Name: Üretim, Kristalleşme ve Yapı Tayini ve C. difficile PPEP-1 mikro-tohumlama ve Çinko-SAD aracılığıyla (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Öğrenin, C. difficile PPEP-1 metaloproteazının yüksek kaliteli kristallerini mikro-tohumlama ve çinko-SAD yöntemleriyle üretmeyi. Bu teknik, yapısal biyolojide ilaç hedefi belirleme çalışmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz sinkrotron veri toplama sırasında destek için İsviçre Işık Kaynağı, Paul-Scherrer-Enstitüsü, Villigen, İsviçre&#39;de beamline X06DA personeli teşekkür ederiz. Biz mükemmel teknik destek için Monika Gompert minnettarız. Proje Köln Üniversitesi tarafından desteklenen ve Alman Araştırma Konseyi INST 216 / 682-1 FUGG hibe edildi. CP Kalkınma Sağlığı ve Hastalıkları Uluslararası Graduate School bir doktora bursu kabul edilmektedir. Bu sonuçlara yol açan bir araştırma hibe sözleşmesi No. 283570 (BioStruct-X) kapsamında Avrupa Topluluğu Yedinci Çerçeve Programı (FP7 / 2007-2013) fon aldı.

<ol><li>Bouza, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+Clostridium+difficile+infection%3A+understanding+the+healthcare+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden.</a> Clin Microbiol Infect. 18 (Suppl 6), 5-12 (2012).</li>
<li>O'Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+infection+caused+by+the+epidemic+BI%2FNAP1%2F027+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain.</a> Gastroenterology. 136 (6), 1913-1924 (2009).</li>
<li>Mitchell, B. G., Gardner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortality+and+Clostridium+difficile+infection%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Resist+Infect+Control%22%5BJournal%5D)">Mortality and Clostridium difficile infection: a review.</a> Antimicrob Resist Infect Control. 1 (1), (2012).</li>
<li>George, W. L., Sutter, V. L., Finegold, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+agent-induced+diarrhea--a+bacterial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial agent-induced diarrhea--a bacterial disease.</a> J Infect Dis. 136 (6), 822-828 (1977).</li>
<li>George, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Clostridium+difficile+as+a+cause+of+pseudomembranous+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Med+J%22%5BJournal%5D)">Identification of Clostridium difficile as a cause of pseudomembranous colitis.</a> Br Med J. 1 (6114), 695(1978).</li>
<li>Bartlett, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Narrative+review%3A+the+new+epidemic+of+Clostridium+difficile-associated+enteric+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Narrative review: the new epidemic of Clostridium difficile-associated enteric disease.</a> Ann Intern Med. 145 (10), 758-764 (2006).</li>
<li>Kelly, C. P., LaMont, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile--more+difficult+than+ever%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile--more difficult than ever.</a> N Engl J Med. 359 (18), 1932-1940 (2008).</li>
<li>Ünal, C. M., Steinert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+therapeutic+strategies+for+Clostridium+difficile+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Ther+Targets%22%5BJournal%5D)">Novel therapeutic strategies for Clostridium difficile infections.</a> Expert Opin Ther Targets. 20 (3), 269-285 (2016).</li>
<li>Kelly, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Monoclonal+Antibody%2C+Bezlotoxumab+Targeting+C.+difficile+Toxin+B+Shows+Efficacy+in+Preventing+Recurrent+C.+difficile+Infection+%28CDI%29+in+Patients+at+High+Risk+of+Recurrence+or+of+CDI-Related+Adverse+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The Monoclonal Antibody, Bezlotoxumab Targeting C. difficile Toxin B Shows Efficacy in Preventing Recurrent C. difficile Infection (CDI) in Patients at High Risk of Recurrence or of CDI-Related Adverse Outcomes.</a> Gastroenterology. 150 (4), S122(2016).</li>
<li>Tsutsumi, L. S., Owusu, Y. B., Hurdle, J. G., Sun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+the+discovery+of+treatments+for+C.+difficile+infection%3A+A+clinical+and+medicinal+chemistry+review%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Progress in the discovery of treatments for C. difficile infection: A clinical and medicinal chemistry review.</a> Curr Top Med Chem. 14 (1), 152-175 (2014).</li>
<li>Hensbergen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+secreted+Pro-Pro+endopeptidase+PPEP-1+%28ZMP1%2FCD2830%29+modulates+adhesion+through+cleavage+of+the+collagen+binding+protein+CD2831%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile secreted Pro-Pro endopeptidase PPEP-1 (ZMP1/CD2830) modulates adhesion through cleavage of the collagen binding protein CD2831.</a> FEBS Lett. 589 (24), 3952-3958 (2015).</li>
<li>Cafardi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+zinc+metalloprotease+through+a+global+analysis+of+Clostridium+difficile+extracellular+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel zinc metalloprotease through a global analysis of Clostridium difficile extracellular proteins.</a> PLoS One. 8 (11), e81306(2013).</li>
