Doku özgü miRNA ifade profil oluşturma In Situ hibridizasyon fareyle kalp bölümleri içinde

Bu yöntem, hem protein hem de mikroRNA moleküllerinin göreceli lcalization tespit etmek için araçlar sağlayarak, mikroRNA alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı aynı doku bölümünden hem protein hem de mikroRNA moleküllerini tespit edebiliyor olmasıdır. Bu protokol, kaydırağa monte edilen dokuların rehidrasyonu ile başlar.

Hibritleştirme fırınında 10 dakika boyunca 60 derecede kaydırakları ısıtın. Parafin gözle görülür bir şekilde eriyor olmalı. Daha sonra, 10 dakika boyunca ticari olarak kullanılabilir takas maddesi içeren bir cam Coplin kavanoz slaytlar kuluçka.

Bunu iki kez yap. Daha sonra, dokuları yeniden sulamak için yıkamak için slaytlar aktarın. Bir kez sulu, proteinaz K çalışma çözeltisi dokuları kuluçka 37 derece santigrat dakika boyunca.

Proteinaz K'yi çıkarmak için slaytları 1x PBS'de iki kez yıkayın. Şimdi, dokuları düzeltin. İlk olarak, preparatlar etrafında su itici bir daire çizmek için bir hidrofobik kalem kullanarak slaytlar üzerinde rezervuarlar olun.

Daha sonra, bariyer içinde% 4 PFA çözeltisi 500 mikrolitre uygulayın ve bir duman kaputiçinde slaytlar kuluçka. Fiksatif kaldırmak için, oda sıcaklığında beş dakika iki kez PBS içeren bir Coplin kavanozda slaytlar yıkayın. Daha sonra, 0.13 molar 1-Methylimidazole 10 dakika slaytlar yıkayın.

Oda sıcaklığında duman kaputunda bunu yapın ve bu yıkamayı iki kez yapın. EDC fiksatif ekleyin ve bir saat boyunca bir duman kaputoda sıcaklığında kuluçka. 50-milimolar Tris ile slaytlar durula.

Melezleşmeye hazırlanmak için önce nemli bir oda inşa edin. Bir kutunun altına iki parça filtre veya mendil kağıdı yükleyin ve kağıdı formamid ve 1x SSC karışımıyla ıslayın. Daha sonra, her slayt için önceden ısıtılmış hibridizasyon çözeltisi 200 mikrolitre uygulayın ve 50 santigrat derece bir ila üç saat boyunca slaytların nemlendirilmiş odası kuluçka.

Kuluçkadan sonra, hibridizasyon çözeltisini 250 mikrolitre prob çözeltisi ile değiştirin ve slaytları RNase içermeyen kapak fişi ile kapatın. Kapak kayma altında hava kabarcıkları bindirme önlemek için deneyin. Şimdi, odayı dikkatlice parafilmle kapatın ve slaytları bir gecede sondanın RNA erime sıcaklığının yaklaşık 30 derece altında kuluçkaya yatırın.

Optimizasyon gerekebilir. Doğru kuluçka sıcaklığını ayarlamanın yanı sıra, farklı mikroRNA'lar farklı seviyelerde ifade edilir, bu nedenle en uygun sinyali almak için sonda konsantrasyonu ile ilgili optimizasyon da gerekebilir. Melezlemeden sonra, sıkı yıkAmaları gerçekleştirin.

İlk olarak, 2x SSC 50 derece santigrat beş dakika, ya da kapak fişleri gevşeyene kadar oldu. Daha sonra, oda sıcaklığında 2x SSC iki yıkama gerçekleştirmek, beş dakika boyunca her. Daha sonra, oda sıcaklığında devam ederek, slaytları 0,2x SSC'de beş dakika, PBST'de beş dakika ve son olarak 1x PBS'de beş dakika boyunca yıkayın.

Bu noktada, RNA-RNA melezleri kararlıdır ve RNA-sıkı koşullara artık ihtiyaç duyulmamaktadır. DIG antikor tespiti için, ilk olarak, hidrofobik bariyerler dokunun ve otuz dakika boyunca engelleme çözeltisi 500 mikrolitre uygulayın. Bir nemli odada oda sıcaklığında slaytlar kuluçka.

