Optimize Negatif Boyama: Elektron Mikroskobu ile Küçük ve Asimetrik Protein Yapısı incelenmesi için Yüksek verim Protokolü

Bu prosedürün genel amacı, negatif boyama elektron mikroskopisinin yüksek verimli optimize edilmiş bir protokolünü kullanarak küçük ve asimetrik proteinlerin görüntülenmesidir. Bu işlem, öncelikle bir negatif boyama çalışma istasyonu hazırlanırken proteinin hazırlanmış bir inkübasyon istasyonunda inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, numunenin sırasıyla üç su damlacığı üzerinde hızlıca yıkanmasıdır.

Üçüncü adım, örneği sırasıyla üç boyama damlası üzerinde dikkatlice boyamaktır. Son adım, EM ızgarasının arka tarafından emdirerek fazla çözeltiyi uzaklaştırmak ve ardından nitrojen gazı altında nazikçe kurutmaktır. Sonuç olarak, düşük defocus koşulları altında TEM görüntüleme ile küçük proteinlerin yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde edilebilir.

Bu tekniğin kriyoelektron mikroskopisine göre temel avantajı belirlenmiştir. Bu yöntem, geleneksel negatif boyamanın neden olduğu yapısal artefaktları azaltırken, küçük ve asimetrik protein yapılarının yüksek verimli incelenmesine ve yüksek kontrastlı görüntülenmesine olanak tanır. Bu yöntem, kolesterol ester transfer proteini gibi küçük protein mekanizmalarının yapısal temeline dair içgörü sağlayabilmektedir.

Bu yöntem ayrıca, boyutları geniş bir yelpazede değişen IgG antikoru, yüksek yoğunluklu lipoprotein ve proteazom gibi diğer proteinlere de uygulanabilir. Yıkama ve boyama basamaklarındaki süre farklılıkları nedeniyle bu adımların öğrenilmesi zor olduğundan ve örnek kurutma işleminin bile boyanmış proteinin nihai görünümünde dramatik etkiler yaratabileceğinden, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşır. Prosedürün gösterimi, laboratuvarımdaki Z.A araştırma görevlisi tarafından gerçekleştirilecektir. Bu protokol için hazırlık yaparken, ışığa maruz kalma süresini en aza indirerek %1'lik urinal form eight çözeltisi hazırlamak gereklidir.

Buna, çözeltinin ilk kez filtrelenme zamanı geldiğinde şırınga N 0.2 mikron filtre parçalarının folyoya sarılması dahildir. Filtrelemeden sonra, deney gününde folyoya sarılı vialler içerisinde iki mililitrelik alikotları negatif 80 derece Celsius'ta saklayın. Oda sıcaklığındaki bir su banyosunda, tamamen çözülene kadar bir alikotu çözdürün.

Parçaları folyoya sarılı haldeyken 0,02 mikronluk bir filtreden tekrar süzün. Toplama tüpü de folyoya sarılmalıdır. Negatif boyayı, kullanılana kadar bir buz kutusuna aktarın.

Sekiz inç uzunluğundaki param malzemesini bir pipet ucu destekleyicisine bastırarak bir damlacık tutma levhası hazırlayın. Bu işlem, beş milimetre çapında kuyucuklar görevi gören yol girintileri oluşturur. Altı sıra kuyucuk oluşturduktan sonra, bir strafor tepsinin yüzeyindeki buzu düzleştirin ve ardından levhayı buzun üzerine yerleştirin.

Ardından, sol taraftaki plakanın ilk üç kuyucuğuna 35 µL DI su ekleyin. Daha sonra, plakadaki sağdaki üç kuyucuğa hazırlanan negatif boyama çözeltisinden 35 µL yükleyin. Çözeltinin ışığa maruz kalmasını en aza indirmek için tepsiyi kapatın.

Burası boyama istasyonu olarak kullanılacaktır. Şimdi, cımbızların monte edilebileceği bir aparata sahip boş bir pipet ucu kutusundan bir EM ızgara inkübasyon istasyonu hazırlayın. Cımbızlar monte edildiğinde buz yüzeyi cımbız uçlarına yakın olacak şekilde kutuyu yarıya kadar buzla doldurun.

İlk olarak, ince karbon kaplı 300 mesh bakır EM ızgaralarını yaklaşık 10 saniye boyunca glow discharge işlemine tabi tutun. Ardından, EM ızgara inkübasyon istasyonuna takılan cımbızlarla bir ızgara alın. Cımbızı ızgarayla birlikte, ızgara buzun yarım inç üzerinde ve 45 derecelik bir eğimde olacak şekilde asın.

Şimdi protein örneğini, çözeltinin mililitre başına 50 ila 100 mikrogram protein olacak şekilde DPBS ile seyreltin. Seyreltiden yaklaşık dört mikrolitreyi hemen EM ızgarasına uygulayın. Örneği yaklaşık bir dakika boyunca inkübe edin.

Bir dakika sonra, fazla solüsyonu uzaklaştırmak için fileyi süzgeç kağıdıyla hızlıca kurulayın. Ardından boyama istasyonunda, fileyi parafilm üzerindeki ilk su damlasına değdirin. Filtrenin kurulanması ve bir sonraki damlayla tekrar ıslatılması işlemini hızlıca tekrarlayın.