<li>Hensbergen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+secreted+metalloprotease+%28CD2830%29+from+Clostridium+difficile+cleaves+specific+proline+sequences+in+LPXTG+cell+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel secreted metalloprotease (CD2830) from Clostridium difficile cleaves specific proline sequences in LPXTG cell surface proteins.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (5), 1231-1244 (2014).</li>
<li>Schacherl, M., Pichlo, C., Neundorf, I., Baumann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Basis+of+Proline-Proline+Peptide+Bond+Specificity+of+the+Metalloprotease+Zmp1+Implicated+in+Motility+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural Basis of Proline-Proline Peptide Bond Specificity of the Metalloprotease Zmp1 Implicated in Motility of Clostridium difficile.</a> Structure. 23 (9), 1632-1642 (2015).</li>
<li>Rawlings, N. D., Waller, M., Barrett, A. J., Bateman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEROPS%3A+the+database+of+proteolytic+enzymes%2C+their+substrates+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors.</a> Nucleic Acids Res. 42 (Release 10.0), D503-D509 (2014).</li>
<li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeds+to+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeds to crystals.</a> J Struct Biol. 142 (1), 66-76 (2003).</li>
<li>Dauter, Z., Dauter, M., Dodson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jolly+SAD%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Jolly SAD.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 58 (Pt 3), 494-506 (2002).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XDS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">XDS.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 2), 125-132 (2010).</li>
<li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENIX%3A+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66, 213-221 (2010).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+PyMOL+Molecular+Graphics+System%22">The PyMOL Molecular Graphics System</a>. , Schrödinger, LLC. (2002).</li>
<li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comput+Chem%22%5BJournal%5D)">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li>
<li>Wang, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+phase+ambiguity+in+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Resolution of phase ambiguity in macromolecular crystallography.</a> Methods Enzymol. 115, 90-112 (1985).</li>
<li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phaser+crystallographic+software%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Phaser crystallographic software.</a> J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li>
<li>Zwart, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+structure+solution+with+the+PHENIX+suite%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated structure solution with the PHENIX suite.</a> Methods Mol Biol. 426, 419-435 (2008).</li>
<li>Zheng, H., Handing, K. B., Zimmerman, M. D., Shabalin, I. G., Almo, S. C., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+crystallography+over+the+past+decade+for+novel+drug+discovery+-+where+are+we+heading+next%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery - where are we heading next?</a> Expert Opin Drug Discov. 10 (9), 975-989 (2015).</li>
<li>Rubino, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+zinc-bound+Zmp1%2C+a+zinc-dependent+metalloprotease+secreted+by+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Inorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of zinc-bound Zmp1, a zinc-dependent metalloprotease secreted by Clostridium difficile.</a> J Biol Inorg Chem. 21 (2), 185-196 (2016).</li>
<li>Carson, M., Johnson, D. H., McDonald, H., Brouillette, C., Delucas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((His-tag+impact+on+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">His-tag impact on structure.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 63 (Pt 3), 295-301 (2007).</li>
<li>Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGasteiger%2C+E+%22The+Proteomics+Protocols+Handbook%22">The Proteomics Protocols Handbook</a>. Walker, J. M. , Humana Press. 571-607 (2005).</li>
<li>Dummler, A., Lawrence, A. M., de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+screening+for+the+detection+of+soluble+fusion+constructs+expressed+in+E.+coli+using+a+modular+set+of+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Simplified screening for the detection of soluble fusion constructs expressed in E. coli using a modular set of vectors.</a> Microb Cell Fact. 4, 34(2005).</li>
<li>Stura, E. A., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+the+streak+seeding+technique+in+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Crys+Growth%22%5BJournal%5D)">Applications of the streak seeding technique in protein crystallization.</a> J Crys Growth. 110 (1), 270-282 (1991).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

