Name: Üretim, Kristalleşme ve Yapı Tayini ve C. difficile PPEP-1 mikro-tohumlama ve Çinko-SAD aracılığıyla (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Öğrenin, C. difficile PPEP-1 metaloproteazının yüksek kaliteli kristallerini mikro-tohumlama ve çinko-SAD yöntemleriyle üretmeyi. Bu teknik, yapısal biyolojide ilaç hedefi belirleme çalışmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz sinkrotron veri toplama sırasında destek için İsviçre Işık Kaynağı, Paul-Scherrer-Enstitüsü, Villigen, İsviçre&#39;de beamline X06DA personeli teşekkür ederiz. Biz mükemmel teknik destek için Monika Gompert minnettarız. Proje Köln Üniversitesi tarafından desteklenen ve Alman Araştırma Konseyi INST 216 / 682-1 FUGG hibe edildi. CP Kalkınma Sağlığı ve Hastalıkları Uluslararası Graduate School bir doktora bursu kabul edilmektedir. Bu sonuçlara yol açan bir araştırma hibe sözleşmesi No. 283570 (BioStruct-X) kapsamında Avrupa Topluluğu Yedinci Çerçeve Programı (FP7 / 2007-2013) fon aldı.

<ol><li>Bouza, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+Clostridium+difficile+infection%3A+understanding+the+healthcare+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden.</a> Clin Microbiol Infect. 18 (Suppl 6), 5-12 (2012).</li>
<li>O'Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+infection+caused+by+the+epidemic+BI%2FNAP1%2F027+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain.</a> Gastroenterology. 136 (6), 1913-1924 (2009).</li>
<li>Mitchell, B. G., Gardner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortality+and+Clostridium+difficile+infection%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Resist+Infect+Control%22%5BJournal%5D)">Mortality and Clostridium difficile infection: a review.</a> Antimicrob Resist Infect Control. 1 (1), (2012).</li>
<li>George, W. L., Sutter, V. L., Finegold, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+agent-induced+diarrhea--a+bacterial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial agent-induced diarrhea--a bacterial disease.</a> J Infect Dis. 136 (6), 822-828 (1977).</li>
<li>George, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Clostridium+difficile+as+a+cause+of+pseudomembranous+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Med+J%22%5BJournal%5D)">Identification of Clostridium difficile as a cause of pseudomembranous colitis.</a> Br Med J. 1 (6114), 695(1978).</li>
<li>Bartlett, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Narrative+review%3A+the+new+epidemic+of+Clostridium+difficile-associated+enteric+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Narrative review: the new epidemic of Clostridium difficile-associated enteric disease.</a> Ann Intern Med. 145 (10), 758-764 (2006).</li>
<li>Kelly, C. P., LaMont, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile--more+difficult+than+ever%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile--more difficult than ever.</a> N Engl J Med. 359 (18), 1932-1940 (2008).</li>
<li>Ünal, C. M., Steinert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+therapeutic+strategies+for+Clostridium+difficile+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Ther+Targets%22%5BJournal%5D)">Novel therapeutic strategies for Clostridium difficile infections.</a> Expert Opin Ther Targets. 20 (3), 269-285 (2016).</li>
<li>Kelly, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Monoclonal+Antibody%2C+Bezlotoxumab+Targeting+C.+difficile+Toxin+B+Shows+Efficacy+in+Preventing+Recurrent+C.+difficile+Infection+%28CDI%29+in+Patients+at+High+Risk+of+Recurrence+or+of+CDI-Related+Adverse+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The Monoclonal Antibody, Bezlotoxumab Targeting C. difficile Toxin B Shows Efficacy in Preventing Recurrent C. difficile Infection (CDI) in Patients at High Risk of Recurrence or of CDI-Related Adverse Outcomes.</a> Gastroenterology. 150 (4), S122(2016).</li>
<li>Tsutsumi, L. S., Owusu, Y. B., Hurdle, J. G., Sun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+the+discovery+of+treatments+for+C.+difficile+infection%3A+A+clinical+and+medicinal+chemistry+review%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Progress in the discovery of treatments for C. difficile infection: A clinical and medicinal chemistry review.</a> Curr Top Med Chem. 14 (1), 152-175 (2014).</li>
<li>Hensbergen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+secreted+Pro-Pro+endopeptidase+PPEP-1+%28ZMP1%2FCD2830%29+modulates+adhesion+through+cleavage+of+the+collagen+binding+protein+CD2831%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile secreted Pro-Pro endopeptidase PPEP-1 (ZMP1/CD2830) modulates adhesion through cleavage of the collagen binding protein CD2831.</a> FEBS Lett. 589 (24), 3952-3958 (2015).</li>
<li>Cafardi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+zinc+metalloprotease+through+a+global+analysis+of+Clostridium+difficile+extracellular+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel zinc metalloprotease through a global analysis of Clostridium difficile extracellular proteins.</a> PLoS One. 8 (11), e81306(2013).</li>
