İki boyutlu yarı denaturing deterjan özel Jel Elektroforez amiloid veya amiloid benzeri liflerin boyutu heterojen onaylamak için kullanımı

Bu iki boyutlu yarı denatüre edici deterjan agaroz jel elektroforezinin genel amacı, geleneksel SDD-AGE sırasında görülen amiloid veya amiloid benzeri liflerin boyut heterojenliğini doğrulamaktır. Bu yöntem, geleneksel SDD-AGE sırasında görülen boyut heterojenliğinin in vivo liflerin doğal durumu mu yoksa jel elektroforezi sırasında protein bozunmasının veya ayrışmasının sonucu mu olduğu gibi amiloid veya protein agregasyon alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, özel ekipman olmadan laboratuvarda kolayca gerçekleştirilebilmesidir.

Geleneksel SDD-AGE'de kullanılanın ötesinde ek bir ekipman gerekmez. İlk olarak, amiloid üreten HT-29 kolon kanseri hücrelerini 10 santimetrelik bir doku kültürü kabında tohumlayın. Ardından, hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede %5 karbondioksit ile inkübe edin.

Hücreler %80 birleşmeye ulaştığında, hücreleri yıkamak için fosfat tamponlu salin kullanın. Daha sonra, hücrelere üç mililitre tripsin ekleyin ve üç dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücreler kültür kabından ayrıldıktan sonra, plakaya 10 mililitre kültür ortamı ekleyin.

Ardından, hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Daha sonra, hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında üç dakika boyunca 1.000 kez g'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, ortamı aspire edin ve hücre peletini beş mililitre kültür ortamında yeniden süspanse edin.

Bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın. Ardından, gece boyunca 37 santigrat derecede iki kültür plakası bırakın. Daha sonra, tedavi olarak kültür kaplarından birine TSZ reaktifleri ekleyin.

Yaklaşık altı saat sonra, hücreleri plastik bir kazıyıcı kullanarak hasat edin. Daha sonra, hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir konik tüpe aktarın ve dört santigrat derecede üç dakika boyunca 1.000 kez g'de santrifüjleyin. Ardından, hücre peletini 10 mililitre buz gibi soğuk fosfat tamponlu tuzlu su ile iki kez yıkayın ve santrifüjleme işlemini tekrarlayın.

Daha sonra, PBS çözeltisini aspire edin ve hücre peletini 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hücre peletine 0.3 mililitre lizis tamponu ekleyin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Yine, dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 20.000 kez g'de santrifüjleyin.

Elde edilen süpernatant, tüm hücre lizatıdır. Süpernata, mikrolitre numune başına 20 mikrolitre üç mikrogram hazırlamak için 4X SDD-AGE tamponu ekleyin. Numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Jeli hazırlamak için, bir cam beherde 200 mililitre TAE tamponuna iki gram agaroz tozu ekleyin. Ardından, agarozu eritmek için beheri bir mikrodalgada ısıtın. Ardından, %0,1'lik bir son konsantrasyona bir mililitre %20 SDS ekleyin.

Daha sonra, sıvı agarozu 15 x 14 santimetrelik bir jel levha üzerine dökün. Hava kabarcıklarını gidermek için bir mililitrelik bir pipet kullanın. Ardından, jelin üzerine 20 oyuklu bir tarak yerleştirin.

Daha sonra, jelin en sağ şeridine yaklaşık 60 mikrogram tam hücre lizatı ekleyin. Çalışan tampon olarak% 0.1 SDS içeren TAE tamponunu kullanarak jeli yaklaşık dört saat boyunca 60 voltta çalıştırın. Jeli ikinci boyutta çalıştırmak için, jeli dikkatlice saat yönünün tersine 90 derece döndürün.

Ardından, jeli yaklaşık dört saat boyunca 60 voltta çalıştırın. 20 x 20 santimetrelik bir kapta 500 mililitre transfer tamponu ekleyin. Kabın hemen yanında, beş santimetre yüksekliğinde bir kağıt havlu yığını hazırlayın.

Ardından, her biri 14 x 15 santimetre boyutlarında iki filtre kağıdını transfer tamponuna batırın ve kağıt havlu yığınının üzerine yerleştirin. Metanol içinde 14 x 15 santimetrelik bir PVDF membranını 30 saniye boyunca etkinleştirin. Aktivasyondan sonra, zarı filtre kağıtlarının üzerine yerleştirin ve tüm kabarcıkları çıkarmak için bir rulo kullanın.