X-ışını kristalografisi hala proteinlerin 28 üç boyutlu yakın atomik çözünürlükte yapılarını belirlemek için hızlı ve en doğru yöntemdir. Bununla birlikte, iyi sıralı tek kristallerinin büyümesini gerektirir. Bunlar genellikle almak zordur ve kristal devlet yapaydır. Bununla birlikte, diğer yöntemler ile belirlenmiş olan X-ışını kristalografisi ile tespit edilmiş protein yapılarının karşılaştırılması, özellikle NMR genellikle çok iyi bir uyum göstermektedir. PPEP-1 durumunda, bir NMR yapı S döngüsünün hareket...

Clostridium difficile, hastane antibiyotik ilişkili ishal enfeksiyonlarının 1 en önemli nedenlerinden biridir. Bu Gram-pozitif anaerobik bakteri dışkı-ağız yolu ile kendi spor formu yoluyla bulaşır. Son on yılda, yeni &#39;&#39; salgın &#39;&#39; ya da &#39;&#39; hipervirülan &#39;suşları (/ 027 örneğin BI / NAP1) Kuzey Amerika ve Avrupa&#39;da 2 yeni enfeksiyonların ve ölüm oranlarında ciddi bir artışa neden olmuştur. C. difficile -associated hastalığı (CDAD) yüksek ölüm oranları 3 ile hayatı tehdit eden kolon iltihabıdır. Belirtiler ishal 4&#39;ten psödomembranöz kolit 5 ve genellikle ölümcül zehirli megakolon 6 arasında değişir. Öldürücü suşlar Çok ilaca dirençli ve nüks oranı 7 yüksek olduğu gibi CDAD tedavisi zordur. anı tedavisi antibiyotikler metronidazol, fidaxomicin ya da vankomisin veya repetiti olarak içeren enf tekrarlayan olgular dışkı Mikrobiyota nakli. Yeni tedavi stratejileri acilen 8 ihtiyaç vardır. Bazı ilerlemeler C. difficile toksin B 9 hedefleyen terapötik monoklonal antikor Bezlotoxumab olarak kaydedilir, son zamanlarda başarılı bir faz III klinik çalışmalarda geçti ve FDA ve EMA ile onay için açılmıştı. Ek olarak, yeni antibiyotikler klinik çalışmalarda 10 farklı aşamalarında anda denenmektedir. yeni tedavi hedefleri belirlenmelidir etkili bir tedavi geliştirmek. (; CD2830 / Zmp1; PPEP-1 EC 3.4.24.89), C. difficile proteaz prolin-prolin endopeptidaz-1 keşfedilen bir knock-out suşunda PPEP-1 eksikliği gibi umut verici bir hedef olduğunu, C hastalık oluşturma azalır ., in vivo 11 difficile. PPEP-1 de C-terminalinde iki tane C. difficile adezinleri yaran bir salgılanmış metaloproteaz 12,13 olan 13 ve böylece yapışık Bacter serbestİnsan bağırsak epitelinden ia. Bu nedenle, C. difficile sesil ve hareketli fenotip arasındaki dengeyi koruyarak yer almaktadır. PPEP-1&#39;e karşı seçici inhibitörlerinin geliştirilmesi ve onun yüzeyler üç boyutlu yapının samimi bilgi vazgeçilmez olduğunu tanır anlamak. Bir alt-tabaka peptidi 14 PPEP-1 tek başına veya karmaşık ilk kristal yapışım çözdük. PPEP-1 ilk olarak bilinen proteaz, iki prolin kalıntıları 15 ila seçimli olarak böler peptid bağlar. Bu çift bükülmüş bir şekilde alt-tabakanın bağlanır ve proteaz aktif mevki 14 kapsar S döngüsünde yer alan tortuların uzun bir alifatik-aromatik ağ aracılığıyla stabilize eder. Bu alt-tabaka bağlanma modu PPEP-1&#39;e özgü olan ve bugüne kadar, insan proteazlar bulunamadı. Bu umut verici bir ilaç hedef haline getirir ve çok olası inhibitörlerinin hedef dışı etkileri. Ekran seçici PPEP-1 inh geliştirmek veibitors gelecek saf ve tek dağılımlı PPEP-1 proteininin büyük bir miktarı gereklidir. Bundan başka, tespit edilmesi gerekir PPEP-1 ilk önleyicileri, ko-kristal yapıları bağlanmasının modunu belirler. Bizim ellerde PPEP-1 sürekli iç içe gelişmiş kristaller üretir. Böylece PPEP-1 tek sapması kalitede kristaller üretmek için bir optimizasyon yöntemi geliştirmişlerdir. Bu protokolde, ayrıntılı PPEP-1 14 üretimi, saflaştırma, kristalleştirme ve Yapı çözümü tarif