Birden Farklı Suşlarının incelenmesi için bir mikroakışkan Cihazı
November 9th, 2012
Biz temiz oda ya da yumuşak litografi gerek kalmadan, birden çok farklı suşları için benzer dinamik koşullar uygulanarak yeteneğine microfluidic cihazlar üretmek için basit bir yöntem sunulmaktadır.
Aşağıdaki yöntemin genel amacı, aynı dinamik koşullar altında farklı maya türlerinden tek hücrelerin davranışını görüntülemektir. Bu, iki katmanlı bir mikroakışkan cihazın imal edilmesiyle elde edilir veya alt katman, farklı suşların her birini ayrı ayrı içerecek ve üst katman, ikinci bir adım olarak dinamik akış koşullarını sağlayacaktır. Kuyucuklara farklı maya suşları yerleştirilir ve cihaz kapatılır, böylece birden fazla ayrı suş ile tek bir kanal oluşturulur.
Daha sonra, dinamik ortam değişikliklerine hücre tepkilerini görüntülüyoruz Y Kanalının iki girişindeki akış hızlarını kontrol ederek, sonuçlar aynı dinamik koşullara maruz kalan farklı suşları ve kuyular arasında çapraz kontaminasyon olmadığını gösteriyor. Bu mikroakışkan cihaz, mevcut diğer sistemlere göre birkaç önemli avantaja sahiptir. Aynı dinamik koşullar altında birden fazla farklı suşun görüntülenmesine izin verir.
Ayrıca, daha da önemlisi, özel bir ekipmana ihtiyaç duymadan herhangi bir laboratuvarda kolayca üretilebilir. Bu yöntem, farklı vahşi Doğu izolatlarının açlık geçişlerine verdiği tepkilerin nasıl takip edileceği konusundaki tartışmadan geldi. Ölçeklendirmek için istediğiniz mikro kanal düzenini başlatın, çizin veya yazdırın.
Ardından, bir cam slaytı viski bandı katmanlarıyla kaplayın Kanalın istenen yüksekliğini elde etmek için, yerleşim tasarımını düz bir yüzeye yerleştirin ve slaytı tasarım deseninin üzerine hizalayın. Şimdi cam slayt üzerindeki bandı düzene göre dikkatlice kesin. Cam sürgünün tüm bölgelerinden bant bandını çıkarın.
Mikro kanalın düzenindekileri kabul edin. Slaytı üç dakika boyunca 65 santigrat derece ısıtma fırınına koyun. Ardından etanol ile nazikçe temizleyin.
PDMS'nin baz ve kürleme bileşenlerini üretici tarafından önerildiği şekilde karıştırın. Yaklaşık 30 mililitre PDMS karışımını yaklaşık 0,5 santimetre yüksekliğe kadar bir Petri kabına dökün. Gerekirse PDMS'yi vakumda gazdan arındırın.
Cam sürgünü, desenli bant yukarı bakacak şekilde PDMS'ye batırın. Desenin PDMS'den sonra yerleştirilmesi, slayt ile çanak arasında hava kabarcıklarının oluşmasını önler Alt kürleme 65 santigrat derecede 48 saat boyunca, yeni bir 90 milimetrelik Petri kabında bir kabarcık seviyesi kullanarak yemeğin yatay olduğundan emin olun. Üç mililitre PDMS karışımını dökün.
Bu adım, varsa bir döndürme kodlayıcıda yapılabilir. DGA'lar ve daha önce gösterildiği gibi kürlenir. Şimdi mikroakışkan cihazın akış tabakasını bir biyopsi zımbası ile istenen boyuta nazikçe kesin.
Akış katmanındaki girişler ve çıkışlar için delikler oluşturun. Ayrıca ikinci Petri kabından benzer büyüklükte bir kuyu tabakası kesin ve kalın bir camın üzerine yerleştirin. Tasarım düzeninin üzerinde kaydırın.
Ardından, etanol kullanarak düzendeki mikro kanallarla aynı hizada kuyuları delin, hem PDMS katmanlarını hem de bir cam kapak kızağını temizleyin ve havayla kurutun. Daha sonra, cam kapak kızağını ve kuyu tabakası PDMS'yi, geri dönüşümsüz yapıştırma için standart plazma aşındırıcı veya geri dönüşümlü yapıştırma için el tipi bir korona işleyici ile işlemden geçirin. Yapışmayı sağlamak için kuyu tabakasını dikkatlice kapak kaymasının üzerine yerleştirin.
