Name: İki boyutlu yarı denaturing deterjan özel Jel Elektroforez amiloid veya amiloid benzeri liflerin boyutu heterojen onaylamak için kullanımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Öğrenin iki boyutlu yarı denaturing agaroz jel elektroforezi kullanarak amiloid benzeri liflerin boyut heterojenliğini doğrulamayı. Bu yöntem, liflerin doğal durumunu incelemek için güvenilir bir laboratuvar tekniği sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser için bir arkadaş grubu tarafından desteklenen S.H.-A. NIH/NCATS (TL1TR001104), Welch Vakfı Hibe (I-1827) ve NIGMS (RGM120502A) Z.W. Z.W. bir R01 hibe'tıbbi araştırma ve kanser önleme ve Texas akademik ve Araştırma Enstitüsü (R1222) Virginia Murchison Linthicum uzman olduğunu.

1. hazırlayın örnekleri
<ol><li>Kültür 2 x 106 amiloid HT-29 kolon kanser hücrelerinin 10 ml, Dulbecco'nın modifiye kartal orta (% 10 fetal sığır serum ve penisilin-streptomisin içeren DMEM) 10 cm doku kültürü tabak içinde üreten. Kültür hücreleri 37 ° C kuluçka %5 CO2gece.<ol>
<li>Sonra % 80 confluency için hücrelerin büyümesine, fosfat tamponlu tuz (PBS) 10 mL hücrelerle yıka. 3 mL tripsin çözeltisi ekleyin ve 3 dk 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Hücreleri yemek tamamen Disosiye sonra kültür orta 10 mL ekleyin ve 15 mL konik tüp 10 mL pipet hücrelerle aktarmak. Senaryo Özeti 3 dakika oda sıcaklığında 1000 x g santrifüj kapasitesi. Orta Aspire edin, 5 mL kültür ortamının hücrelerde resuspend ve bir hücre sayaç kullanarak hücreleri saymak. Her iki 10 cm tabak tabak 2 x 106 hücreler.</li>
		<li>Hücreleri uygun ve gecede 37 ° C kuluçka %5 CO2kurtarmak için izin verir. Amyloids 20 ng/mL tümör nekrozis faktör-alfa (TNF-α), 100 nM şaplak atmak mimetic ve 20 µM pan-caspase inhibitörü Z-VAD-FMK11ile oluşumu ikna etmek için bir yemek için tedavi uygulanır. Kasanın TSZ kısaltılır. Araç ile diğer çanak bir denetim olarak tedavi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uygun süreyi sonra genellikle 6 h, lysate hücre hasat.<ol>
<li>Plastik bir sıyırıcı plaka kapalı hücre scrape ve 10 mL pipet 15 mL konik tüp içine aktarmak için kullanın. 1000 x g 4 ° C'de 3 dk de hücreleri santrifüj kapasitesi</li>
		<li>Hücreleri tarafından 10 mL buz soğuk PBS resuspending ve 1000 x g 4 ° C'de 3 dk de centrifuging 2 kez yıkamak PBS çözüm Aspire edin. Not: İşlemi burada hücre Pelet sıvı azot içinde dondurma ve ˗80 ° C ilâ 1 aylığına depolayarak duraklatılmış.</li>
		<li>Hücre Pelet 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarmak ve buz üzerinde 30 dk için lizis arabellek 0.3 ml kuluçkaya. 4 ° C'de 15 dakika 20.000 x g, santrifüj Süpernatant lysate tüm cep telefonu var. Not: İşlemi burada örnek-20 ° C'de için birkaç ay kadar depolayarak duraklatılmış.</li>
		<li>Bir Bradford tahlil üreticisinin protokolüne göre tarafından protein konsantrasyonu ölçmek. 4 x 3 µg/µL örnek 20 µL hazırlamak ve 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya SDD-yaş yükleme arabellek ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. hazırlayın ve jelleri çalıştırın