Daha sonra, engelleme çözeltisini çıkarın ve 500 mikrolitre DIG antikor çözeltisi ile değiştirin. Bir saat boyunca nemli bir odada oda sıcaklığında slaytlar kuluçka. Daha sonra Coplin kavanozlarını kullanarak slaytları PBST'da üç kez yıkama başına beş dakika yıkayın.

Daha sonra, slaytları ön boyama çözeltisinde iki kez beş dakika yıkayın. Ardından, slaytları bir polipropilen slayt posta kavanozuna aktarın ve 20 mililitre AP substrat çözeltisi ekleyin. Şimdi, slaytları 37 derecede 6 ila 24 saat boyunca kuluçkaya yatırın, ışıktan korunun.

AP substratını ilk kullandığınızda reaksiyonu takip etmek önemlidir. İki saatlik aralıklarla, en uygun kuluçka süresi belirlenene kadar bir mikroskop kullanarak slaytlarda renk gelişimini kontrol edin. Fazla AP alt tabakasını çıkarmak için, slaytları ktbt çözeltisinde iki kez yıkama başına beş dakika, ardından pbs'de beş dakika yıkayın.

CTNT antikorlarını tespit etmek için önce dokuları bir saat boyunca kapatın. Daha sonra, 200 mikrolitre cTNT antikor çözeltisi uygulayın ve bir gecede 4 derece nemli bir odada slaytları kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, beş dakika pbs içeren bir Coplin kavanozda slaytlar yıkayın.

Bunu üç kez yap. Daha sonra, anti-tavşan 568 antikor çözeltisi 250 mikrolitre uygulayın ve nemli bir odada oda sıcaklığında bir saat boyunca slaytlar kuluçka. Aşırı sekonder antikorları temizlemek için PBS'de beş dakikalık üç yıkama kullanın.

Daha sonra, istenirse, 250 mikrolitre DAPI çalışma çözeltisi uygulayın ve slaytları ışıktan korunan bir dakika kuluçkaya yatırın. Fazla DAPI lekesini çıkarmak için iki beş dakikalık PBS yıkınve yıkandıktan sonra slaytları monte edin. MicroRNA in-situ hibridizasyon negatif kontrol için şifreli bir microRNA kullanılarak fare kalp bölümlerinde optimize edildi ve pozitif kontrol olarak bir U6 snRNA.

MikroRNA-182'nin kardiyomiyosite özgü ekspresyonu kontrol ve PlGF-aşırı eksprese edici farelerden kalp kesitlerinde değerlendirildi. Fareler bir alfa-MHC promotörü altında plgf transgeni taşıdı, ve artmış anjiyogenez ikincil kardiyak hipertrofi geliştirdi, transgen aktivasyonu altı hafta içinde. Boyama protokolü plGF farelerin kalplerinde mikroRNA-182 artan ifade ortaya koymuştur.

Daha sonra hangi hücre tiplerinin mikroRNA-182'yi ifade ettigini belirlemek için aynı kesitler cTNT için immünosüle edildi. DAPI boyama da kullanıldı. Hem kontrol hem de PlGF fare kalp kesitlerinde mikroRNA-182 cTNT-pozitif kardiyomiyosit hücrelerinin nükleer bölmesinde bulundu.

Bu videoyu izledikten sonra, nasıl mikroRNAS hibridizasyon gerçekleştirmek için iyi bir anlayışa sahip olmalıdır, protein immünboyama takip. Bu yordamı çalışırken, ilk gün boyunca RNaAse içermeyen koşulları korumak için hatırlamak çok önemlidir, tüm adımlar boyunca prop hibridizasyon kadar önde gelen. Bu prosedürü takiben, gerçek zamanlı PCR Batı blot gibi diğer yöntemler gibi sorulara cevap için yapılabilir, farklı dokularda bu özel mikroRNA göreli ifade düzeyleri nelerdir, ya da aynı doku bölümünde bu özel protein.

PFA ve ADC gibi fiksatiflerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu işlemi gerçekleştirirken eldiven ve laboratuvar önlüğü giymenin yanı sıra duman başlıkları kullanan önlemler her zaman alınmalıdır.