Hava kabarcıklarını nazikçe ovalayın. İstenilen ortamı uygun şırıngalarda hazırlayın ve bir şırınga pompasından geçirilmiş tigon borusuna bağlayın. Hücre görüntüleme için.
Güçlü yönleri kullanın. İstenilen faza gidin, kültürü iyice vorteksleyin ve 300 mikrolitreyi mikro santrifüj tüplerine aktarın. PDMS kuyu tabakasının her bir kuyucuğuna nazikçe bir mikrolitre con canna A yerleştirin.
A içindeki con kururken suyu hafifçe pipetleyerek her kuyucuktaki fazla conna A'yı iki kez yıkayın. Suşları 300 mikrolitre SC ortamı eksik glikoz ile iki kez yıkayın. Hücre duvarlarından kalan glikozun yıkanması, konvale uygun şekilde yapışmasına yardımcı olur.
Girdaplamadan sonra, hücreler yaklaşık 0.5 mikrolitre hücre süspansiyonunu ayrı ayrı kuyucuklara iyice pipetler. Kalan hücreleri zengin ortamla nazikçe yıkayın. Hücrelerin kurumasını önlemek için sonraki iki adımın hızlı bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir.
İsteğe bağlı bir adım plazma olarak, çipi ve kuyucukları doğrudan kuyucuklara çarpmamaya dikkat ederek tedavi edin. Daha sonra bir stereoskop altında, ikisi arasındaki hizalamaya çok dikkat ederek çipi dikkatlice kuyucukların üzerine yerleştirin. İki PDMS katmanını yapıştırmak için hafifçe bastırın.
Cihazı yavaşça yaklaşık 50 mikrolitre zengin ortamla tamamen doldurun ve kanalın içinde hava kabarcığı kalmadığından emin olun. Şimdi cihazı bağlayın, tüpleri uygun girişlere yerleştirin ve medya akışını başlatın. Boruda hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin, çünkü bunlar cihaza sıkışabilir ve akışı bozabilir.
Cihazı mikroskop altına yerleştirmeye devam edin ve her birinde uygun görüntüleme noktalarını bulun. Hücreleri bir saat veya gerekirse daha uzun süre zengin, orta akış altında tutun. Kurtarmaya izin vermek için.
Deneyi sabit akış ayarıyla başlatın. A'yı saatte 0,8 mililitreye ve B'yi saatte 0,2 mililitreye pompalayın. Ortam için, kanal genişliğinin %80'inden fazla akar.
Bağıl akış hızlarını değiştirerek cihazdaki koşulları dinamik olarak değiştirebiliriz. Yeni koşullar, farklı suşlar arasındaki ayrımı göstermek için tüm kanal boyunca saniyeler içinde stabilize olur. Alternatif kuyucuklarda iki ayırt edilebilir maya suşu görüntülenmiştir.
Bu deneyde kuyucuklar arasında hücre sızıntısı olmadığını unutmayın. Her iki suş da, dinamik olarak değişen koşulların eşzamanlı etkisini test etmek için YFP ile etiketlenmiş MSN iki transkripsiyon faktörüne sahiptir. İki giriş kanalındaki akış hızları, glikoz ortamı olmayan bir adım oluşturmak için değiştirildi.
Bu, MSN iki'nin çekirdeğe lokalizasyonu ile sonuçlandı. Daha da önemlisi, tek hücrelerde nükleer MSN iki YFP seviyesinin zaman izi analiz edilebilir. Bu nedenle, PDMS mikroakışkan cihazı, eşzamanlı dinamik koşulların birden fazla kuyuya uygulanması için kullanılabilir.