<ol><li>200 ml 1 x Tris-asetat arabelleği (TAE) bir cam kabı ve özel eritmek için bir mikrodalga Isı özel 2 g ekleyin. 1 mL % 20 SDS % 0,1 SDS son bir konsantrasyon için ekleyin. Karıştırmak için dikkatli bir şekilde girdap. Kabarcıklar SDS eklenmesinden sonra oluşturmamanız için dikkat ediniz.</li>
	<li>Özel çözüm 15 cm x 14 cm jel levha dökün. 1-mL pipet herhangi bir kabarcıkları ortadan kaldırmak için kullanın. Bir 20-iyi tarak en üste yerleştirmek.</li>
	<li>İlk Boyut: pipet 60 µg, her hücrenin sağ şeritte lysate. (Boya açık yaklaşık ¾ jel yoluyla olana) jel 60 V 4 h için çalıştırın çalışan tampon olarak % 0,1 SDS içeren TAE kullanarak.</li>
	<li>İkinci Boyut: jel 90 ° saat yönünün tersine (Şekil 2A) dikkatle döndürün. Jel 60 V 4 h için çalıştırın. Not: Genel çalışan 4 V/cm jel uzunluğu bir durumdur. Çalışan koşulların tam olarak birinci ve ikinci boyutları için aynı olduğunu önemlidir.</li>
</ol>3. transfer
<ol><li>Proteinler polivinilidin difluoride (PVDF) membran (Şekil 2B) aktarmak için kılcal aktarma yöntemini kullanın.<ol>
<li>Aktarma arabelleği için 500 mL ekleyin bir yaklaşık 20 cm x 20 cm kapsayıcı. 5-cm yüksek yığın kağıt havlu konteyner yanında yapmak. Yığının üst yüzey alanı jel boyutları büyük olması gerekir.</li>
		<li>14 cm x 15 cm filtre kağıdı Aktarım arabellek emmek ve kağıt havlu yığını üzerine yerleştirin. Hiçbir kırışıklık veya kabarcıklar ile kağıda yerleştirmek için dikkat ediniz. Filtre kağıt başka bir parça ile tekrar.</li>
		<li>14 cm x 15 cm PVDF membran için 30 metanol içinde etkinleştirmek s sonra filtre tüm kabarcıklar kaldırmak için bir rulo kullanmak için dikkat çekici kağıt üzerinde katman. Jel Aktarım arabellek ile durulayın ve yine herhangi bir kabarcıklar inişli çıkışlı membran üstüne katman.</li>
		<li>Plastik film ile yakın Aktarım arabellek kapsayıcıya kağıt havlu kenarı kapsar. Bir sonraki adımda inşa kağıt köprü kağıt havlu yığını ile doğrudan temas gelebilir değil önemlidir.</li>
		<li>15 cm x 35 cm filtre kağıt Aktarım arabellek emmek ve böylece bir ucunu üst jel kapsar ve diğer ucunu Aktarım arabellek kapsayıcısında yerleştirin. Başka bir köprü ile yineleyin.</li>
		<li>Kapsayıcı plastik wrap ile kapak ve gecede oda sıcaklığında bekletin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Western Blot algılama
<ol><li>Durulama zar 50 mL % 0.05 içeren PBS ile ara-20 (PBST) olarak tehlikeli madde kabına 20 cm × 20 cm. 20 mL % 5 süt PBST içinde ekleyin. Rock engellemek 30 dakika oda sıcaklığında.</li>
	<li>Tavşan anti-MLKL antikor PBST sütte %5 20 mL içine 10 µL pipet ve kapsayıcıya ekle. Gecede 4 ° C'de rocker üzerinde kuluçkaya</li>
	<li>Membran PBST 20 mL için 5 dk. tekrar 5 kere yıkayın.</li>
	<li>Anti-rabbit-HRP 20 ml % 5 süt PBST içinde 4 µL pipet ve kapsayıcıya ekle. 2 h için oda sıcaklığında rocker üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>Membran PBST 20 mL için 5 dk. tekrar 5 kere yıkayın.</li>
	<li>Gelişmiş Kemiluminesan substrat (ECL) ekleyin ve röntgen filmleri üreticinin protokolüne göre için maruz.</li>
</ol>

