Floresans Live-hücre görüntüleme, tam bitkisel hücre döngüsü yavaş büyüyen sosyal bakteri Myxococcus xanthus

Bu yöntem, hücrelerin DNA'larını nasıl kopyaladıkları, nasıl büyüdükleri ve nasıl bölündükleri gibi bakteri hücre biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, canlı bakteri hücrelerinin mikroskop altında en az 24 saat izlenebilmesi ve tekniğin özel ekipman gerektirmemesidir. Bu yöntem Myxococcus xanthus'un büyümesi ve bölünmesi hakkında fikir verebilse de, diğer yavaş büyüyen bakterilere de kolayca uygulanabilir.

Başlamak için, steril bir tüpte antibiyotiklerle desteklenmiş 500 mikrolitre% 1 CTT'de tek bir M.xanthus kolonisini yeniden süspanse edin ve tüm süspansiyonu beş mililitre% 1 CTT içeren 50 mililitrelik bir Erlenmeyer şişesine aktarın. Bir gram agarozu 80 mililitre TPM tamponu ve 20 mililitre %1 CTT ortamı ile karıştırarak %0.2 CTT içeren %1 agaroz mikroskobu solüsyonu hazırlayın. Agaroz eriyene kadar çözeltiyi mikrodalgada pişirin.

Bir Petri kabını yaklaşık 60 mililitre erimiş agaroz ile doldurun ve oda sıcaklığına soğumaya bırakın. Agaroz pedi kullanmadan önce en az 32 dakika boyunca 15 santigrat derecede önceden ısıtın. Ardından, ortasında delik olan plastik veya metal bir çerçeveye steril bir cam lamel yerleştirin, ardından lameli çerçeveye sabitlemek için bant kullanın.

Lamel üzerine 10 ila 20 mikrolitre üstel olarak büyüyen M.xanthus hücresi ekleyin. Hücrelerin referans belirteçleri olarak floresan mikro küreler eklemek için, mikro küreleri 1:100'e seyreltmek için TPM tamponu kullanın. Boncuk süspansiyonunu iyice çalkalayın ve hücrelere beş ila 10 mikrolitre ekleyin.

Büyük, önceden ısıtılmış %1'lik agaroz pedden, yaklaşık olarak kapak fişi büyüklüğünde küçük bir ped kesin ve hücrelerin üzerine yerleştirin. Ardından, buharlaşmayı önlemek ve hücreleri nemli bir ortamda tutmak için pedin üzerine bir örtü fişi yerleştirin. Mikroskopi örneğini 32 santigrat derecede 15 ila 20 dakika inkübe edin, böylece hücrelerin hızlandırılmış mikroskopi kayıtlarından önce agaroz pedinin dibine yapışmasını sağlayın.

Hızlandırılmış mikroskopi yapmak için mikroskobu açın ve mikroskop kontrol yazılımını başlatın. Faz kontrast görüntülerinin yanı sıra yeşil floresan, kırmızı floresan veya sarı floresan proteinlerin görüntülerini elde etmek için doğru objektifi ve doğru aynaları seçin ve filtreleyin. Objektifin merceğine ve 32 santigrat derecede önceden inkübe edilmiş numunenin altına bir damla yüksek kaliteli daldırma yağı ekleyin.

Delik tarafı objektife bakacak şekilde, numunenin bulunduğu metal çerçeveyi mikroskop tablasına yerleştirin, ardından numuneyi tabla tutucusuna güvenli bir şekilde sabitleyin. Sahneyi Z yönünde hedefe yaklaştırarak hücrelere odaklanın. Objektif ve numune üzerindeki yağ temas ettiğinde, sahneyi X/Y yönünde hareket ettirin.

Metamorph yazılımına geçin ve Edinme aracını açın. Setting (Ayar) açılır listesinden Phase Contrast (Faz Kontrastı) öğesini seçin ve Exposure Time (Pozlama Süresi) değerini 100 milisaniye olarak ayarlayın. Canlı Göster'e tıklayın, Hücreyi Odak Düzlemine Getirin ve görüş alanında birden fazla tek hücre görünene kadar sahneyi X/Y yönünde hareket ettirin.

