosfat DNA sentezi için tedarikçileri olarak ayrılır olduğunu ileri sürdü.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57197/57197fig1.jpg"> Şekil 1. Cryo-EM görüntülerini normal Siyanobakteriler, S. elongatus PCC 7942 farklı hızlanan gerilimleri, buz gömülü. a) 200kV ve b) 1000kV. Ölçek çubuğu = 500 nm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57197/57197fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57197/57197fig2.jpg"> Resim 2: Floresan mikroskopi cyanobacterium S. elongatus hücre. Her açık/koyu altında 12 saat döngüleri zaman uyumlu kültür sonra hücreleri Höchst 33342 ile lekeli. (a) hücreleri koyu devlet başlangıcı 2 h sonra tek tip DNA etiketleme gösterir. Birçok hücrelerdeki DNA yavaş yavaş ışık döneminde yoğunlaşmak. Sonuçta bir kalın dalgalı çubuk (b) DNA sıkıştırmak tipik kurdu. Bu aşamadan sonra hızlı bir şekilde kendi merkezlerinde (ok uçları) bölünmüş hücre bölünmesi (c) ve iki parça sırasında sıkıştırılmış DNA yapıları ayrılmış kızı hücreleri (d). Kızı hücreleri tek tip DNA karanlık dönemde tekrar etiketleme için döndürdü. Ölçek çubuğu 2 µm. = <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57197/57197fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57197/57197fig3.jpg"> Şekil 3: Siyanobakteriler görüntüsünü Cryo-HVEM gömülü amorf buz (a) bir raw resim 0 ° tilt olarak gösterir. Görüntüleri ışık dönemin sonunda alındı. Bazı hücreleri dalgalı çubuk şekilli DNA organları benzer ökaryotik yoğun kromozomlar (beyaz ok) gösterir. Normal hücrelerde, siyanobakteriler discernable DNA yapısı içinde sitoplazma (beyaz ok uçları) sergi. Bazı hücrelerin hücre bölünmesi (sarı ok) önce beklendiği gibi merkezi bir daralma sergi. (b) xy, xz, yz-3D tomogram dilim. Sarı noktalı çizgiler kavşak dilimleri göster. Ölçek çubuğu 2 µm. = <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57197/57197fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57197/57197fig4.jpg"> Şekil 4: Ultrastructure hücre içeren sıkıştırılmış DNA'sı. Ana bileşenleri parçalara: hücre duvarı (parlak sarı), thylakoid membranlar (kırmızı) ve DNA (mavi). (a) 3D tomogram dilim z gösterir. (b) tüm kesimleri. Hücre ayrılık gösteren daralma hücre (ok) ortasında görünür. PPBs sarı veya turuncu küreler modellenmiştir; turuncu her alanda en yakın sarı küre muadili temsil eder. Ölçek çubuğu = 500 nm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57197/57197fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Bu iletişim kuralı, siyanobakteriler geçici DNA sıkıştırma görselleştirmek açıklar. Zaman uyumlu ekimi, floresans mikroskobu, Hızlı dondurma ve yüksek tarafından izleme gerilim cryo-elektron tomografi kullanılır. Bu metodolojileri için bir protokol sundu ve gelecekteki uygulamalar ve gelişmeler ele alınmıştır.

Siyanobakteriler yüksek gerilim Cryo-elektron tomografi tarafından DNA sıkıştırma görselleştirme