etmektedir. Bu salgılama sinyal dizisi, saflaştırma işareti kaldırılması ile afinite kromatografisi ve boyut çıkarma kromatografisine eksik PPEP-1 varyantın Escherichia coli hücre içi ifade kullanmak, çinko tek dalga boyu anormal dağılma vasıtasıyla bir optimizasyon ekran ve yapı belirlenmesi halinde 16 mikro-tohumlama ardından (çinko-SAD) 17. Bu protokol, (diğer proteinlerin üretimi ve yapı tayini için uyarlanabilir, örneğin &lt;/ Em&gt; metaloproteazlar) ile iç içe gelişmiş kristallerinin üretilmesi proteinler için, özellikle de. İstek üzerine, yapının DNA (pET28a-USES-rPPEP-1) ve difraksiyon verileri, eğitim amacıyla temin edilebilir.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Genler / Vektörler / hücre suşları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET28a vektörü</td><td>Merck-Millipore</td><td>69864</td><td>Trombin bölünebilir N-terminal His-tag</td></tr><tr><td>E. coli< > suşu BL21 (DE3) Star</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C601003</td> PPEP-1'in (CD630_28300) <td>RNase H eksikliği</td></tr> kodonu <tr><td>için optimize edilmiş gen (E. coli için)</td><td>Geneart (Thermo Fisher Scientific)</td> <td>özel</td><td>amino asitler 27-220</td></tr> <tr><td>< güçlü > İsim< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Şirket< güçlü ></td> <td>< güçlü > Katalog Numarası < / güçlü ></td> <td>< güçlü > Yorumlar< / güçlü</td></tr> <tr><td>> < güçlü > Kimyasallar< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Maya herhangi</td><td>bir</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripton</td><td></td> özü<td></td><td></td></tr><tr><td>Köpük Önleyici B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5757</td><td>sulu-silikon emülsiyonu</td></tr><tr><td>Agar</td><td>herhangi bir</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td>herhangi bir</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>AppliChem</td><td>A1008</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>AppliChem</td><td>A1087</td><td>Tampon sınıfı</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>herhangi bir</td><td></td><td>Tampon sınıfı</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>AppliChem</td><td>A1073</td><td>Tampon sınıfı</td></tr><tr><td>Trombin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum fosfat dibazik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215996</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol %</td><td></td><td></td>100 <td>en saf sınıf</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Sıvı kristallerin</td><td>depolanması ve kriyo soğutulması için</td> <td>nitrojen</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>strong<>Ekipman (genel)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shake inkübatörü</td><td>herhangi biri</td><td></td><td>20 °C sıcaklık sağlar &deg; C - 37 derece > C</td></tr><tr><td>Züccaciye,</td><td>herhangi bir</td><td></td><td>şaşkın Erlenmeyer şişesi (50 ml - 2.8 L)</td></tr> <tr><td>Büyük kültür hacimleri için santrifüj</td>, <td>12 L'ye kadar olan hacimleri işlemek için</td><td>herhangi bir</td><td></td> santrifüj</tr>, <tr><td>Sonicator, Vibra-Cell VCX500</td>, <td>Sonics</td><td>SO-VCX500</td><td>veya başka herhangi bir sonikatör / hücre bozucu</td></tr>, <tr><td>Ultrasantrifüj,</td><td>150.000 x g'ye</td><td></td> kadar hız sağlayan herhangi bir <td></td> santrifüj</tr><tr><td>NiNTA Superflow reçine</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boş Cam Econo-Column</td><td>Bio-Rad</td><td>7371007</td><td>veya başka herhangi bir boş