<ol><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature medicine. 10, 10-17 (2004).</li>
<li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146, 448-461 (2011).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIP1%2FRIP3+necrosome+forms+a+functional+amyloid+signaling+complex+required+for+programmed+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis.</a> Cell. 150, 339-350 (2012).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLKL+forms+disulfide+bond-dependent+amyloid-like+polymers+to+induce+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).</li>
<li>Uptain, S. M., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions+as+protein-based+genetic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+microbiology%22%5BJournal%5D)">Prions as protein-based genetic elements.</a> Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).</li>
<li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Sipe, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nomenclature+2014%3A+Amyloid+fibril+proteins+and+clinical+classification+of+the+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid+%3A+the+international+journal+of+experimental+and+clinical+investigation+%3A+the+official+journal+of+the+International+Society+of+Amyloidosis%22%5BJournal%5D)">Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis.</a> Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).</li>
<li>Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Studies+of+Amyloid+Proteins+at+the+Molecular+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level.</a> Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).</li>
<li>Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687906120030">Methods in Enzymology</a>. 412, Academic Press. 33-48 (2006).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+mediates+necrosis+signaling+downstream+of+RIP3+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase.</a> Cell. 148, 213-227 (2012).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+interacting+protein+kinase-3+determines+cellular+necrotic+response+to+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha.</a> Cell. 137, 1100-1111 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.

En önemli bir özelliği, 2D SDD-yaş Elektroforez koşullar birinci ve ikinci boyutu için aynı olmasıdır. Benzer bir şekilde her iki sırasında geçiş lifleri 45 ° (hiçbir ayrılma veya bozulma oluştuğunu gösteren), keskin bir çapraz çizgi bağlıdır algılama yeteneğini electrophoreses. Farklı koşullar, örneğin voltaj veya çalışma süreyi değiştirme kullanarak bu sonuçlar karanlık olacak. Geleneksel 1 D için olduğu gibi bu amiloid ve amiloid benzeri lifleri bozabilir olacaktır Ayrıca, SDD-yaş, örnek kaynar, kaçınılmalıdır. Tüm tr...