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Bu yöntem, bakterilerin hücre döngüsü sırasında DNA yapısının nasıl değiştiği gibi mikrobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en önemli avantajı, herhangi bir ek işlem gerektirmeden uygun zaman noktalarında canlı duruma yakın tüm bakteri hücrelerinin üst yapısının görüntülenebilmesidir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir doktora sonrası olan Chihong Song ve Dr.Kaneko'nun laboratuvarından bir yüksek lisans öğrencisi olan Mako Hayashi olacak.% 1.5 agar ve% 0.3 sodyum tiyosülfat içeren dokuz santimetrelik, sterilize edilmiş BG-11 plakalarında büyüyen siyanobakterilerle başlayın. Plakaları, saniyede metrekare başına 50 mikro-E ışıkla 12-12 ışık döngüsü altında 23 santigrat derecede inkübe edin. Hücreleri korumak için, bunları haftada bir taze BG-11 agar plakalarına aktarın.Bir hafta içinde kültürler yeşil bantlar olarak ortaya çıkar. Yeşil hücre kümelerini alevle sterilize edilmiş bir halka kullanarak aktarın ve bunları yeni plakaya çizin. DNA sıkışmasını gözlemlemek için, ışık periyodunun sonunda altı gün boyunca kültürlenen hücreleri toplayın.Hücreleri plakadan serbest bırakmak için, bir mililitre 0.2 molar sükroz ekleyin. Ardından, hücre süspansiyonunu toplayın ve çözelti yeşile dönene kadar sakaroz ilavesini ve çıkarmasını tekrarlayın. Renk değişimi, çoğu hücrenin serbest bırakıldığını gösterir.Şimdi, 500 mikrolitre askıda hücre çözeltisini bir Mikrofüj tüpüne aktarın ve mililitre başına bir mikrogramlık nihai konsantrasyon için Hoechst boyası ekleyin. Ardından, hücrelerin karanlıkta 10 dakika kuluçkaya yatmasına izin verin. Daha sonra, hücreleri döndürün, süpernatanı atın ve 10 mikrolitre 0.2 molar sükroz içinde yeniden süspanse edin.Daha sonra, süspansiyonun bir mikrolitresini bir cam slayta aktarın, bir kapak fişi koyun ve hücreleri bir UV filtresi ile donatılmış bir floresan mikroskobu altında gözlemleyin. 100 kez yağa daldırma hedefi kullanarak, hücrelerin çoğunda gözlemlenebilir olması gereken DNA sıkışmasının kanıtlarını arayın. İlk olarak, daldırmalı dondurma cihazını hazırlayın.Ardından, etan kabını ve soğutma çubuğu ekini yerleştirerek sıvı nitrojen kabını kurun. Ardından, kabı sıvı nitrojenle doldurun ve sıvı nitrojen sıcaklığına soğutun. Bundan sonra, kabın içine etan gazı yükleyin.Sıvı etan patlayıcı olduğu için koruyucu gözlük taktığınızdan emin olun. Son olarak, soğutma çubuğu ekini çıkarın ve donmayı önlemek için kabı plastik bir kapakla örtün. Devam etmek için, bir plazma iyon bariyeri kullanarak karbon kaplı bir EM ızgarasının karbon tarafını 30 miliamperde 50 saniye boyunca kızdırma deşarjı yapın.Ardından Vitrobot'u test protokolüne göre hazırlayın. Ön işlem görmüş EM ızgarasını hazneye ayarlamak için cımbız kullanın. Numuneyi uygulamadan önce referans olarak hizmet etmesi için EM ızgarasına bir mikrolitre, 15 nanometre BSA altın izleyici uygulayın.Şimdi, ızgaraya 2.5 mikrolitre hücre süspansiyonu alikot. Fazla çözeltiyi filtre kağıdı kullanarak kurulayın ve ızgarayı hemen sıvı etan içinde dondurun. Donmuş ızgarayı, incelenene kadar sıvı nitrojen içinde saklayın.Ardından, HVEM'i başlatın ve bir megavoltluk yüksek bir voltaja ayarlayın. Ardından, numune ızgara tutucusunu sıvı nitrojen kullanarak eksi 150 santigrat dereceye kadar soğutun. Soğuduktan sonra, donmuş ızgarayı soğutulmuş kriyo-numune tutucusuna monte edin ve HVEM'e yükleyin.Kurulumu buzla kirletmemeye dikkat edin. Şimdi, 1.000 kat düşük büyütme oranında bir görüntüleme alanı seçin. Ardından, ösentrik z ekseni yüksekliğini ayarlayın ve numune aşamasını eksi 60 dereceye eğin.Ardından, eğme dönüşünün boşluğunu çıkarın. Şimdi, 10.000 kat büyütme ile hedef konumun yakınına odaklanın. Odaklanılan görüntüden sapma ile altı ila 10 mikron arasında bir alt odak ayarlayın.Görüntüleme için, dozu saniyede angstrom kare başına iki elektron veya daha azına ayarlayın. Akım yoğunluğu tarafından yansıtılan elektron dozuna