Kromozom segregasyon mitoz sırasında canlı hücre görüntüleme

Bu yöntemin genel amacı, Histone 2B-GFP BacMam 2.0 etiketi ve bir eğirme diski konfokal mikroskopi sistemi kullanarak mitotik hücrelerdeki canlı kromozomları etiketlemek ve görselleştirmektir. Bu yöntem, genetik modifikasyonların veya ilaç tedavilerinin kromozom ayrışması üzerindeki etkilerini incelemek için kültürlenmiş hücrelerdeki mitotik kromozomları görselleştirmek için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, mitotik hücrelerdeki canlı kromozomları etiketlemek ve görselleştirmek için kolay ve kullanışlı bir yöntem sağlamasıdır.

Canlı görüntüleme prosedürünü sergileyen Doktor Kazuyo Takeda, FDA Biyolojik Değerlendirme ve Araştırma Merkezi'nde Viral Ürünler Bölümü'nde Mikroskopi ve Görüntüleme Çekirdek Tesisini sürdürecek. Bu deneyde kullanılan fare embriyonik fibroblastları veya MEF'ler, metin protokolünde açıklandığı gibi, gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de iki kuyulu odacıklı bir kapak camında büyütülür. Ertesi gün,% 0.1 FBS içeren DMEM / F12 büyüme ortamında inkübe ederek G0 / G1 fazındaki MEF'leri senkronize edin.

Etiketleme gününde, DMSO'da mililitre stok başına 1.5 miligram nokodazol çözeltisi hazırlayın. Kritik bir adım, hücrelere toksisite olmadan kromozom görselleştirmesi için yeterli etiketleme elde etmek için hücre başına doğru miktarda CL-HB partikülünü hesaplamaktır. Daha önce titrasyon deneyleriyle 30 PPC'nin en iyi sonucu verdiğini belirlemiştik.

MEF'lere,% 10 FCS içeren 200 mikrolitre büyüme ortamı, mililitre nokodazol başına 200 nanogram ve hücre başına 30 parçacıkta CL-HB reaktifi ekleyin. MEF'leri 37 santigrat derecede ve% 5 CO2'de 18 saat inkübe edin. MEF'lerin görselleştirilmesi, bir çevre odası ve bir yağa daldırma, 63X objektif lens ile donatılmış bir eğirme diskli konfokal mikroskop sistemi kullanılarak gerçekleştirilir.

Görüntülemeden bir gün önce, çevre odasının gücünü açın ve tüm odayı gece boyunca 37 santigrat derecede ısıtın. Ertesi gün, mikroskop standı, kamera, dönen disk ünitesi, aydınlatıcı, argon lazer, bilgisayar ve motorlu sahne için gücü açın. Sistemin üç dakika ısınmasına izin verdikten sonra, kontak anahtarını açarak argon lazeri çalıştırın.

Argon lazeri için geçiş anahtarını bekleme modundan lazer çalışmasına geçirin. Veri toplama ve işleme yazılımını başlatın. Sahne üstü inkübatör için CO2 kontrol cihazını başlatın ve CO2 konsantrasyonunu %5'e ayarlayın Hazneli kapak camını inkübatörden çıkarın, mikroskop tablasına yerleştirin ve yağa daldırma 63X objektif lensini seçin.

Oküler lenslerden görüntüleyin, görüntüyü odaklayın ve nükleer zarf parçalanması veya NEBD aşamasındaki bir hücreyi tanımlayın. Histone 2B-GFP'yi görselleştirmek için 488 nanometre argon lazerini başlatın. Alım kontrol penceresini açın ve GFP kanalı için pozlama süresini ayarlayın.

NEBD'de bulunan bir hücreyi tanımlayın. Ardından, hücrenin üst ve alt odak düzlemini manuel olarak belirleyin ve XYZ optik bölümleme ayarlarını girin. Hücreyi 20 dakika boyunca gözlemleyin.

Tüm hücreler mitozdan geçmeyeceğinden, mitotik ilerlemenin aktif olarak izlenmesi gerektiğinin farkında olmak önemlidir. Hücre 20 dakika sonra hücre bölünmesine devam etmezse, görüntü alımını durdurun ve NEBD'deki bir sonraki hücreye geçin. Bir film için veri elde etmek için her üç dakikada bir fotoğraf çekin.

Mil montaj kontrol noktasından kaçan PP2A-B56-gama hücrelerinde mitoz sırasında gecikmeli kromozomları görüntülemek için hücre başına yaklaşık bir saat gerekir. Daha fazla analiz için görüntüleri ZVI dosya biçiminde kaydedin. Canlı hücre görüntüleme, NEBD'den mitoza kadar ilerlerken tek tek hücrelerin kaderini görselleştirmek için kullanıldı.

Nokodazol tedavisi sonrası, gözlenen 21 vahşi tip hücrenin tümü metafazda tutuklandı. Buna karşılık, gözlenen PP2A-B56-gama içermeyen 21 hücreden 16'sı nokodazol tedavisinden sonra mitozdan geçebildi. Ek olarak, bu MEF'lerin 13'ünde anormal kromozomal ayrışma tespit edildi.

Kromozomal yanlış ayrışmaya uğrayan bir PP2A-B56-gama hücresi örneği bu video klipte gösterilmiştir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, etiketleme protokolünden önceki hücre tedavisine bağlı olarak üç ila dört gün sürecektir. Bunun geçici bir transfeksiyon olduğunu ve sinyallerin sadece beş güne kadar tespit edilebileceğini hatırlamak önemlidir.

Bu protokol, hücre döngüsü regülasyonu, genomik kararsızlık ve hücre tedavisi ürünlerinin kalitesi ile ilgili ek soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, birincil hücre hatları, kök hücreler, nöronlar ve ölümsüzleştirilmiş T hücreleri gibi çok çeşitli hücre hatlarındaki kromozomların canlı görüntülemesini incelemek için kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, Histone 2B-GFP BacMam 2 etiketi ve dönen disk konfokal mikroskopi sistemi kullanarak mitotik hücrelerdeki canlı kromozomları nasıl kolayca etiketleyeceğinizi ve görselleştireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.