Negatif varyasyonlarında leke elektron mikroskobu yöntemleri: sistemleri zorlu mücadele için Araçlar

Bu videonun genel amacı, negatif leke iletimli elektron mikroskobu numunelerinin hazırlanması için tekniklerin birkaç farklı varyasyonunu göstermektir. Negatif leke, bir EM numunesinin kalitesini hızlı bir şekilde değerlendirmenin en iyi yoludur. Bazı numuneler için farklı ızgara hazırlama tekniklerinin daha iyi çalıştığını bilmek önemlidir.

Herhangi bir numune için en iyi sonucu veren teknik, deneme yanılma yoluyla belirlenmelidir. Başlamak için, karbon levha yöntemini kullanarak EM ızgaralarını hazırlayın ve ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi negatif boyama reaktiflerini hazırlayın. Bir mikroskop lamı üzerine yukarı bakacak şekilde karbon levha kaplı bir EM ızgarası yerleştirin.

Sürgüyü bir kızdırma deşarj ünitesine ayarlayın ve ızgarayı hidrofilik hale getirmek için ızgarayı 10 miliamperde en az 30 saniye boyunca işlemden geçirin. Bittiğinde, numuneyi boşaltma ünitesinden çıkarın. Ardından, ızgaranın kenarını kavramak için bir çift negatif basınçlı cımbız kullanın.

Yan leke yöntemini kullanarak lekelemek için, önce destek yüzeyine üç ila beş mikrolitre numune uygulayın. Numunenin ızgara yüzeyine 10 saniye ila bir dakika arasında adsorbe olmasına izin verin, ardından ızgaranın kenarını bir filtre kağıdına dokundurun ve kılcal hareketin sıvıyı çekmesine izin verin. Daha sonra, bir laboratuvar filmi tabakasına 50 mikrolitre damla ultra saf su veya uygun bir uçucu tampon çözeltisi yerleştirin.

Izgaranın karbon yüzeyine yavaşça dokunun ve ızgaranın yüzeyine küçük bir damlacık kaldırın. Ardından, ızgaranın kenarını bir filtre kağıdına dokundurun ve kılcal hareketin sıvıyı çekmesine izin verin. Ardından, bir laboratuvar filmi tabakasına iki adet 50 mikrolitrelik boyama reaktifi damlatın.

Izgaranın karbon yüzeyine yavaşça dokunun ve ızgaranın üst yüzeyine küçük bir damlacık kaldırın. Leke ızgaranın arkasına geçerse, karbon film kırılmıştır ve atılması gerekir. 10 ila 15 saniye sonra, ızgaranın kenarını bir filtre kağıdına dokundurun ve kılcal hareketin sıvıyı çekmesine izin verin.

Bu boyama adımını bir kez daha tekrarlayın ve ardından ızgaranın kurumasını bekleyin. Numuneyi fiske atma yöntemini kullanarak lekelemek için, ızgaranın kenarını bir çift negatif basınçlı cımbızla kavrayın ve destek yüzeyine üç ila beş mikrolitre numune uygulayın. Cımbızı bir elinizle tutarak, ızgarayı yaklaşık 45 derece uzağa bakacak şekilde eğin ve ızgaranın üstündeki damlacığın çoğunu çıkarmak için bileği hızla hareket ettirin.

Ardından, destek yüzeyine bir damla yıkama solüsyonu uygulamak için bir cam Pasteur pipeti kullanın. Damlayı hafifçe vurun ve numuneyi yıkamak için birkaç kez tekrarlayın. Ardından, destek yüzeyine bir damla boyama reaktifi uygulayın ve damlacığı tekrar hafifçe vurun.

Numunenin görselleştirilmesi için gereken leke derinliğine bağlı olarak bu boyama adımını bir ila üç kez tekrarlayın. Bir parça filtre kağıdının yırtık kenarını ızgaranın kenarına dokundurarak fazla lekeyi çıkarın ve ardından ızgaranın kurumasını bekleyin. Numuneyi hızlı yıkama yöntemini kullanarak lekelemek için önce 200 mikrolitrelik bir pipetin ucuna 30 ila 70 mikrolitre leke çizin.

Beş mikrolitre hava çekmek için ses seviyesini çevirin, ardından beş ila 30 mikrolitre yıkama reaktifi çekin, ardından beş mikrolitre daha numuneden önce başka bir küçük hava boşluğu girin. Bir ızgaranın kenarını bir çift negatif basınçlı cımbızla kavrayın ve ızgarayı yaklaşık 45 derece uzağa bakacak şekilde açın. Tek bir hızlı hareketle, pipet ucunun tüm içeriğini karbon kaplı EM ızgarasının yüzü boyunca çıkarın.

Bir parça filtre kağıdının yırtık kenarını ızgaranın kenarına dokundurarak fazla lekeyi çıkarın ve ızgaranın kurumasını bekleyin. Negatif bir leke için ideal seçim, yüksek oranda örneğe bağlıdır. En sık kullanılan leke uranil asetattır ancak lantanit lekeleri de kullanılabilir.

Derine gömülü numuneler için, lantanit bazlı boyalar, tulyum asetat ve erbiyum asetat, lekeli parçacıkların görünür kontrastı ve keskinliği ile değerlendirildiği gibi, uranil asetata eşdeğer kalitede negatif boyama üretti ve thulium asetat, erbiyum asetattan daha net ve daha net görüntüler üretti. Thulium asetatın büyük tane boyutu, burada bir tütün mozaik lifli parçacık numunesi %1 thulium asetat ile boyandığında gösterilen yüksek büyütmede belirginleşir. Thulium asetat kullanılarak, tütün mozaik lifli partikülünün 23 angstrom tekrarı gözle açıkça görülebilir.

Test edilen diğer lantanit lekelerinin hiçbiri bu özelliği çözemedi. Görüntülenmesi zor bir başka örnek, kas türevli C proteinidir. Bu numune, boyama yöntemine bağlı olarak önemli ölçüde farklı görüntüler üretir.

Yandan leke yöntemi ile boyandığında, küresel, çökmüş kanat benzeri bir yapı olarak görünür. Izgaralar fiske yöntemiyle hazırlandığında, C proteini bir ip üzerindeki boncuklara benzeyen bir dizi alan olarak gözlemlenir. Bu, gerçek C protein yapısını daha iyi temsil eder.

Bir kez ustalaştıktan sonra, negatif lekeli bir numune hazırlamak yalnızca bir dakika sürer. Her numunenin her boyama tekniğine farklı yanıt verdiğini hatırlamak önemlidir. Yeni numuneler için en iyi yaklaşım deneysel olarak belirlenmelidir.

Uranil boyama reaktiflerinin toksik ve hafif radyoaktif olduğunu unutmayın. Uygun bir atık akışına atıldıklarından emin olun.