dikkat edin ve dijital kamera veya bir elektron filmi üzerinde bir görüntü alın. Ardından, iki ila dört derecelik artışlarla eksi 60 ila pozitif 60 derece arasında eğim görüntüleri toplayın.Mümkünse mikroskobun otomatik özelliklerini kullanın. Ticari yazılım paketini açın ve tomografik rekonstrüksiyon için eğim görüntülerini yükleyin. Ardından, tif2mrc veya newstack komutunu kullanarak tek tek görüntülerden bir görüntü yığını dosyası oluşturun.Ardından, eTomo GUI yazılımını başlatın ve piksel boyutu, referans çapı, görüntü döndürme vb. için görüntü parametrelerini girin. Böylece, düzenleme komut dosyasını oluşturun. Şimdi, 0,5'ten daha az ortalama kalıntı hatasıyla referans işaretleyiciler kullanılarak hizalanmış bir eğim serisi oluşturmak için önerilen yazılımı kullanın.Son olarak, SIRT algoritmasını kullanarak bir 3B tomogramı yeniden oluşturun. Şimdi, tomogramdan ilgilendiğiniz bir bölgeyi çıkarın ve anizotropik difüzyon filtresi, iki taraflı filtre veya matematiksel morfoloji filtresi gibi bir gürültü giderme filtresi uygulayın. Görüntü kontrastını artıran parametreleri kullanarak filtrelemeyi gerçekleştirin.Ardından, ilgilendiğiniz bir özelliği segmentlere ayırın. Tomogramı açmak için dilimleme özelliğini kullanın. Ardından, Segmentasyon Düzenleyicisi penceresine gidin ve bir segmentasyon dosyası oluşturmak için yeni bir etiket alanı seçin.Ardından, ilgilenilen özelliğin kenarlığını ilk dilimde ve ardından diğer dilimlerin her birinde el ile izleyin. Aynı işlemler kullanılarak ek ilgi çekici özellik eklenebilir. Şimdi, segmentli birimi görselleştirmek için SurfaceGen menüsündeki seçenekleri kullanarak bir yüzey işleme oluşturmak için SurfaceView menüsünü seçin.3B cildi taşımak, döndürmek ve yakınlaştırmak için 3B Görüntüleyici penceresindeki araçları kullanın. Sihirli Değnek Aracı kullanılarak otomatik segmentasyon yapılabilir. Bir nesneye tıklayın ve Görüntüleme ve Maskeleme'deki kaydırıcıları, nesnenin özellikleri tamamen seçili olacak şekilde ayarlayın.Kesin bir senkron kültürde, Hoechst ile etiketlenmiş DNA, karanlık durumda normal bir homojen dağılım gösterir ve daha sonra ışık periyodu boyunca hücre içinde aşamalı olarak sıkışır ve ışık periyodunun sonunda dalgalı çubuk benzeri bir yapı alır. Son olarak, çubuk merkezde bölünür ve iki parçası yavru hücrelere dağıtılır. Hücre bölünmesinden sonra, sıkıştırılmış DNA hemen kaybolur ve DNA normal bir homojen dağılıma geri döner.DNA sıkıştırmasının son aşamasındaki hücreler dondurulduğunda ve yüksek voltajlı elektron mikroskobu kullanılarak gözlemlendiğinde, birçoğu normal hücrelerden kolayca ayırt edilebilen farklı DNA sıkışması gösterdi. Bazıları, hücre bölünmesinden önce beklendiği gibi hücrelerin merkezinde bir daralma sergiledi. 3D tomogramlardan, kompakt DNA sitoplazmada gözle görülür şekilde ayrılır ve düşük yoğunluklu bir malzeme ile çevrilidir.Tilakoid zar katmanları, sıkıştırılmış DNA'nın dalgalı çubuğu boyunca bozulur. İlginç bir şekilde, birçok küçük fosfat cismi sıkıştırılmış DNA'ya yapışır ve genellikle çiftler halinde görünür. Bu polifosfat cisimleri, DNA sentezi için fosfat tedarikçileri olabilir.Bu videoyu izledikten sonra, kriyo-yüksek voltajlı elektron mikroskobu ile kriyo-yüksek voltajlı elektron mikroskobu ile canlı duruma yakın tüm bakteri hücrelerinin üst yapısını, boyama gibi ek bir işlem yapmadan nasıl görüntüleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü denerken, DNA sıkıştırma durumunun ışık döngüsünün sonunda her dakika değiştiğini hatırlamak önemlidir. Numuneyi dondurmak için en iyi zamanlamayı kaçırmadığınızdan emin olun.Bu prosedürü takiben, sıkıştırılmış DNA'daki spesifik proteinlerin veya nükleotidlerin lokalizasyonu hakkında ek soruları yanıtlamak için CLEM gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, mikrobiyoloji alanındaki araştırmacıların bakterilerde veya küçük ökaryotlarda hücre bölünmesi, DNA ayrışması ve viral enfeksiyonu keşfetmelerinin önünü açmalıdır.