<li>Hensbergen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+secreted+metalloprotease+%28CD2830%29+from+Clostridium+difficile+cleaves+specific+proline+sequences+in+LPXTG+cell+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel secreted metalloprotease (CD2830) from Clostridium difficile cleaves specific proline sequences in LPXTG cell surface proteins.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (5), 1231-1244 (2014).</li>
<li>Schacherl, M., Pichlo, C., Neundorf, I., Baumann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Basis+of+Proline-Proline+Peptide+Bond+Specificity+of+the+Metalloprotease+Zmp1+Implicated+in+Motility+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural Basis of Proline-Proline Peptide Bond Specificity of the Metalloprotease Zmp1 Implicated in Motility of Clostridium difficile.</a> Structure. 23 (9), 1632-1642 (2015).</li>
<li>Rawlings, N. D., Waller, M., Barrett, A. J., Bateman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEROPS%3A+the+database+of+proteolytic+enzymes%2C+their+substrates+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors.</a> Nucleic Acids Res. 42 (Release 10.0), D503-D509 (2014).</li>
<li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeds+to+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeds to crystals.</a> J Struct Biol. 142 (1), 66-76 (2003).</li>
<li>Dauter, Z., Dauter, M., Dodson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jolly+SAD%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Jolly SAD.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 58 (Pt 3), 494-506 (2002).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XDS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">XDS.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 2), 125-132 (2010).</li>
<li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENIX%3A+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66, 213-221 (2010).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+PyMOL+Molecular+Graphics+System%22">The PyMOL Molecular Graphics System</a>. , Schrödinger, LLC. (2002).</li>
<li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comput+Chem%22%5BJournal%5D)">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li>
<li>Wang, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+phase+ambiguity+in+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Resolution of phase ambiguity in macromolecular crystallography.</a> Methods Enzymol. 115, 90-112 (1985).</li>
<li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phaser+crystallographic+software%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Phaser crystallographic software.</a> J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li>
<li>Zwart, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+structure+solution+with+the+PHENIX+suite%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated structure solution with the PHENIX suite.</a> Methods Mol Biol. 426, 419-435 (2008).</li>
<li>Zheng, H., Handing, K. B., Zimmerman, M. D., Shabalin, I. G., Almo, S. C., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+crystallography+over+the+past+decade+for+novel+drug+discovery+-+where+are+we+heading+next%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery - where are we heading next?</a> Expert Opin Drug Discov. 10 (9), 975-989 (2015).</li>
<li>Rubino, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+zinc-bound+Zmp1%2C+a+zinc-dependent+metalloprotease+secreted+by+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Inorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of zinc-bound Zmp1, a zinc-dependent metalloprotease secreted by Clostridium difficile.</a> J Biol Inorg Chem. 21 (2), 185-196 (2016).</li>
<li>Carson, M., Johnson, D. H., McDonald, H., Brouillette, C., Delucas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((His-tag+impact+on+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">His-tag impact on structure.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 63 (Pt 3), 295-301 (2007).</li>
<li>Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGasteiger%2C+E+%22The+Proteomics+Protocols+Handbook%22">The Proteomics Protocols Handbook</a>. Walker, J. M. , Humana Press. 571-607 (2005).</li>
<li>Dummler, A., Lawrence, A. M., de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+screening+for+the+detection+of+soluble+fusion+constructs+expressed+in+E.+coli+using+a+modular+set+of+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Simplified screening for the detection of soluble fusion constructs expressed in E. coli using a modular set of vectors.</a> Microb Cell Fact. 4, 34(2005).</li>
<li>Stura, E. A., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+the+streak+seeding+technique+in+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Crys+Growth%22%5BJournal%5D)">Applications of the streak seeding technique in protein crystallization.</a> J Crys Growth. 110 (1), 270-282 (1991).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

X-ışını kristalografisi hala proteinlerin 28 üç boyutlu yakın atomik çözünürlükte yapılarını belirlemek için hızlı ve en doğru yöntemdir. Bununla birlikte, iyi sıralı tek kristallerinin büyümesini gerektirir. Bunlar genellikle almak zordur ve kristal devlet yapaydır. Bununla birlikte, diğer yöntemler ile belirlenmiş olan X-ışını kristalografisi ile tespit edilmiş protein yapılarının karşılaştırılması, özellikle NMR genellikle çok iyi bir uyum göstermektedir. PPEP-1 durumunda, bir NMR yapı S döngüsünün hareket...