Protein misfolding nedeniyle amiloid lifleri oluşumu, Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı ve Huntington hastalığı1gibi patolojik koşullarda bir rol oynamaya uzun bilinmektedir. Daha yakın zamanlarda, amiloid veya amiloid benzeri liflerin oluşumu sinyal yolları insanlar Anti-yayılmacı doğuştan gelen bağışıklık yanıtı2 necroptosis3,ve4sırasında dahil olmak üzere ve daha düşük organizmalar bir parçası olmak için gösterilen Maya5,6gibi. Bu nedenle, bu elyaf laboratuarda algılama yeteneğini önemlidir. Şu anda, amiloid ve amiloid benzeri lifler algılamak için üç ana yolu vardır: Boyalar, EM ve SDD-yaş kullanımı.
Boya, Kongo kırmızısı veya Thioflavin T, gibi kullanımı hızlı ve kolayca detectable mikroskopi veya spektroskopisi7kullanarak olmanın avantajı sunuyor. Ancak, mikroskopi, Kongo kırmızısı, söz konusu olduğunda tarafından hangi proteinleri oluşturan lifler veya boyutu lifler, hiçbir özgüllük algılar. Benzer şekilde, Kongo kırmızısı veya Thioflavin T bağlayıcı protein kompleksleri için algılamak için spektroskopisi kullanımı yalnızca bir pozitif veya negatif sonuç sağlar.
EM lifleri ve aynı zamanda lif uzunluğu ve çapı8hakkında kantitatif bilgi varlığının kesin kanıt sağlar. Ancak, bu yöntem çok sıkı arıtma gerektirir. Ayrıca, EM pahalı ekipman kullanan bir özel bir tekniktir.
SDD-yaş SDS dayanıklı mega Dalton protein kompleksleri amiloid veya amiloid benzeri lifler de dahil olmak üzere tespit etmek için kullanılmıştır. Birçok avantaj sunar. İlk olarak, arıtma liflerinin gerektirmez ve peform9için kolaydır. İkinci olarak, göreli boyutu ve fiber heterogenicity miktarı dahil olmak üzere liflerinin boyutu hakkında Nitel bilgi sağlar. Western Blot Elektroforez sonra gerçekleştirilen çünkü son olarak, bu SDD-yaş yarı denaturing olduğu için bazı epitopları hangi gizli kalmasını unutulmamalıdır, ancak kendisi için herhangi bir proteinin bir antikor olduğunu var olup olmadığını belirlemek kolaydır algılama antikor tarafından olmak zordur.
Son zamanlarda, reseptör etkileşen protein kinaz 1 (RIPK1) ve 3 (RIPK3) bildirilmiştir formu amiloid lifleri için platformlar necroptosis sırasında nekroz3programlanmış bir tür sinyal olarak hizmet etmek için. Bu iplikler okurken, bizim laboratuvar lineage kinaz etki alanı gibi (MLKL), karışık başka bir necroptosis ilişkili protein de amiloid benzeri lifler4kurdu gösterdi. Ancak, SDD-yaş ile incelenmesi üzerine, MLKL lifleri boyutunu birbirlerine (şekil 1) aynı çıktı RIPK1 ve RIPK3 lifler farklı çıktı. MLKL necroptosis necrosome10denilen karmaşık sinyal oluşturmak için RIPK1/RIPK3 için bağlar tanınmış olduğundan bu beklenmedik bir şeydi.
En az iki açıklaması vardır. İlk olarak, iki tamamen farklı amiloid benzeri lifler necroptosis sırasında bir içeren RIPK1/RIPK3 ve diğer içeren MLKL şeklinde. İkinci olarak, tek bir içeren RIPK1/RIPK3/MLKL necroptosis ama MLKL ilişkilendirmesiyle diğer proteinler sırasında oluşmuş amiloid benzeri lifler zayıf yeterince SDD-yaş sırasında ayrışıp türüdür.
Bu sorunu çözmek için bir iki boyutlu (2D) SDD yaşından öneriyorum. SDD-yaş-kararlı amiloid veya amiloid benzeri lifler aynı geçiş desen birinci ve ikinci boyut Elektroforez sırasında olacaktır. Bu tespit bir membran proteinleri aktarma ve Western blot taşıma sonra olacak. İstikrarlı elyaf keskin köşegen desen sergileyecek. Bu herhangi bir sapma lifler SDS-Elektroforez nedeniyle değişiklikleri meydana öneririz.