visualization-dna-compaction-cyanobacteria-high-voltage-cryo-electron

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Yerli yakın eyalette bakteri hücrelerinin ultrastrüktür çalışma elektron cryotomography (EKT) nasıl kullanılacağı "makromoleküler" (~ 4 nm) çözünürlük, burada göstermektedir.

Bakteriyel Hücre Elektron Cryotomography

Kaynak: Biller, S. J., et al. Siyanobakteriyel hücre dışı veziküllerin izolasyonu ve karakterizasyonu. J. Vis. Uzm. (2022)Bu video, yapısal ve karşılaştırmalı analizler için vezikül morfolojisinin, boyutunun ve saflığının yüksek çözünürlüklü görselleştirilmesini sağlayan, negatif boyama ile transmisyon elektron mikroskobu için siyanobakteriyel hücre dışı veziküllerin hazırlanmasını göstermektedir.

Transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak siyanobakteriyel hücre dışı veziküllerin görselleştirilmesi

Kaynak: Murata, K. ve diğerleri, Siyanobakterilerde DNA Sıkışmasının Yüksek Voltajlı Kriyo-elektron Tomografisi ile Görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2018)Bu video, sirkadiyen tarafından düzenlenen DNA sıkışmasını incelemek için aydınlık-karanlık döngüler altında siyanobakterilerin eşzamanlı olarak yetiştirilmesini göstermektedir. Floresan mikroskobu, tanımlanmış zaman noktalarında yoğunlaştırılmış DNA'yı ortaya çıkararak popülasyon genelinde hücre döngüsü hizalamasını doğrular.

Siyanobakteriyel Kültür Senkronizasyonu ve Aydınlık-Karanlık Döngüleri Tarafından Yönlendirilen DNA Sıkıştırma

Biz toplamak ve tüm mitokondri süreç elektron cryo-tomografi nasıl bir protokol mevcut. Teknik, doğal biyolojik membranların büyük membran protein komplekslerinin yapısı, işlevi, ve organizasyon hakkında detaylı bilgiler sağlar.

Elektron Cryo-tomografi ile Mitokondri ATP Sintazı dimerlerini Görselleştirme

Biz, moleküler makinelerin yerinde yapılarında yüksek çözünürlük belirlemek için yüksek verimli cryo-elektron tomografisi yararlanmak için nasıl bir protokol mevcut. Protokol ortak darboğazları önler, büyük miktarda veri işlenecek izin verir ve kullanıcı önemli biyolojik sorulara odaklanmak için izin, kaynak çalışmama süresini azaltır.

Tomoauto kullanma: Bir Protokol Yüksek verim Otomatik Cryo-elektron Tomografi için

Bakteri hücrelerinin görüntülenmesi, büyük makromoleküler makinelerin işlevini belirleyen statik ve dinamik süreçleri tanımlamaya odaklanmış yeni ortaya çıkan bir sistem biyolojisi yaklaşımıdır. Burada Lejyonella pnömophila tip IV salgı sistemi mimarisi ve fonksiyonlarını incelemek için kantitatif canlı hücre görüntüleme ve kriyo-elektron tomografisi entegrasyonu kullanılmaktadır.

Legionella pnömophila Dot/Icm Salgı Sisteminin Spatiotemporal Özelliklerini Çözmek İçin Canlı Hücre Görüntüleme ve Kriyo-Elektron Tomografisi Uygulama

Burada, kriyo yumuşak X-ışını tomografisinde (SXT) kriyo-korunmuş hücrelerin ultrayapısını 25 nm yarım perde çözünürlükte görüntülemek için gerekli numune hazırlama ve veri toplama adımlarını açıklayan bir protokol sunulmaktadır.

Cryo Soft X-ray Tomografisi ile Hücrenin 3D Kartografik Açıklaması

Kriyo-elektron tomografisi ile in situ makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmaları için kriyo odaklı iyon ışını mikromakine ile dalma donmuş biyolojik örneklerin lamel hazırlanması için bir protokol sunuyoruz. Sunulan protokol, Saccharomyces cerevisiaeiçindeki makromoleküllerin yapısal karakterizasyonu için yüksek tekrarlanabilirlik ile yüksek kaliteli lamel hazırlanması için yönergeler sağlar.

Kriyo-Elektron Tomografisi için Saccharomyces cerevisiae'nin Hazırlanması ve Kriyo-FIB mikromakinesi

Mevcut protokol, Tomo5 kullanılarak yüksek çözünürlüklü kriyo-elektron tomografisi uzaktan veri toplama ve emClarity kullanılarak sonraki veri işleme ve subtomogram ortalamasını açıklamaktadır. Apoferritin, 2.86 şçözünürlükte bir kriyo-ET yapısı elde etmek için ayrıntılı adım adım süreçleri göstermek için bir örnek olarak kullanılır.

Kriyo-elektron Tomografisi Uzaktan Veri Toplama ve Subtomogram Ortalaması

Kriyo-STEM tomografisi, bozulmamış hücrelerin organellerini gömme, kesitleme veya diğer invaziv preparatlar olmadan görselleştirmek için bir araç sağlar. Elde edilen 3D çözünürlük şu anda birkaç nanometre aralığında, birkaç mikrometrelik bir görüş alanı ve 1 μm mertebesinde erişilebilir bir kalınlık ile.

Kriyo-STEM Tomografi ile Organellerin In Situ Görüntülenmesi

Öğrenin, siyanobakterilerde DNA sıkışmasını yüksek gerilim kriyojenik elektron tomografi ile görselleştirme yöntemini. Bu teknik, bakteri hücre döngüsü dinamiklerini canlı duruma yakın çözünürlükte incelemeyi sağlar.

Siyanobakteriler yüksek gerilim Cryo-elektron tomografi tarafından DNA sıkıştırma görselleştirme

Daha fazla video keşfet