Elde edilen görüntüleri daha sonra hizalamak için görüş alanında en az bir floresan mikro küre olduğundan emin olun. Ardından, mikroskobun birden fazla dalga boyunda ve gerekirse aşama konumlarında görüntü elde etmesine olanak tanıyan hızlandırılmış bir deney ayarlamak için mikroskop kontrol yazılımının Çok Boyutlu Toplama sihirbazını açın. Ana sekmesinde, hızlandırılmış çekimi ve Çoklu Dalga Boylarını etkinleştirin.

Pencerenin sol tarafında ek sekmeler görünecektir. Alınan görüntüleri kaydetmek için bilgisayarın sabit diskinde boş bir klasör seçmek için Kaydetme sekmesine ve Dizin Seç'e tıklayın, ardından ardışık veri kümelerinin öncekilerin üzerine yazmadığından emin olmak için Dosya Varsa Temel Adı Artır'ı etkinleştirin. Deneye, tarihin ve deneyin gerinim adının veya başlığının bulunduğu bir ad verin.

Hızlandırılmış parametreleri ayarlamak için hızlandırılmış çekim sekmesine tıklayın, ardından Zaman Aralığını 20 dakikaya ve Süreyi 24 saate ayarlayın. Zaman noktalarının sayısı otomatik olarak değişecektir. Şimdi, Dalga Boyları sekmesine tıklayın.

Sayıyı değiştirerek her bir zaman noktasında her görüntü için elde edilecek dalga boyu sayısını seçin. Her dalga boyu için ayrı donanım hafızasına alınmış AF konumuna izin ver'i seçin. Üstten İlk Dalga Boyu sekmesine tıklayın.

Illumination (Aydınlatma) açılır listesinde, Phase Contrast (Faz Kontrastı) öğesini seçin. Pozlama için 100 milisaniye'yi seçin ve Al açılır listesinde Her Zaman Noktası'nı seçin. Açılır listeden Hiçbir Zaman'ı seçerek Otomatik Pozlama'yı devre dışı bırakın ve Otomatik Odaklama için açılır listeden Her Alım'ı seçin.

Aşağıdaki parametreleri kullanarak her dalga boyu için pozlamayı gösterildiği gibi ayarlayın. Ardından, birden fazla sahne konumundan görüntü elde etmek için Ana sekmesinde Birden Çok Aşama Konumu'nu etkinleştirin. Sahne Alanı sekmesine tıklayın ve görünüm alanına bakmak için Canlı düğmesine tıklayın.

Görüş alanında bir ROI olana kadar sahneyi X/Y yönünde hareket ettirin. X ve Y koordinatlarını, artı işaretini tıklatarak Sahne Alanı sekmesinde kaydedin. Yeni bir ROI bulunana kadar sahneyi tekrar X/Y yönünde hareket ettirin ve artı işaretine tıklayarak koordinatları tekrar kaydedin.

İstenen bölge sayısı kaydedilene kadar devam edin. Kaydedilmiş farklı X ve Y konumlarına tıklayarak hücrelerin odakta olup olmadığını bir kez daha kontrol edin ve deney boyunca kaydedilen Z konumunu sabit tutmak için AFC basılı tut'a tıklayarak donanım otofokusunu başlatın. Al'a tıklayarak mikroskop kontrol yazılımının Çok Boyutlu Alım sihirbazında hızlandırılmış kaydı başlatın.

Görüntülerin kalitesini en üst düzeye çıkarmak ve gerekirse yeniden odaklamak için hızlandırılmış kayıtlardaki ilk birkaç zaman noktasından sonra hücrelerin hala odakta olup olmadığını kontrol edin. Zaman atlamalı filmler oluşturmak ve görüntü hizalama gerçekleştirmek için görüntü analizi ve işleme yazılımını başlatın. Çok Boyutlu Verileri İncele, Temel Dosya Seç, Dizin Seç'e tıklayarak görüntüleri yığın olarak açın, ardından çok boyutlu verilerin bulunduğu klasörü açın.

