Translasyon modifikasyon ve varyant için hızlı ve nicel Yöntem peptidler genleri için eşleme etkin

Bu yazılım protokolünün genel amacı, genomları referans genomlara yönlendirmek ve ortogonal genomik verilerle entegrasyon ve görselleştirmeyi sağlamak için kütle spektrometresi deneylerinden elde edilen kantitatif bilgilerle peptitleri eşleştirmek için PoGo'nun kullanımını göstermektir. Bu araç, kütle spektrometresi proteomik aramaları tarafından oluşturulan peptit listelerine genomik bilgilerin eklenmesine yardımcı olabilir, böylece RNA dizileme verileriyle entegrasyon kolaylaştırılabilir. Bu aracın temel avantajı, kullanımının basit, hızlı olması ve translasyon sonrası modifikasyonlar, kantitasyon ve amino asit varyansı gibi ek bilgileri desteklemesidir.

Başlamak için, bu videoda gösterilen yazılımı, beraberindeki metin protokolünde açıklandığı gibi indirin ve yükleyin. Kurulduktan sonra, PoGo GUI yürütülebilir klasörüne gidin ve PoGo GUI simgesine çift tıklayarak programı başlatın. PoGo yürütülebilir dosyasının yanındaki seç düğmesini kullanın.

Ardından yürütülebilir klasörde ilgili işletim sistemi alt klasörüne gidin ve yürütülebilir PoGo dosyasını seçin. Aç düğmesine tıklayarak seçimini onaylayın. Ardından, seç'e tıklayarak protein dizileri için referans giriş dosyasını seçin.

Veri klasörüne gidin ve çeviri hızlı gün dosyasını seçin. Aç'a tıklayarak seçimini onaylayın. Seç düğmesini kullanarak transkript açıklama dosyasını seçin.

Ardından veri klasörüne gidin, ek açıklama GTF dosyasını seçin ve aç'a tıklayın. Peptit tanımlama dosyasını, peptit dosyalarının yanındaki ekle düğmesini kullanarak ekleyin. Burada, dosyayı desteklenen MZ Tab, MZ Ident ML veya MZ ID biçiminde ya da sekmeyle ayrılmış dört sütunlu biçimde seçin.

Ek olarak, çıktı formatı seçiminde BED NGTF'nin yanındaki onay kutularının işaretini kaldırın. Yalnızca PTM BED ve GCT'yi işaretli bırakın. Ardından, açılır seçimden veriler için uygun türü seçin ve başlat'a tıklayarak eşlemeye başlayın.

İlk olarak, _ptm. yatakla biten PoGo çıktı dosyasını bütünleştirici genomik görüntüleyiciye yükleyin. _noptm.bed ile biten dosyayı da yüklemek için tekrarlayın.

Bu dosya, herhangi bir değişiklik yapılmadan bulunan tüm peptitleri içerir. Parçaları listede istediğiniz konuma sürükleyip bırakarak yeniden sıralayın. Her dosya, dosyanın adı parçayı tanımlayan ayrı parçalar olarak gösterilecektir.

Her parça başlangıçta daraltılmış bir şekilde gösterilir. Bunları genişletmek için, parça adına sağ tıklayın ve diziler de dahil olmak üzere peptitlerin tam bir görünümü için genişletilmiş'i seçin. Şimdi gct ile biten dosyayı yükleyin.

Bu dosya peptit kantitasyon bilgilerini içerir. Daha önce yüklenen dosyalardan farklı olarak, açıklamalı her örnek ayrı bir parça olarak yüklenecektir. Sürükle ve bırak işlemlerini kullanarak örnekleri istediğiniz gibi yeniden düzenleyin.

Açılır menüden bir kromozom seçerek, yakınlaştırmak için bir kromozomun bir bölümünü tıklayıp basılı tutarak veya genomik koordinatları yazarak genom içinde gezinin. PoGo haritalaması, grafiksel kullanıcı arayüzü veya komut satırı arayüzü kullanılarak gerçekleştirilebilir. Protokolün bu bölümünde, değiştirilebilirliği vurgulamak için komut satırı arayüzü kullanılır.

Metin protokolündeki önceki adımlarla elde edilen varyant peptitleri referans genomla eşleştirmek için bir komut istemi açın ve PoGo'nun yürütülebilir klasörüne gidin. Ardından burada gösterilen komutu yazın. Enter tuşuna basarak yürütmeyi onaylayın ve daha fazla ilerlemeden önce yürütmenin bitmesini bekleyin.