Toplam üç su damlası kullanın ve bu işlemi mümkün olduğunca hızlı gerçekleştirin. Tampon değişimi protein üzerinde olumsuz etki yaratmasın diye ızgara suyla hızla yıkanmalıdır. Son yıkama işlemi sonrası üç saniye içinde kurulamayı yaptıktan sonra, ızgarayı ilk negatif boyama çözeltisi damlasının üzerine yüzdürmeye başlayın.

10 saniye boyunca orada yüzmesini bekleyin. Bu sırada, uçlarını filtre kağıdına bastırarak cımbızı temizleyin. On saniyelik yüzme işleminin ardından birkaç kez çözeltiyi filtre kağıdıyla kurulayın ve bir sonraki boya damlasında iki saniyelik başka bir yüzdürme işlemi başlatın.

İki saniye boyunca cımbızı temizleyin. Ardından, ızgarayı kurulamak için hafifçe tamponlayın ve üçüncü damlanın üzerine yerleştirin. Bu adım sırasında boyama istasyonunun üzerini tam bir dakika boyunca kapatın.

Izgaranın eşit şekilde kurumasını sağlamak için, boyanın uzaklaştırılması işlemi EM ızgarasının arka tarafına tam olarak belirlenen süre boyunca dokunularak yapılmalıdır. Filtre kağıdı boyaya çok uzun süre temas ederse, gereğinden fazla boya uzaklaştırılabilir ve bu da görüntüleme kalitesinin düşmesine yol açabilir. Ardından, ızgaranın kurutma işlemine geçiniz.

İlk olarak, çözelti tamamen aktarılana kadar karbon içermeyen tarafın tamamını filtre kağıdına değdirin. İkinci olarak, hafif bir nitrojen gazı akımı uygulayın. Şimdi ızgarayı filtre kağıdı ile kaplanmış bir kaba aktarın ve kabın üzerini kısmen kapatın.

Izgaranın kap içinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kurumasına izin verin. Alternatif olarak, lipid içeren örnekler 40 °C'de bir saat boyunca fırınlanabilir. Tamamen kuruduktan sonra, TEM hizalamasına başlamadan önce EM ızgarasını bir EM ızgara saklama kutusuna aktarın.

Negatif boyalı gridin karbon film alanının güç spektrumu ile en yüksek görünür erime halkasının çözünürlüğünü kontrol edin; bu değer hedeflenen çözünürlükten daha iyi olmalıdır. Ardından hizalamayı ayarlamak için numunenin karbon film alanındaki güç spektrumunu dikkatlice kontrol edin. Uygun şekilde hizalanmış bir durumda, beş angstromdan daha iyi bir görüntülemeye karşılık gelen 20'den fazla Thon halkası görselleştirilebilir.

Halkalar, 1.6 mikron defocus ve kare Angstrom başına 20.4 elektron doz altında, amorf karbon görüntüsünün Fourier dönüşümü ile oluşturulmuştur. Şimdi, EM ızgarasının incelenmesi sırasında küçük proteinlerin görüntülenmesi için odağı yaklaşık 0.1 mikrometre olan Scherzer odağına yakın bir duruma geri getirin. İdeal olarak, boyalı bölgeler düşük büyütmede genellikle daha kalın boyalı bulutlu bölgelerin kenarlarına yakındır.

Lipoprotein örneklerinin yapıları OPNS ile incelendi. Örnekler arasında rekombinant HDL, insan plazması, LDL, insan plazması IDL ve insan plazması VLDL yer almaktadır. 53 kilodaltonluk CETP gibi daha küçük yapılar da incelendi.

Bu, eem ile başarıyla görüntülenen en küçük proteinlerden biridir. CETP kristal yapısının üst üste bindirilmesi, görüntüyle oldukça iyi ve oldukça dinamik bir şekilde eşleşmektedir. Heterojen proteinler ayrıca 160 kilodaltonluk immünoglobulin G antikorlarında da görüntülenmiştir.

Üç alt alan açıkça görünüyordu. IgG 1 antikoru üzerinde yapılan daha detaylı incelemede, kristal yapısı ile karşılaştırma yapıldı. IgG 1 antikorunun kristal yapısı, domain konumları ve şekilleri gibi birçok açıdan bu antikorların EM görünümüyle örtüşmektedir.

Görüntülenen diğer moleküller arasında 28 kilodaltonluk, lipid içermeyen apo lipoprotein A one grow EL ve proteazomlar yer almaktadır. Temelde OPNS yöntemi, küçük asimetrik yapılar için EM görüntülemenenin sınırlarını ve ilgili mekanistik çalışmaları önemli ölçüde ileri taşımaktadır. Prosedür uygulanırken, boya reaktifinin ışığa maruziyetini mümkün olduğunca azaltmak, örneği hızla yıkamak ve görüntüleme için yakın hazine odağı (near treasure focus) kullanmak önemlidir.

Tek tek moleküllerin nanometre çözünürlükteki yapıları ve bunlar arasındaki konformasyonel değişiklikler gibi ek soruları yanıtlamak için elektron tomografisi gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu gelişmeden sonra, söz konusu teknik, yapısal biyoloji alanındaki araştırmacıların insan plazma lipoproteinleri arasındaki küme ester transferinin mekanizmalarını keşfetmelerinin önünü açmıştır.