Transferin en önemli kısmı, jel ve zar arasında hava kabarcığı oluşmadığından emin olmaktır. Jeli transfer tamponu ile durulayın ve zarın üzerine yerleştirin. Oluşan baloncukları açın.

Ardından, kağıt havluların transfer tamponu kabına en yakın kenarını kapatmak için plastik bir sargı kullanın. Ardından, 15 x 35 santimetre boyutlarında bir parça filtre kağıdını transfer tamponuna batırın. Filtre kağıdını, bir ucu jelin üstünü kaplayacak ve diğer ucu transfer tamponu kabına gelecek şekilde yerleştirin.

Kabı streç filmle örtün ve gece boyunca oda sıcaklığında bırakın. Ertesi gün, zarı 20 x 20 santimetrelik bir kapta 50 mililitre PBST ile durulayın. Daha sonra, zarın üzerine PBST'de 20 mililitre% 5 süt ekleyin.

Ardından, bloke etmek için zarı oda sıcaklığında oda sıcaklığında 30 dakika bekletin. PBST'de 20 mililitre% 5 süte 10 mikrolitre tavşan anti-MLKL antikoru pipetleyin. Daha sonra antikor karışımını zarın üzerine ekleyin.

Membranı bir gece boyunca dört santigrat derecede bir külbütör üzerinde inkübe edin. Ardından, membranı beş dakika boyunca 20 mililitre PBST ile yıkayın. Bu yıkama beş kez tekrarlanır.

Daha sonra, PBST'deki 20 mililitre% 5 süte dört mikrolitre anti-tavşan-HRP antikoru pipetleyin. Antikoru zarın üzerine ekleyin. Kabı, zarla birlikte külbütör üzerinde iki saat oda sıcaklığında bırakın.

İki saat sonra, membranı her biri beş dakika boyunca 20 mililitre PBST'de beş kez yıkayın. Son olarak, zar üzerine gelişmiş kemilüminesans substratı ekleyin. Ardından, membranı üreticinin talimatlarına göre X-ışını filmine maruz bırakın.

Bu çalışma, tümör nekroz faktörü alfa ile tedavi edilen hücrelerden elde edilen tüm hücre lizatlarında SDS'ye dirençli amiloid benzeri liflerin varlığını göstermek için yapılmıştır. Burada RIPK1 ve RIPK3'ün benzer özdeş amiloid benzeri desenler gösterdiğini göstermektedir. İlginç bir şekilde, MLKL lifleri diğerlerinden farklı bir göç modeli ile heterojen görünmektedir.

Bu görüntü, amiloid veya amiloid benzeri liflerin olası göç modelini göstermektedir. Birinci boyut SDD-AGE'de, amiloid veya amiloid benzeri lifler karakteristik bir yayma sergiler. Bu görüntüde, lifler ikinci çalışmada aynı şekilde göç eder ve zar üzerinde 45 derecede çapraz bir göç modeli sergiler.

Bu, jel çalıştırma işlemi sırasında liflerin bozulmaya veya ayrışmaya uğramadığını gösterir. Aksine, lifler ayrışırsa, diyagonal çizginin altında dikey çizgi vardır, bu da ikinci elektroforez sırasında daha küçük liflerin daha hızlı göçünü gösterir. Bu birinci ve ikinci boyut SD-AGE'nin her ikisi de, MLKL liflerinin SDD-AGE işlemi sırasında ayrışmadığını ve gerçekten de RIPK1 ve RIPK3 liflerinden farklı olduğunu göstermektedir.

Bu görüntüde, MLKL lifleri ilk boyutta karakteristik bir leke göstermektedir. Bununla birlikte, aynı lifler, ikinci boyut SDD-AGE'de dikey çizgi olmadan keskin bir çapraz çizgi gösterir. Bu prosedürü denerken, 45 derecelik bir açıyla keskin bir çizgi sağlamak için voltaj ve çalışma uzunluğu gibi tüm koşulların birinci ve ikinci boyutlar arasında aynı kaldığını hatırlamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, zarın sıyrılması ve diğer antikorlarla yeniden araştırılması gibi diğer yöntemler, lifin başka proteinler içerip içermediği gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, geleneksel SDD-AGE sırasında amiloid veya amiloid benzeri liflerde herhangi bir bozulma veya ayrışma meydana gelmediğini nasıl doğrulayacağınızı iyi anlamış olmalısınız.