<table><tbody><tr><td>jel elektroforez ünitesi</td><td>Fisher</td><td>HE99XPRO</td><td>jel çalışması için appratus.</td></tr><tr><td>agrose</td><td>VWR</td><td>97062-250</td><td>Agaroz jel için.</td></tr><tr><td>kağıt kulesi</td><td>Fisher</td><td>19-120-2484</td> filtre <td>kağıdını aktarmak için</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>21427-386</td><td></td></tr><tr><td>PVDF membranını</td> aktarmak için <td>Bio-Rad</td><td>162-0177</td> blok süt <td>tozunu aktarmak için</td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>1706404XTU</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>MLKL antikorunu</td> bloke etmek için <td>Genetex</td><td>GTX107538</td><td>tavşan anti-MLKL antikoru</td></tr><tr><td>RIPK1 antikoru</td><td>BD Biosciences</td><td>610459</td><td>fare anti-RIPK1 antikoru RIPK3</td></tr><tr><td>antikoru</td><td>Dr. Xiaodong Wang</td><td></td><td>tavşan anti-RIPK3'ten antikor hediyesi. Bkz. Savunma 11.</td></tr><tr><td>anti-Tavşan-HRP</td><td>Sigma</td><td>A6154</td><td>ikincil antikor</td></tr><tr><td>ECL</td><td>Fisher</td><td>WBKLS0500</td><td>Batı kemilüminesan HRP substrat</td></tr><tr><td>X-ışını filmi Western</td><td>blot sonucu için</td><td>Fisher</td><td>F-BX810</td></tr><tr><td>Hücre kültürü için</td><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td></tr><tr><td>fetal sığır serumu</td><td>Hücre</td><td>kültürü</td><td></td></tr> <tr><td>için Sigma F4135hücre kültürü için penisilin-streptomisin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin çözeltisi</td><td>hücre kültürü için</td><td>Sigma</td><td>T4049</td></tr><tr><td>doku kültürü için PBS</td> Hücre kültürü için <td>Sigma</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr>nekrotozu indüklemek için <td>laboratuvarımızda</td><td></td> yapılan<td>rekombinant TNF</td><td>. Referans 11'e bakın.</td></tr><tr>Nekrotozu indüklemek için <td>Dr. Xiaodong Wang'dan</td><td></td> <td>smac-mimetik</td> hediye<td>. Referans 11'e bakın.</td></tr><tr>Nekrotozu indüklemek için <td>ZVAD-FMK</td><td>ApexBio</td><td>A1902</td><td>. Referans 11'e bakın.</td></tr><tr><td>Hücre Sayacı</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td>Model TC20; hücreleri saymak için</td></tr><tr><td>Pierce & trade; BCA Protein Test Kiti</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td>, <td>hücre lizatlarındaki protein konsantrasyonunu ölçmek için</td></tr><tr><td>Hücre kaldırıcı</td><td>Fisher</td><td>07-200-364</td>, <td>hücreleri tabaktan çıkarmak için</td></tr><tr><td>Lizis Tamponu (1 L)</td><td></td><td></td><td>20 mL, 1 M Tris pH 7.4 10 mL gliserol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (proteaz ve fosfat inhibitörleri istenildiği gibi)</td></tr><tr><td>10X TAE (1 L)</td><td></td><td></td><td>48,4 g Tris baz 11,42 mL buzlu asetik asit 20 mL 0,5M EDTA pH 8 ddH20 ila 1 L</td></tr><tr><td>4X SDD-AGE yükleme tamponu (50 mL)</td><td></td><td></td><td>5 mL 10X TAE 10 mL gliserol 4 mL %20 SDS 0,5 mL %10 bromofenol mavisi 31 mL ddH2O</td></tr><tr><td>TBS Transfer Tamponu (1 L)</td><td></td><td></td><td>20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O</td></tr><tr><td>PBST Yıkama Tamponu (1 L)</td><td></td><td></td><td>100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20</td></tr><tr><td>10X PBS (10 L)</td><td></td><td></td><td>800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4&middot; 2H2O 24 g KH2PO4 10 L'ye ddH2O ekleyin</td></tr></tbody></table>

İki boyutlu yarı denaturing deterjan özel jel elektroforez amiloid veya amiloid benzeri liflerin boyutu heterojen onaylamak için kullanımı

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Amiloid Dil veya amiloid benzeri lifler birçok insan hastalıkları ile ilişkili olan ve şimdi birçok sinyal yolları için önemli olduğunu keşfetti edilmektedir. Kolayca bu elyaf çeşitli deneysel koşullarda oluşumu algılama yeteneğini potansiyel işlevleri anlamak için önemlidir. Pek çok yöntem lifler, algılamak için kullanılan ama bazı dezavantajları olmadan olmaz. Örneğin, elektron mikroskobu (EM) veya Kongo kırmızısı veya Thioflavin T ile sık sık boyama arıtma liflerinin gerektirir. Öte yandan, yarı denaturing deterjan özel Jel Elektroforez (SDD-yaş) hücre özleri arıtma olmadan SDS dayanıklı amiloid benzeri lifler algılanmasını sağlar. Buna ek olarak, boyut farkı liflerinin karşılaştırmasını sağlar. Daha da önemlisi, Western Blot tarafından spesifik proteinlerin lifler içinde tanımlamak için kullanılabilir. Daha az zaman alıcı ve labs daha geniş bir dizi için daha kolay erişilebilir. SDD-yaş sonuçları genellikle değişken heterojenite derecesini gösterir. Protein kompleksi SDS huzurunda Elektroforez sırasında ayrılma heterojenite parçası oluşur olup olmadığını sorusunu gündeme getiriyor. Bu nedenle, ikinci bir boyut SDD-ÇAĞINDA görülen boyutu heterojenite gerçekten fiber heterojenite vivo içinde bir sonucu ve bozulma ya da ayrılma sırasında proteinlerin bazı değil bir sonucu olup olmadığını belirlemek için SDD-Age istihdam Elektroforez. Bu yöntem, amiloid veya amiloid benzeri liflerin kısmen SDD-yaş işlemi sırasında dissociating değil hızlı, nitel onay sağlar.