Bu prosedürü denerken, cihazın montajı sırasında hücrelerin kurumasına izin vermemeyi unutmamak önemlidir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik yumuşak litografiye gerek kalmadan kolayca yapılabilir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, farklı türlerden tek maya hücrelerinin davranışını, aynı dinamik koşullar altında, bir mikroakışkan cihaz kullanarak görüntüleme yöntemi sunmaktadır. Cihaz, çapraz kontaminasyonu önlemek için tasarlanmışken, aynı anda birden fazla türün gözlemlenmesine izin vermektedir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikroakışı
- Hücre Görüntüleme
- Maya Biyolojisi
Arka Plan
- Dinamikler koşullar altında hücre davranışını anlamak, çeşitli biyolojik çalışmalar için kritik öneme sahiptir.
- Geleneksel yöntemler genellikle temiz oda ortamları ve karmaşık üretim teknikleri gerektirir.
- Bu çalışma, deneysel bütünlüğü korurken süreci basitleştirmeyi amaçlamaktadır.
- Mikroakışı cihazları, hücre çalışmaları için çevresel koşullar üzerinde hassas kontrol sunar.
Çalışmanın Amacı
- Birden fazla maya türünün eşzamanlı görüntülemesine izin veren bir mikroakışkan cihaz geliştirmek.
- Farklı türlere çapraz kontaminasyon olmadan dinamik akış koşullarını uygulamak.
- Maya hücre tepkilerinin çevresel değişikliklere olan anlayışını geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- İki katmanlı bir mikroakışkan cihazın üretimi.
- Farklı maya türlerinin cihazın ayrı kuyularına yerleştirilmesi.
- Kontrollü akış hızları aracılığıyla dinamik akış koşullarının uygulanması.
- Medya değişikliklerine hücre tepkilerinin görüntüleme.
Ana Sonuçlar
- Cihaz, farklı maya türleri arasında başarılı bir şekilde ayrım sağlamıştır.
- Görüntüleme, aynı dinamik koşullara karşı maya türlerinin farklı tepkilerini ortaya koymuştur.
- Yöntem, basitlik ve etkinlik açısından mevcut sistemlere göre avantajlar göstermiştir.
- Deneyler sırasında kuyular arasında herhangi bir çapraz kontaminasyon gözlenmemiştir.
Sonuçlar
- Bu mikroakışkan cihaz, birden fazla maya türünü incelemek için yeni bir yaklaşım sunmaktadır.
- Yöntem, karmaşık kurulumlara ihtiyaç duymadan kontrollü deneyler yapılmasına olanak tanır.
- Gelecek uygulamaları, diğer hücre türlerine ve deneysel koşullarına kadar uzanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Comparative analysis of multiple cell strains under identical dynamic conditions is critical for early discovery and target validation in biopharma R&D. This microfluidic device enables simultaneous, contamination-free imaging of distinct yeast strains, supporting robust hypothesis testing and mechanistic de-risking. Its accessible fabrication and dynamic control streamline workflows at key inflection points in the discovery pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct comparison of cellular responses across multiple strains under controlled environmental shifts.
- Supports functional target validation by isolating strain-specific phenotypes in a shared dynamic context.
- Facilitates mechanistic de-risking by eliminating environmental variability as a confounder.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, contamination-free biological systems for downstream quantitative assays.
- Standardizes environmental exposure, enhancing reproducibility and assay reliability.
- Enables high-content imaging and multiplexed readouts for screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns experimental conditions for translational biomarker discovery when using disease-relevant yeast models.
- Maintains continuity from early discovery through preclinical validation by supporting consistent dynamic perturbations.
- Reduces risk of false positives by ensuring environmental uniformity across strains.
Pipeline & Workflow Integration
This device integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling parallel, quantitative analysis of multiple strains under synchronized dynamic conditions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by controlling environmental variables across strains.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible systems for compound or genetic screening.
- Analytics: Delivers quantitative, time-resolved imaging outputs for robust statistical comparison.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and mechanistic continuity when relevant to yeast-based disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, easily manufactured platform adaptable to diverse strain panels and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in comparative studies.
- Operational Value: Simplifies device fabrication and standardizes experimental setup across labs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by enabling direct, quantitative strain comparisons.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by clarifying strain-specific responses under uniform conditions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic assembly and quantitative cell imaging.
- Needs access to basic PDMS fabrication tools and standard microscopy infrastructure.
- Demands careful cross-team standardization of environmental flow parameters.
- Adaptable to other model systems with similar size and adherence properties.
- Practical limitations include throughput constraints and manual alignment steps.