Bütünleştirici genomik görüntüleyicide uyumsuzluk olmadan ve uyumsuzlukla eşlenen peptitleri görselleştirin. PoGo grafik kullanıcı arayüzü yazılımında, peptit dosyalarının yanındaki ekle düğmesini kullanarak peptit tanımlama dosyalarını ekleyin ve tek veya birden fazla dosya seçin ve peptit dosyalarının altındaki boş alana sürükleyip bırakın. Ardından, çıktı formatı bölümünde PTM BED, GTF ve GCT'nin yanındaki onay kutularının işaretini kaldırın ve yalnızca BED'yi işaretli bırakın.

Ek olarak, birden çok giriş dosyasını tek bir çıktıda birleştir seçeneğini belirleyin. Bu, giriş dosyalarının tüm peptitlerini birleştiren tek bir çıktı dosyası ile sonuçlanacaktır. Bu seçeneğin işaretsiz bırakılması, programın her giriş dosyası için ayrı ayrı sıralı olarak yürütülmesine neden olur.

Ardından, hızlı gün NGTF dosyalarıyla tutarlı olan açılır menüden veriler için uygun türü seçin. Seçildikten sonra, başlat düğmesine tıklayarak eşlemeyi başlatın. Eşlenmiş peptitlerden bir izleme merkezi oluşturmak için bir terminal penceresi açın ve komut istemine aşağıdaki komutu yazın.

Enter tuşuna basarak yürütmeyi onaylayın. Yürütmenin tamamlanması yalnızca kısa bir süre alacaktır. Bitirdikten sonra, oluşturulan parça hub'ını tüm içeriğiyle birlikte web'den erişilebilir bir FTP sunucusuna veya GitHub'a aktarın.

Bir web tarayıcısında UCSC Genome tarayıcısına gidin ve My Data Track Hubs'ı seçin. Ardından sekmeye tıklayın Benim Hub'larım. İzleme hub'ının URL'sini metin alanına kopyalayın ve ardından hub ekle'ye tıklayarak izleme hub'ını yükleyin.

Son olarak, tarayıcı görünümüne girmek için genom tarayıcısını seçin. Özel parça hub'ı listenin en üstünde gösterilecektir. Birden fazla BED dosyası izleme hub'ı için temel oluşturduysa, dosyaların her biri hub içinde ayrı bir parça olarak temsil edilir.

PoGo ve diğer iki proteogenomik haritalama aracı, genel bellek kullanımları ve analitik çalışma süreleri açısından burada karşılaştırılmıştır. PoGo, hem hız hem de bellek açısından diğer araçlardan önemli ölçüde daha iyi performans gösterir ve peptitlerle ilişkili translasyon sonrası modifikasyonları ve nicel bilgileri genom üzerine haritalayabilir. PoGo, genom içindeki peptit haritalamasının benzersizliği ile ilgili olarak kolay görsel yardım sağlamak için renklendirme seçeneğini kullanır.

Kırmızı renkli eşlemeler, tek bir transkriptin benzersizliğini gösterirken, blok vurguları tek bir gene eşlenir. Gri eşlemeler, birden fazla gen arasında paylaşılan peptitleri gösterir. PoGo'nun PTM BED seçeneği, modifiye edilmiş amino asit kalıntısında kalın bir blok ile modifikasyonun konumunu gösteren farklı türdeki translasyon sonrası modifikasyonları barındırmak için renk kodunu yeniden tanımlar.

Burada gösterilen ve kolorektal kanseri temsil eden proteom verilerinde, her biri tek bir fosforilasyon gösteren sadece iki peptit tanımlanmıştır. Çıktı GCT dosyasındaki bilgiler, peptitler tarafından kapsanan genomik bölgeler için nicel değerler sağlar. Ekleme bağlantıları boyunca uzanan peptitler, bağlanmadan parçalarına ayrılır.

Ekleme hakkında daha kapsamlı bilgi için, çıktı GTF dosyası ayrıca gereklidir. Referans protein dizileri ve ek açıklamalar indirildikten ve ayarlandıktan sonra, dizi uyumsuzluklarına izin verilmediğinde binlerce peptit, beş dakikadan kısa sürede genomik koordinatlara eşlenebilir. PoGo kullanarak peptitleri referans genomlara eşlemeye çalışırken, çevrilmiş protein kodlama transkript dizilerini ve ilişkili transkript açıklamalarını kullanmayı unutmamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, proteomik kütle spektrometresi deneylerinden elde edilen peptitleri ilişkili bilgilerle referans alınan genomlara eşlemek ve bunları görselleştirmek için PoGo ve PoGo GUI'nin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.