Birden Farklı Suşlarının incelenmesi için bir mikroakışkan Cihazı

Biz temiz oda ya da yumuşak litografi gerek kalmadan, birden çok farklı suşları için benzer dinamik koşullar uygulanarak yeteneğine microfluidic cihazlar üretmek için basit bir yöntem sunulmaktadır.

Aşağıdaki yöntemin genel amacı, aynı dinamik koşullar altında farklı maya türlerinden tek hücrelerin davranışını görüntülemektir. Bu, iki katmanlı bir mikroakışkan cihazın imal edilmesiyle elde edilir veya alt katman, farklı suşların her birini ayrı ayrı içerecek ve üst katman, ikinci bir adım olarak dinamik akış koşullarını sağlayacaktır. Kuyucuklara farklı maya suşları yerleştirilir ve cihaz kapatılır, böylece birden fazla ayrı suş ile tek bir kanal oluşturulur.

Daha sonra, dinamik ortam değişikliklerine hücre tepkilerini görüntülüyoruz Y Kanalının iki girişindeki akış hızlarını kontrol ederek, sonuçlar aynı dinamik koşullara maruz kalan farklı suşları ve kuyular arasında çapraz kontaminasyon olmadığını gösteriyor. Bu mikroakışkan cihaz, mevcut diğer sistemlere göre birkaç önemli avantaja sahiptir. Aynı dinamik koşullar altında birden fazla farklı suşun görüntülenmesine izin verir.

Ayrıca, daha da önemlisi, özel bir ekipmana ihtiyaç duymadan herhangi bir laboratuvarda kolayca üretilebilir. Bu yöntem, farklı vahşi Doğu izolatlarının açlık geçişlerine verdiği tepkilerin nasıl takip edileceği konusundaki tartışmadan geldi. Ölçeklendirmek için istediğiniz mikro kanal düzenini başlatın, çizin veya yazdırın.

Ardından, bir cam slaytı viski bandı katmanlarıyla kaplayın Kanalın istenen yüksekliğini elde etmek için, yerleşim tasarımını düz bir yüzeye yerleştirin ve slaytı tasarım deseninin üzerine hizalayın. Şimdi cam slayt üzerindeki bandı düzene göre dikkatlice kesin. Cam sürgünün tüm bölgelerinden bant bandını çıkarın.

Mikro kanalın düzenindekileri kabul edin. Slaytı üç dakika boyunca 65 santigrat derece ısıtma fırınına koyun. Ardından etanol ile nazikçe temizleyin.

PDMS'nin baz ve kürleme bileşenlerini üretici tarafından önerildiği şekilde karıştırın. Yaklaşık 30 mililitre PDMS karışımını yaklaşık 0,5 santimetre yüksekliğe kadar bir Petri kabına dökün. Gerekirse PDMS'yi vakumda gazdan arındırın.

Cam sürgünü, desenli bant yukarı bakacak şekilde PDMS'ye batırın. Desenin PDMS'den sonra yerleştirilmesi, slayt ile çanak arasında hava kabarcıklarının oluşmasını önler Alt kürleme 65 santigrat derecede 48 saat boyunca, yeni bir 90 milimetrelik Petri kabında bir kabarcık seviyesi kullanarak yemeğin yatay olduğundan emin olun. Üç mililitre PDMS karışımını dökün.

Bu adım, varsa bir döndürme kodlayıcıda yapılabilir. DGA'lar ve daha önce gösterildiği gibi kürlenir. Şimdi mikroakışkan cihazın akış tabakasını bir biyopsi zımbası ile istenen boyuta nazikçe kesin.

Akış katmanındaki girişler ve çıkışlar için delikler oluşturun. Ayrıca ikinci Petri kabından benzer büyüklükte bir kuyu tabakası kesin ve kalın bir camın üzerine yerleştirin. Tasarım düzeninin üzerinde kaydırın.

