Optimize Negatif Boyama: Elektron Mikroskobu ile Küçük ve Asimetrik Protein Yapısı incelenmesi için Yüksek verim Protokolü

Daha fazla protein yarısından elektron mikroskobu görüntüleme ve üç boyutlu rekonstrüksiyon hem de zor küçük proteinler (moleküler kütle <200 kDa) 'dir. Optimize negatif boyama, yüksek kontrast ve nispeten yüksek çözünürlük (~ 1 nm) farklı fizyolojik koşullar altında, küçük, asimetrik proteinlerin ya da komplekslerin görüntüleri elde etmek için güçlü ve yüksek verimli bir protokoldür.

Bu prosedürün genel amacı, negatif boyama elektron mikroskobunun yüksek verimli optimize edilmiş bir protokolünü kullanarak küçük ve asimetrik proteini görüntülemektir. Bu, önce proteinin hazırlanmış bir inkübasyon istasyonunda inkübe edilmesi ve aynı zamanda negatif bir boyama iş istasyonu hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, numuneyi sırayla üç su damlası üzerinde hızlı bir şekilde yıkamaktır.

Üçüncü adım, numuneyi sırayla üç leke damlacığı üzerine dikkatlice lekelemektir. Son adım, EM ızgarasının arka tarafından lekelenerek ve ardından nitrojen gazı altında nazikçe kurutularak fazla çözeltiyi çıkarmaktır. Sonuç olarak, sonuçlar, düşük odak bozukluğu koşulu altında TEM görüntüleme yoluyla küçük proteinlerin yüksek çözünürlüklü görüntülerini gösterebilir.

Bu tekniğin kriyo elektro mikroskobik göre ana avantajı belirlenmiştir. Küçük ve asimetrik protein yapılarının yüksek verimli incelemesine ve yüksek kontrastlı görüntülemesine izin verirken, geleneksel negatif boyamadan kaynaklanan yapı artefaktlarını azaltabilir. Bu yöntem, kolesterol ester transfer proteini gibi küçük protein mekanizmaları için yapısal temel hakkında fikir verebilir.

Ayrıca, boyutları büyük ölçüde değişen IgG bir antikor, yüksek yoğunluklu lipoprotein ve proteazom gibi diğer proteinlere de uygulanabilir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü zamanlamadaki farklılıklar nedeniyle yıkama ve boyama adımlarının öğrenilmesi zordur ve hatta numune lekeleme bitmiş lekelenmiş proteinde dramatik etkilere neden olabilir. Bu protokole hazırlanırken, ışığa maruz kalmasını en aza indirmeye azami dikkat gösterilerek% 1 pisuar form sekiz solüsyonu yapmak gerekir.

Bu, şırınga N 0.2 mikron filtre parçalarının, çözeltiyi ilk filtreleme zamanı geldiğinde folyoya sarılmasını içerir. Filtrelemeden sonra, deney gününde iki mililitre folyoya sarılmış flakon alikotunu eksi 80 santigrat derecede saklayın. Tamamen çözüldükten sonra oda sıcaklığındaki bir su banyosunda bir alikotu çözdürün.

Folyoya sarılmış parçalarla 0,02 mikronluk bir filtreden tekrar süzün. Toplama şişesi de folyoya sarılmalıdır. Negatif lekeyi kullanılana kadar bir buzluğa aktarın.

Bir pipet ucu destekçisine sekiz inç uzunluğunda bir param bastırarak bir damlacık tutma tabakası yapın. Bu, beş milimetre çapında kuyular olarak hizmet veren yol girintileri yapar. Altı sıra kuyu açtıktan sonra, buzu bir strafor tepsinin yüzeyinde düzleştirin, ardından tabakayı buzun üzerine yerleştirin.

Daha sonra, sol taraftaki tabakanın ilk üç kuyusuna 35 mikrolitre DI suyu ekleyin. Daha sonra, hazırlanan negatif leke çözeltisinden 35 mikrolitre ile tabakadaki üç kuyucuğu yükleyin. Çözeltiye ışık maruziyetini en aza indirmek için tepsiyi örtün.

Bu bir boyama istasyonu olarak hizmet edecektir. Şimdi, üzerine cımbızın monte edilebileceği bir ek bulunan boş bir pipet ucu kutusundan bir EM ızgara inkübasyon istasyonu hazırlayın. Kutuyu yarıya kadar buzla doldurun, böylece buz yüzeyi monte edildiklerinde cımbızın ucuna yakın olur.

İlk kızdırma, ince karbon kaplı 300 gözenekli bakır EM ızgaralarını yaklaşık 10 saniye boyunca boşaltın. Ardından, EM ızgara inkübasyon istasyonuna takılan cımbızlı bir ızgara alın. Cımbızları ızgaraya asın, böylece ızgara buzun yarım inç üzerinde 45 derecelik bir eğimde olur.

Şimdi protein örneğini DPBS'de mililitre çözelti başına 50 ila 100 mikrogram protein ile seyreltin. Hemen EM ızgarasına yaklaşık dört mikrolitre seyreltme uygulayın. Numunenin yaklaşık bir dakika inkübe etmesine izin verin.