cam veya plastik kolon</td></tr><tr><td>Boyut dışlama kromatografi sütunu HiLoad Superdex 200 16/600</td><td>GE Sağlık</td><td>Hizmetleri 28989335</td><td></td></tr><tr><td>Kromatografi sistemi ve AUML; kta Arıtıcı</td>, <td>GE Healthcare</td><td>28406264</td><td>veya başka herhangi bir kromatografi sistemi</td></tr>, <tr><td>Diyaliz tüpü, Spectra/Por 3</td>, <td>Spectrum Labs</td><td>132724</td><td></td></tr><tr><td>Diyaliz tüpü kapakları</td>, <td>Spectrum Labs</td><td>132738</td><td></td></tr>, <tr><td>Ultrafiltrasyon üniteleri (yoğunlaştırıcılar), 10.000 NWCO</td>, <td>herhangi</td> bir <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>UV-Vis spektrofotometresi</td></tr><tr><td>< güçlü > İsim< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Şirket< / güçlü</td> <td>> < güçlü > Katalog Numarası< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Yorumlar< / güçlü ></td></tr> <tr><td>< güçlü > Ekipman (kristalografi) < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Düşük hacimli pipet 0.1-10 ve mikro; l</td><td>herhangi bir</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pozitif deplasmanlı pipet Microman M10</td><td>Gilson</td><td>F148501</td><td></td></tr><tr><td>Kristalizasyon robotu</td><td></td>, üç protein kuyusu TTP 4150-05810 veya başka herhangi bir 96 kuyulu kristalizasyon plakası olan herhangi bir <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>96 oyuklu kristalizasyon plakası TTP</td> <td>IQ</td> ></tr><tr><td>24 kuyulu CombiClover Junior Plate</td><td>Jena Bioscience</td><td>EB-CJR</td><td></td></tr><tr><td>Kristal Berraklığında Sızdırmazlık Bandı</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-511</td><td></td></tr><tr><td>Silikonize Cam Kapak Slaytları</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-225</td><td></td></tr><tr><td>Ticari kristalizasyon ekranları: SaltRx, İndeks, PEG/İyon, Crystal</td><td>Hampton Research</td><td>çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>Ticari kristalizasyon ekranları: Sihirbaz, PACT++, JCSG++Jena</td> <td>Bioscience</td><td>çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>JBS Tohum Boncukları</td><td>Jena Bioscience</td><td>CO-501</td><td></td></tr><tr><td>CrystalCap SPINE HT (naylon halkalar)</td><td>Hampton Research</td><td>çeşitli</td><td>döngü boyutları 0,025 mm - 0,5 mm</td></tr><tr><td>CrystalCap Flakon</td><td>Araştırma</td><td>HR4-904</td><td></td></tr><tr><td>Kriyojenik Köpük Dewar 800 ml</td><td>Hampton Araştırma</td><td>HR4-673</td><td></td></tr><tr><td>Kriyojenik Köpük Dewar 2 L</td><td>Hampton Araştırma</td><td>HR4-675</td><td></td></tr><tr><td>Flakon Kelepçesi, Düz</td><td>Hampton Araştırma</td><td>HR4-670</td><td></td></tr><tr><td>Kristal Değnek Manyetik, Düz</td><td>Hampton Araştırma</td><td>HR4-729</td><td></td></tr><tr><td>CryoCane 6 Flakon Tutucu</td><td>Hampton Araştırma</td><td>HR4-711</td><td></td></tr><tr><td>CryoSleeve</td><td>Hampton Araştırma</td><td>HR4-708</td><td></td></tr><tr><td>Kriyo Kamışı Renk Kodlayıcı - Beyaz</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-713</td><td></td></tr><tr><td>Neşter</td><td>herhangi</td><td></td><td></td></tr> bir <tr><td>Düz mikrokuvvet</td><td>herhangi</td><td></td> bir <td>sızdırmazlık bandının manipülasyonu için. etc.</td></tr><tr><td>Akupunktur iğnesi</td><td>herhangi bir</td> <td>eczaneden <</td><td></td>em></tr><tr><td>Stereo mikroskop</td><td>herhangi</td><td></td><td>kristalizasyon plakalarının ve kristal montajının incelenmesi için, 160X'e kadar büyütme</td></tr></tbody></table>