Sonra necroptosis indüksiyon, RIPK1 ve RIPK3 hemen hemen aynı amiloid benzeri desenler (şerit 2 ve 4, şekil 1) gösterdi. Ancak, MLKL lifler daha heterojen ve RIPK1/RIPK3 lifleri (lane 6, şekil 1) küçük olmak gibiydi. Bizi ister MLKL RIPK1/RIPK3-bağımsız lifler oluşturur ya da MLKL sade bir şekilde büyük RIPK1/RIPK3/MLKL lifleri SDD-yaş sırasında ayrışıp. olasılığını adrese 2D SDD-yaş yöntem geliştirmek için istenir.
<p class=...

Burada biz iki boyutlu yarı denaturing özel Jel Elektroforez amiloid benzeri lifler türdeş olmayan boyutta varlığını doğrulamak ve amiloid liflerinin ayrışma sırasında jel boyutu heterojenite kaynaklanmaktadır olasılığını dışlamak için kullanın koşma oluşum.

İki boyutlu yarı denaturing deterjan özel Jel Elektroforez amiloid veya amiloid benzeri liflerin boyutu heterojen onaylamak için kullanımı

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Bu iki boyutlu yarı denatüre edici deterjan agaroz jel elektroforezinin genel amacı, geleneksel SDD-AGE sırasında görülen amiloid veya amiloid benzeri liflerin boyut heterojenliğini doğrulamaktır. Bu yöntem, geleneksel SDD-AGE sırasında görülen boyut heterojenliğinin in vivo liflerin doğal durumu mu yoksa jel elektroforezi sırasında protein bozunmasının veya ayrışmasının sonucu mu olduğu gibi amiloid veya protein agregasyon alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, özel ekipman olmadan laboratuvarda kolayca gerçekleştirilebilmesidir.Geleneksel SDD-AGE'de kullanılanın ötesinde ek bir ekipman gerekmez. İlk olarak, amiloid üreten HT-29 kolon kanseri hücrelerini 10 santimetrelik bir doku kültürü kabında tohumlayın. Ardından, hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede %5 karbondioksit ile inkübe edin.Hücreler %80 birleşmeye ulaştığında, hücreleri yıkamak için fosfat tamponlu salin kullanın. Daha sonra, hücrelere üç mililitre tripsin ekleyin ve üç dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücreler kültür kabından ayrıldıktan sonra, plakaya 10 mililitre kültür ortamı ekleyin.Ardından, hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik

use-two-dimensional-semi-denaturing-detergent-agarose-gel

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

SDD-YAŞ hücrelerde polimerler gibi amiloid algılama ve karakterizasyonu için yararlı bir tekniktir. Burada, bu tekniğin büyük ölçekli uygulamalarda mükellef kılar bir uyum göstermektedir.

Yarı denatüre Deterjan-Agaroz Jel Elektroforez Amiloid Toplama taraması

Bu video, poliakrilamid jel elektroforezi kullanılarak fare akciğer dokusundan izole edilen heparan sülfatların ayırma prosedürünü göstermektedir.

Poliakrilamid Jel Elektroforezi: Fare Akciğer Dokusundan İzole Edilen Değişen Zincir Uzunluklarına Sahip Heparan Sülfatları Tespit Etmek İçin Analitik Bir Teknik

Bu video, proteinler için denatüre edici bir poliakrilamid bazlı ayırma tekniğini göstermektedir. Bu teknik, proteinlerin moleküler ağırlıklarına göre ön tanımlanmasına yardımcı olur.

Protein Analizi için Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi: Moleküler Ağırlığa Göre Proteinleri Ayırmak ve Görselleştirmek İçin Bir Teknik

Bu video, amiloid liflerinin iki boyutlu yarı denatüre edici deterjan agaroz jel elektroforezi bazlı ayrımını göstermektedir. Teknik, polimorfik amiloid agregatlarını heterojen boyutlarına göre ayırır.