Bir dakika sonra, fazla çözeltiyi çıkarmak için ağı filtre kağıdıyla hızlıca kurulayın. Ve sonra boyama istasyonunda, para filmindeki ilk su damlasına ağı dokundurun. Filtreyi kurutma ve bir sonraki damlacık ile yeniden doldurma işlemini hızlı bir şekilde tekrarlayın.

Toplam üç su damlası kullanın ve bunu mümkün olduğunca çabuk yapın. Tampon değişiminin protein üzerindeki olumsuz etkisini önlemek için ızgaranın su ile yıkanması hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Son yıkamayı üç saniye içinde temizledikten sonra, ızgarayı ilk negatif boyama çözeltisi damlasında yüzdürmeye başlayın.

10 saniye orada yüzmesine izin verin. Bu arada, uçları filtre kağıdına bastırarak cımbızı temizleyin. On saniyelik şamandıradan birkaç kez sonra, çözeltiyi filtre kağıdı ile kurulayın ve bir sonraki leke damlasında iki saniye boyunca başka bir şamandıra başlatın.

Cımbızı iki saniye boyunca temizleyin. Ardından, ızgarayı kurulayın ve üçüncü damlacığın üzerine koyun. Bu adım sırasında tam bir dakika boyunca boyama istasyonunu örtün.

Lekenin çıkarılması, ızgaranın eşit şekilde kurumasını sağlamak için EM ızgarasının arka tarafına belirli bir süre dokunarak yapılmalıdır. Filtre kağıdı lekeye çok uzun süre temas ederse, çok fazla leke çıkarılabilir ve bu da kötü görüntülemeye neden olabilir. Ardından, ızgarayı kurutmaya devam edin.

İlk olarak, çözelti transfer olana kadar karbon olmayan tarafın tamamını filtre kağıdına dokundurun. İkinci olarak, hafif bir nitrojen gazı akışı uygulayın. Şimdi ızgarayı filtre kağıdı ile kaplı bir tabağa aktarın ve tabağı kısmen örtün.

Izgaranın oda sıcaklığında 30 dakika boyunca tabakta kurumasına izin verin. Alternatif olarak, lipit içeren numuneler bir saat boyunca 40 santigrat derecede pişirilebilir. Tamamen kuruduktan sonra, önce başlamadan önce EM ızgarasını bir EM ızgara saklama kutusuna aktarın, TEM'i hizalayın.

Hedeflenen çözünürlükten daha iyi olması gereken, negatif lekeli ızgaranın bir karbon film alanının güç spektrumu ile en yüksek görünür çözülme halkasının çözünürlüğünü kontrol edin. Ardından, hizalamayı ayarlamak için, numunenin karbon film alanındaki güç spektrumunu dikkatlice kontrol edin. Düzgün hizalanmış bir koşul altında, 20'den fazla T tho halkası görselleştirilebilir, bu da beş angstromdan daha iyi görselleştirmeye karşılık gelir.

Halkalar, 1.6 mikronluk bir odak bozukluğu ve kare başına 20.4 elektronluk bir doz altında amorf bir karbon görüntüsünün kürkçü transferi ile yapıldı. Angstrom. Şimdi, EM ızgarasının incelenmesi sırasında küçük protein görüntülemesi için odağı yaklaşık 0.1 mikrometre olan Scherzer odak durumuna geri getirin. İdeal olarak, lekeli alanlar genellikle düşük büyütmede daha kalın lekeli bulutlu alanların kenarına yakındır.

Lipoprotein örneklerinin yapısı OPNS ile görüntülendi. Örnekler arasında rekombinant HDL, insan plazması, LDL, insan plazması IDL ve insan plazması VLDL bulunur. 53 kilodalton, CETP gibi daha küçük yapılar da görüntülendi.

Bu, eem tarafından başarıyla görüntülenen en küçük proteinlerden biridir. CETP kristal yapısının süper montajı, görüntüyle çok iyi, çok dinamik bir şekilde eşleşir. Heterojen proteinler ayrıca 160 kilodalton immünoglobulin G antikorunda da görüntülendi.

Üç alt alan açıkça görülüyordu. IgG bir antikorun daha yakından incelenmesi, kristal yapısıyla bir karşılaştırma yapmak için kullanıldı. IgG bir antikorun kristal yapısı, bu antikorların EM görünümüyle, alan pozisyonları ve şekilleri gibi birçok yönden eşleşir.

Görüntülenen diğer moleküller arasında 28 kilodalton, lipid içermeyen apo lipoprotein A, bir büyüme, EL ve proteazomlar bulunur. Esasen, OPNS yöntemi, prosedürü denerken küçük asimetrik yapılar ve ilgili mekanik çalışmalar için EM görüntülemenin sınırını önemli ölçüde ilerletir. Bu prosedürü takiben, leke reaktifine ışık maruziyetini mümkün olduğunca azaltmak, numuneyi hızlı bir şekilde yıkamak ve görüntüleme için hazine odağının yakınında kullanmak önemlidir.

Elektron tomografisi gibi diğer yöntemler, tek moleküllerin nanometre çözünürlük yapıları ve aralarındaki doğrulama değişiklikleri gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir. Bu gelişmeden sonra, bu teknik, yapısal biyoloji alanındaki araştırmacıların, insan plazma lipoproteinleri arasındaki bir küme ester transferinin mıknatıslarını keşfetmelerinin yolunu açtı.