Veri kümesini kontrol edin ve Görüntüle'ye tıklayın. Veri seti, Birinci Zaman Noktasından sonuna kadar tek görüntüler olarak gösterilecektir. Bir yığın oluşturmak için dalga boyunu etkinleştirin, ardından yığında olması gereken tüm görüntüleri seçin ve Görüntüleri Yükle'ye tıklayın.

Bu adımı tüm dalga boyları için tekrarlayın ve tamamlanan yığınları kaydedin. Kayma için düzeltilmesi gereken görüntü yığınını etkinleştirin. Uygulamalar, Otomatik Hizalama'yı kullanarak hizalama aracını açın.

Görüntüler için kaynak olarak Yığın'ı ve referans düzlemi olarak İlk Düzlem/Zaman Noktası'nı işaretleyin, ardından Kaynak Yığını düğmesiyle yığını seçin ve Uygula'ya tıklayın. Otomatik hizalama tamamlandığında, hizalanmış yığını kaydedin. MOV veya AVI formatlarında bir film oluşturmak için, Film Yap aracılığıyla Film Yap İşlev Yığınla, Film Yap.

Kaynak Yığını düğmesiyle zaman atlamalı kayıtları seçin, ardından çıktı biçimini, kare hızını, kare sayısını seçin ve Kaydet'i tıklayın. Hareketli DK1622 vahşi tip hücrelerle yapılan bu hızlandırılmış deneyde, 24 saat boyunca her beş dakikada bir faz kontrast görüntüleri elde edildi. Beklendiği gibi, hücreler hareketliydi ve ağırlıklı olarak gruplar halinde hareket ettirildi.

Hareketsiz Delta-mgIA hücreleri ile faz kontrastlı canlı hücre görüntülemede, mikrokoloni oluşumu sırasında tek tek hücrelerin büyümesi ve bölünmesi takip edildi. Görüntüler 24 saat boyunca her beş dakikada bir elde edildiğinde, tek hücreli çözünürlükte 235 artı veya eksi 50 dakikalık bölünme süresini ölçmek mümkün oldu. Uzun süreler boyunca yfp etiketli proteinleri izlerken hücrelerin normal şekilde büyüyüp büyümediğini araştırmak için, ParB-YFP'yi eksprese eden M.xanthus hücreleri izlendi.

ParB-YFP başlangıçta subpolar hücre bölgesinde tek bir küme oluşturdu. Hücre bölünmesinden kısa bir süre önce veya sonra, küme çoğaldı, bir küme eski hücre kutbunda kaldı ve ikincisi yeni hücre kutbuna yer değiştirdi. Bu deneyde, FtsZ-gfp'yi eksprese eden hareketsiz hücreler, hücre bölünmesinin konumunu belirleyen orta hücrede güçlü FtsZ-gfp birikimi gösterdi.

FtsZ-gfp, ağırlıklı olarak daha uzun hücrelerde, orta hücrede bir küme oluşturdu. Hücre bölünmesinden iki saat sonra, FtsZ-gfp yavru hücrelerde orta hücrede birikti. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik Myxococcus xanthus ve diğer yavaş büyüyen bakteriler üzerinde rutin olarak yapılabilir.

Bir bakteri için bu prosedürü ayarlarken, o bakterinin spesifik büyüme gereksinimlerini karşılamak için agar plakasındaki büyüme ortamının bileşimini ayarlamak önemlidir. Herhangi bir bakteri için, fototoksisiteyi önlemek için maruz kalma süresi, ışık yoğunluğu ve görüntüleme frekansı gibi optimal görüntüleme koşullarını belirlemek önemlidir. Ayrıca, floresan etiketli herhangi bir protein için, fototoksisiteyi ve ayrıca fotoağartmayı önlemek için görüntüleme koşullarının ayarlanması gerekir.