İki Boyutlu Yarı Denatüre Edici Agaroz Jel Elektroforezi: Polimorfik Amiloid Liflerini Boyut Heterojenliğine Göre Ayırmak İçin Bir Teknik

Bu videoda, insan fonksiyonel olmayan hipofiz adenomunun (NFPA) tümör dokularından elde edilen karmaşık bir protein karışımından tek tek proteinleri ayıran iki boyutlu bir jel elektroforezi yöntemi gösteriyoruz. Proteinler, birinci boyutta elektrik yüklerine göre ayrılır ve ikinci boyutta moleküler ağırlıklara göre daha da ayrılır.

İki Boyutlu Poliakrilamid Jel Elektroforezi: Yük ve Moleküler Ağırlığa Dayalı Kompleks Protein Karışımındaki Proteinlerin Analizi İçin Bir Ayırma Tekniği

Bu rapor, sülfatlı glikozaminolikanları (GAG) biyolojik örneklerden izole etme ve arındırma tekniklerini ve yaklaşık boyutlarına yönelik bir poliakrilamid jel elektroforez yaklaşımını açıklar. GAG'ler proteinlerle elektrostatik etkileşim yoluyla doku yapısına ve etki sinyalizasyon süreçlerine katkıda bulunur. GAG polimer uzunluğu, konyak ligandları için bağlayıcı yakınlıklarına katkıda bulunur.

Glikozamid Jel Elektroforez ve Gümüş Boyama ile Glikozaminolikanların Tespiti

Bu protokol, dondurularak kurutulmuş insan iskelet kasından tek lif izolasyonunu ve nokta lekeleme tekniği kullanılarak Miyozin ağır zincir (MHC) izoformuna göre lif tipi sınıflandırmayı gösterir. Tanımlanan MHC I ve II lif örnekleri daha sonra western blotlama kullanılarak protein ekspresyonunda lif tipine özgü farklılıklar için daha fazla analiz edilebilir.

İnsan İskelet Kasının Lif Tipi Tanımlaması

Bu makale, insan hücrelerinin lizatlarından elde edilen dinnamin benzeri GTPase MxA proteininin oligomerik durumunu, denatüre olmayan PAGE ile western blot analizinin bir kombinasyonunu kullanarak değerlendirmek için basit ve hızlı bir protokolü açıklamaktadır.

Denatüre edici olmayan poliakrilamid jel elektroforez kullanılarak insan mxa Çok alt birim protein kompleksleri karakterizasyonu

TRNA (UUU) üretimi ve agaroz jel geciktirme testleri ile TcdA enzimi ile kompleks içinde tRNA (UUU) analizi için bir protokol sunulmuştur.

Analiz için Protein-tRNA Agaroz Jel Retardasyon Testleri<em&gt; K</em<sup&gt; 6</sup&gt; Threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Bu protokol, fonksiyonel mitokondriyal elektron transport zincir komplekslerinin (Cx) IV ve bunların süper komplekslerinin yerli elektroforezi kullanarak, bunların montajı ve yapısı hakkında bilgi vermek üzere ayrılmasını açıklamaktadır. Nativ jel immünoblotlama, in-jel deneylerine tabi tutulabilir ve bireysel kompleksleri daha da karakterize etmek için elektroliz ile saflaştırılabilir.

Mitokondriyal Elektron Nakil Zincirinin Süper Komplekslerinin Yerli Elektroforez, In-Jel Testleri ve Elektroelüsyon ile İncelenmesi

Öğrenin iki boyutlu yarı denaturing agaroz jel elektroforezi kullanarak amiloid benzeri liflerin boyut heterojenliğini doğrulamayı. Bu yöntem, liflerin doğal durumunu incelemek için güvenilir bir laboratuvar tekniği sunar.

İki boyutlu yarı denaturing deterjan özel Jel Elektroforez amiloid veya amiloid benzeri liflerin boyutu heterojen onaylamak için kullanımı (Video) | JoVE Journal

İki boyutlu yarı denaturing deterjan özel Jel Elektroforez amiloid veya amiloid benzeri liflerin boyutu heterojen onaylamak için kullanımı

Daha fazla video keşfet