Arabidopsis Bitkilerinde İkili Bakteriyel Yapay Kromozom Vektör Tabanlı Gen Dönüşümü: Tek Kopya Yerleştirme ile Transgenik Bitkiler Oluşturma Tekniği

Olgunlaşmamış çiçek başları taşıyan Arabidopsis bitkileri ile başlayın. Çiçek başlarını, hem E. coli hem de Agrobacterium sistemlerinde çoğalan bir vektör olan ikili bakteriyel yapay kromozom veya BIBAC ile klonlanmış T-DNA taşıyan Agrobacterium hücre süspansiyonuna batırın. Bu T-DNA ikili vektörü, tohuma özgü bir promotör boyunca herbisit direnç geni ve floresan seçilebilir belirteçler gibi büyük transgenler sağlayabilir.

Çiçek başları hala suya daldırılmışken, Agrobacterium ile temaslarını artırmak için bitkileri nazikçe çalkalayın. Bitkileri enfekte etme konusundaki doğal yeteneği ile Agrobacterium, transgeni çiçek hücresine aktarır. Transgen hücreye girerken çekirdeğe doğru hareket eder ve bitki genomu ile birleşir.

Şimdi, bitkiyi streç filme sarın ve daha iyi dönüşüm için nemi korumak için karanlıkta kuluçkaya yatırın. Filmi çıkarın ve bitkileri tohum üretene kadar fizyolojik koşullar altında büyütün.

Daha sonra, tohumları hasat edin ve dönüştürücüleri seçmek için floresan mikroskobu altında gözlemleyin. Şimdi, dönüştürülmüş tohumları çimlenene kadar uygun koşullarda büyütün. Bitkilere herbisit püskürtün ve kuluçkaya yatırın.

Birden fazla transgen eklemesi olan bitkiler gen susturma ve soldurma deneyimi yaşarken, tek kopya eklemeli bitkiler aktif bir herbisit metabolize edici enzim eksprese eder ve tedaviden sağ çıkar. Hayatta kalan transformantlardan genomik DNA'yı çıkarın ve tek kopya yerleştirmenin verimliliğini hesaplamak için PCR gerçekleştirin.

Arabidopsis bitkilerini dönüşüme hazırlamak için, Arabidopsis bitkilerini çiçek açana kadar bir serada veya iklim kontrollü yetiştirme odasında büyütün. Daha fazla ikincil cıvatanın ortaya çıkmasına izin vermek için ilk cıvataları klipsleyin. Bitkiler, kırpıldıktan dört ila altı gün sonra, bitkilerin çok sayıda olgunlaşmamış çiçek başına sahip olduğu ve çok fazla döllenmiş silisiğe sahip olmadığı zaman daldırmaya hazırdır.

Çiçek daldırma yapmak için, çiçek salkımını Agrobacterium süspansiyonuna 5 ila 10 saniye batırın. Hafif çalkalama kullanın. Nem oranını yüksek tutmak için bitkilerin toprak üstü kısımlarını streç filme sarın ve bitkileri karanlıkta tutmak için bitki saksılarını bir kutu ile örtün.

Bitkileri bir serada veya büyüme odasında iki gün boyunca kuluçkaya yatırın. İki gün sonra, kutuyu ve streç filmi çıkarın ve bitkileri bir serada veya büyüme odasında olgunlaşana kadar büyütün. Dönüşümün verimliliğini artırmak için, aynı bitkiler ilk daldırmadan yedi gün sonra yeniden daldırılabilir.

Daha sonra, dönüştürülmüş bitkiler olgunlaştığında ve kuruduğunda tohumları hasat edin. Aynı yapıyla dönüştürülen bitkilerin tohumlarını tek bir set olarak bir araya getirin ve analiz edin. Bitkilerin bir BIBAC-RFP-Gateway plazmid türevi ile dönüştürülmesi durumunda, tohumları floresan mikroskobu kullanarak analiz ederek transgenik bitkileri tanımlayın.

Tohum kabuklarındaki DsRed ekspresyonunu tespit etmek için, tohumları 560 nanometrelik bir uyarılmada ve 600 ila 650 nanometre emisyonda görüntüleyin. Floresan tohumları forseps kullanarak floresan olmayan muadillerinden ayırın.

BIBAC-BAR-Gateway plazmid türevi ile dönüştürülmüş transgenik bitkileri taramak için tohumları toprakla dolu tepsilere ekin. Tohumları 0,5X MS ortamında% 0,1 agar içinde askıya alarak tohumların tepsilere eşit şekilde yayılmasını sağlayın ve tohumları 1 mililitrelik bir pipet kullanarak yayın.

Tohumları 4 santigrat derecede en az iki gün kuluçkaya yatırarak tohumları senkronize bir şekilde çimlenmeye teşvik edin. Bu, tohumların ekilmesinden önce veya sonra yapılabilir. Tohumları ektikten iki ve üç hafta sonra, fidelere% 0.5 Glufosinat-amonyum çözeltisi püskürtün. 1 metrekare başına 500 mililitre Glufosinat-amonyum çözeltisi kullanın. Hayatta kalan fideleri saksılara aktarın. Glufosinat-amonyuma dirençli bitkileri, ilgilenilen yapının varlığı için PCR ile analiz edin.