Üretim, kristalleşme ve yapı tayini ve<em&gt; c. difficile</em&gt; ppep-1 mikro-tohumlama ve Çinko-sad aracılığıyla

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

İnsan sağlığı için büyük bir tehdit olan Clostridium difficile enfeksiyonlarını tedavi etmek için yeni tedavilere ihtiyaç var. C. difficile metalloprotaz PPEP-1, patojenin virülansını azaltmak için gelecekteki inhibitörlerin geliştirilmesi için bir hedeftir. Biyofiziksel ve yapısal karakterizasyonun yanı sıra inhibitör taraması yapmak için büyük miktarlarda saf ve aktif proteine ihtiyaç duyulacaktır. PPEP-1'in verimli üretimi ve saflaştırılması için, kristalleşme ve yapı tayini için yeterli miktarda ve saflıkta protein sağlayan ekspresyon konakçısı olarak E. coli'nin kullanılmasıyla bir protokol geliştirdik. Ek olarak, mikro tohumlama kullanılarak, yüksek oranda iç içe geçmiş PPEP-1 kristalleri, X-ışını kırınım analizi için uygun iyi düzenlenmiş kristallere büyütülebilir. Yöntemler ayrıca diğer rekombinant proteinleri üretmek ve iç içe geçmiş kristaller üreten diğer proteinlerin yapılarını incelemek için de kullanılabilir.

rPPEP-1, E. coli BL21 (DE3) Yıldız (Şekil 1C) en yüksek verimle çeşitli E.coli suşları aşırı eksprese edilir. İlk Ninta afinite kromatografi basamağından sonra, 6xHis-Tag başarılı protein çoğundan yanlabilir ve ikinci Ninta aşamada, düzenlenmemiş protein tam trombin sindirilmiş protein (Şekil 1D) ayrılabilir. Ara sıra muhtemelen dimerik türler (Şekil 2A) &#39;e uygun önü ile, monomer olarak bir S200 16/600 kolonu etiket...

Prolin-prolin endopeptidaz-1 (PPEP-1), insan patojeni Clostridium difficile'den salgılanan bir metalloprotaz ve umut verici ilaç hedefidir. Burada, bu proteinin üretimi ve yapısının belirlenmesi için gerekli tüm yöntemleri açıklıyoruz.