Ardından, etanol kullanarak düzendeki mikro kanallarla aynı hizada kuyuları delin, hem PDMS katmanlarını hem de bir cam kapak kızağını temizleyin ve havayla kurutun. Daha sonra, cam kapak kızağını ve kuyu tabakası PDMS'yi, geri dönüşümsüz yapıştırma için standart plazma aşındırıcı veya geri dönüşümlü yapıştırma için el tipi bir korona işleyici ile işlemden geçirin. Yapışmayı sağlamak için kuyu tabakasını dikkatlice kapak kaymasının üzerine yerleştirin.

Hava kabarcıklarını nazikçe ovalayın. İstenilen ortamı uygun şırıngalarda hazırlayın ve bir şırınga pompasından geçirilmiş tigon borusuna bağlayın. Hücre görüntüleme için.

Güçlü yönleri kullanın. İstenilen faza gidin, kültürü iyice vorteksleyin ve 300 mikrolitreyi mikro santrifüj tüplerine aktarın. PDMS kuyu tabakasının her bir kuyucuğuna nazikçe bir mikrolitre con canna A yerleştirin.

A içindeki con kururken suyu hafifçe pipetleyerek her kuyucuktaki fazla conna A'yı iki kez yıkayın. Suşları 300 mikrolitre SC ortamı eksik glikoz ile iki kez yıkayın. Hücre duvarlarından kalan glikozun yıkanması, konvale uygun şekilde yapışmasına yardımcı olur.

Girdaplamadan sonra, hücreler yaklaşık 0.5 mikrolitre hücre süspansiyonunu ayrı ayrı kuyucuklara iyice pipetler. Kalan hücreleri zengin ortamla nazikçe yıkayın. Hücrelerin kurumasını önlemek için sonraki iki adımın hızlı bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir.

İsteğe bağlı bir adım plazma olarak, çipi ve kuyucukları doğrudan kuyucuklara çarpmamaya dikkat ederek tedavi edin. Daha sonra bir stereoskop altında, ikisi arasındaki hizalamaya çok dikkat ederek çipi dikkatlice kuyucukların üzerine yerleştirin. İki PDMS katmanını yapıştırmak için hafifçe bastırın.

Cihazı yavaşça yaklaşık 50 mikrolitre zengin ortamla tamamen doldurun ve kanalın içinde hava kabarcığı kalmadığından emin olun. Şimdi cihazı bağlayın, tüpleri uygun girişlere yerleştirin ve medya akışını başlatın. Boruda hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin, çünkü bunlar cihaza sıkışabilir ve akışı bozabilir.

Cihazı mikroskop altına yerleştirmeye devam edin ve her birinde uygun görüntüleme noktalarını bulun. Hücreleri bir saat veya gerekirse daha uzun süre zengin, orta akış altında tutun. Kurtarmaya izin vermek için.

Deneyi sabit akış ayarıyla başlatın. A'yı saatte 0,8 mililitreye ve B'yi saatte 0,2 mililitreye pompalayın. Ortam için, kanal genişliğinin %80'inden fazla akar.

Bağıl akış hızlarını değiştirerek cihazdaki koşulları dinamik olarak değiştirebiliriz. Yeni koşullar, farklı suşlar arasındaki ayrımı göstermek için tüm kanal boyunca saniyeler içinde stabilize olur. Alternatif kuyucuklarda iki ayırt edilebilir maya suşu görüntülenmiştir.

Bu deneyde kuyucuklar arasında hücre sızıntısı olmadığını unutmayın. Her iki suş da, dinamik olarak değişen koşulların eşzamanlı etkisini test etmek için YFP ile etiketlenmiş MSN iki transkripsiyon faktörüne sahiptir. İki giriş kanalındaki akış hızları, glikoz ortamı olmayan bir adım oluşturmak için değiştirildi.

Bu, MSN iki'nin çekirdeğe lokalizasyonu ile sonuçlandı. Daha da önemlisi, tek hücrelerde nükleer MSN iki YFP seviyesinin zaman izi analiz edilebilir. Bu nedenle, PDMS mikroakışkan cihazı, eşzamanlı dinamik koşulların birden fazla kuyuya uygulanması için kullanılabilir.

Bu prosedürü denerken, cihazın montajı sırasında hücrelerin kurumasına izin vermemeyi unutmamak önemlidir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik yumuşak litografiye gerek kalmadan kolayca yapılabilir.