Üretim, Kristalleşme ve Yapı Tayini ve<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 mikro-tohumlama ve Çinko-SAD aracılığıyla

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

Bu prosedürün genel amacı, rekombinant prolin prolin, endopeptidaz-1 veya rPPEP-1 proteininin tek kafes kırınım kalitesi kristallerini verimli bir şekilde büyütmektir. Bu yöntem olmadan, rPPEP-1 anında xray kırınım analizi için uygun olmayan yüksek oranda iç içe geçmiş kristaller üretir. Bu tekniğin ana avantajı, rPPEP-1'in yapısal tayini için çok sayıda iyi düzenlenmiş ve iyi kırınım yapan kristallerin kısa sürede ve sınırlı malzeme girdisi ile üretilebilmesidir.Bu prosedür, mikroşehir yöntemini kullanır ve rPPEP-1'in yanı sıra substrat peptit komplekslerinin her başarılı ilk kristalizasyon koşulu için uyarlanabilir. Bu yöntem, iç içe geçmiş kristaller veren hemen hemen her proteinin iyi düzenlenmiş kristallerini üretmek için uyarlanabilir. Ayrıca çapraz tohumlama deneylerinde, protein varyansında veya küçük moleküllerle kokristalizasyon deneylerinde de kullanılabilir.Kristalizasyon yöntemlerinin işlenmesinin görsel olarak gösterilmesi çok önemlidir, çünkü küçük değişiklikler bile kristallerin kırınım kalitesi üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Piyasada bulunan standart ekranlar ve bir kristalizasyon robotu kullanarak oturarak damla formatında kristalizasyon denemeleri ger

production-crystallization-structure-determination-c-difficile-ppep-1

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Burada lipidik mesophases membran proteinlerinin kristalizasyon denemeleri elle kurmak için Caffrey Membran Yapısal ve Fonksiyonel Biyoloji Grubu uygulanan prosedür açıklanmıştır.

Lipidik Mesophases kullanarak Yapı Tayini için Membran Proteinleri Kristalize

Yapı-esaslı ecza tasarımı ilaç gelişmesinde önemli bir rol oynar. Paralel olarak birden çok hedef edinerek büyük ölçüde kurşun keşfi için başarı şansını artırır. Aşağıdaki makale Enfeksiyon Hastalıkları için Seattle Yapısal Genomik Merkezi PB2 influenza A alt birimi gen-için-yapı tayini için bir çoklu hedef yaklaşım kullanır nasıl vurgulamaktadır.

Grip Polimeraz Gen-to-yapı belirlenmesi PB2 alt birimi için çoklu hedef Paralel İşleme Yaklaşımı

Kaynak: Figueroa, D.M., et.al. Antimikrobiyal peptit lokalizasyonunu karakterize etmek için bakteriyel sferoplastların ve protoplastların üretimi ve görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2018)Bu video, önce filamentasyonu indüklemek için hücre bölünmesini inhibe ederek, ardından hücre duvarının enzimatik sindirimini izleyerek Escherichia coli sferoplastlarının üretimini göstermektedir. İşlem, mikroskobik gözlem için uygun sferoplast oluşumunu ve stabilitesini sağlamak için bir şelatlama maddesi,...

E. coli Sferoplastların Hazırlanması

Membran-gömülü protein etki arasındaki etkileşimler biyofiziksel ve biyokimyasal çalışmalarda uygun çalışma malzemesi elde edilir ilki birçok teknik sorunlarla karşı karşıya. Bu makale, çözelti nükleer manyetik rezonans (NMR) ve diğer analitik uygulamalar tarafından yapısal analizi için uygun olan disülfid stabilize transmembran peptid komplekslerini üretme ve arıtma için bir protokol açıklanmaktadır.

Yapısal Çalışmaları üretimi disülfid stabilize Transmembran Peptit Kompleksi

β namlulu dış zar proteinleri (OMP'ler), Gram-negatif bakterilerin, mitokondrilerin ve kloroplastların dış zarları içinde birçok işleve hizmet eder. Burada, X-ışını kristalografisi veya NMR spektroskopisi ile yapı belirleme için yeterli miktarlarda β namlulu OMP'lerin üretimi için protokoller sunarak yapısal çalışmalarda bilinen bir darboğazı hafifletmeyi umuyoruz.

β-varil Dış Membran Proteinleri Yapı Tayini Doğru - Yapıların itibaren Crystals

Karbonhidrat substrat bağlayıcı protein geniş bir biyokimyasal ve yapısal karakterizasyon Streptococcus pneumoniae gerçekleştirmek için akıcı bir protokol sunulmuştur.

Karbonhidrat taşıma substrat-bağlayıcı-protein SP0092 biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu

Burada Ayagin Gram-negatif Escherichia coli (e.coli) üretmek için bir protokol mevcut spheroplasts ve gram-pozitif Bacillus megaterium (B. megaterium) önceki açıkça görselleştirmek ve hızla karakterize peptid-bakteri etkileşimler. Bu yerelleştirme ve peptidler translocating membran tanımlamak için sistematik bir yöntem sağlar.

Üretim ve bakteriyel Spheroplasts ve önceki antimikrobiyal peptid yerelleştirme karakterize etmek için görselleştirme

NEMO'nun IKK-bağlayıcı alanının x-ışını kristalografisi ile yapı tayinine ilişkin protokolleri açıklıyoruz. Bu yöntemler arasında protein ekspresyonu, saflaştırma ve karakterizasyonunun yanı sıra başarılı kristal optimizasyonu ve proteinin sınırsız formunda yapı tespiti stratejileri yer almaktadır.

NEMO'nun IKK bağlayıcı alanının üretimi, kristalizasyonu ve Yapı Tayini

Bu protokol, yapısal düzeyde bir M42 aminopeptidaz olan TmPep1050'nin dimer-dodecamer geçişini incelemek için geliştirilmiştir. Protein arınması ile X-ışını veri işlemeye kadar basit bir boru hattıdır. Crystallogenezis, veri seti indeksasyonu ve moleküler replasman çalışma bir olgu ile vurgulanmıştır, TmPep1050H60A H307A varyantı.

X-Ray Kristalografi Thermotoga maritima M42 Aminopeptidaz TmPep1050 Oligomerik Devlet Geçiş Çalışma

Karşı difüzyon yöntemini kullanarak bir enzimin kristalleşmesini, ıslatarak kristallere bir substratın girmesini ve oda sıcaklığında çipin içindeki kristallerin seri analizi ile enzim:substrat kompleksinin 3D yapısının belirlenmesini sağlayan çok yönlü bir mikroakışkan cihaz tarif edilir.

Çok Yönlü Bir Mikroakışkan Çipte Seri Kristalografi ile Bir Enzim:Substrat Kompleksinin Kristalizasyonu ve Yapısal Belirlenmesi

CryoEM kullanılarak makromoleküler komplekslerin yapı tespiti, belirli protein ve kompleks sınıfları için rutin hale gelmiştir. Burada, bu işlem hattı özetlenmiştir (numune hazırlama, tarama, veri toplama ve işleme) ve okuyucular daha zorlu numuneler durumunda değiştirilebilecek daha ayrıntılı kaynaklara ve değişkenlere yönlendirilir.

Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskopisi: Numuneden Yapıya

Öğrenin, C. difficile PPEP-1 metaloproteazının yüksek kaliteli kristallerini mikro-tohumlama ve çinko-SAD yöntemleriyle üretmeyi. Bu teknik, yapısal biyolojide ilaç hedefi belirleme çalışmalarına katkı sağlar.

Üretim, Kristalleşme ve Yapı Tayini ve

Daha fazla video keşfet