Clostridium difficile, hastane antibiyotik ilişkili ishal enfeksiyonlarının 1 en önemli nedenlerinden biridir. Bu Gram-pozitif anaerobik bakteri dışkı-ağız yolu ile kendi spor formu yoluyla bulaşır. Son on yılda, yeni &#39;&#39; salgın &#39;&#39; ya da &#39;&#39; hipervirülan &#39;suşları (/ 027 örneğin BI / NAP1) Kuzey Amerika ve Avrupa&#39;da 2 yeni enfeksiyonların ve ölüm oranlarında ciddi bir artışa neden olmuştur. C. difficile -associated hastalığı (CDAD) yüksek ölüm oranları 3 ile hayatı tehdit eden kolon iltihabıdır. Belirtiler ishal 4&#39;ten psödomembranöz kolit 5 ve genellikle ölümcül zehirli megakolon 6 arasında değişir. Öldürücü suşlar Çok ilaca dirençli ve nüks oranı 7 yüksek olduğu gibi CDAD tedavisi zordur. anı tedavisi antibiyotikler metronidazol, fidaxomicin ya da vankomisin veya repetiti olarak içeren enf tekrarlayan olgular dışkı Mikrobiyota nakli. Yeni tedavi stratejileri acilen 8 ihtiyaç vardır. Bazı ilerlemeler C. difficile toksin B 9 hedefleyen terapötik monoklonal antikor Bezlotoxumab olarak kaydedilir, son zamanlarda başarılı bir faz III klinik çalışmalarda geçti ve FDA ve EMA ile onay için açılmıştı. Ek olarak, yeni antibiyotikler klinik çalışmalarda 10 farklı aşamalarında anda denenmektedir. yeni tedavi hedefleri belirlenmelidir etkili bir tedavi geliştirmek. (; CD2830 / Zmp1; PPEP-1 EC 3.4.24.89), C. difficile proteaz prolin-prolin endopeptidaz-1 keşfedilen bir knock-out suşunda PPEP-1 eksikliği gibi umut verici bir hedef olduğunu, C hastalık oluşturma azalır ., in vivo 11 difficile. PPEP-1 de C-terminalinde iki tane C. difficile adezinleri yaran bir salgılanmış metaloproteaz 12,13 olan 13 ve böylece yapışık Bacter serbestİnsan bağırsak epitelinden ia. Bu nedenle, C. difficile sesil ve hareketli fenotip arasındaki dengeyi koruyarak yer almaktadır. PPEP-1&#39;e karşı seçici inhibitörlerinin geliştirilmesi ve onun yüzeyler üç boyutlu yapının samimi bilgi vazgeçilmez olduğunu tanır anlamak. Bir alt-tabaka peptidi 14 PPEP-1 tek başına veya karmaşık ilk kristal yapışım çözdük. PPEP-1 ilk olarak bilinen proteaz, iki prolin kalıntıları 15 ila seçimli olarak böler peptid bağlar. Bu çift bükülmüş bir şekilde alt-tabakanın bağlanır ve proteaz aktif mevki 14 kapsar S döngüsünde yer alan tortuların uzun bir alifatik-aromatik ağ aracılığıyla stabilize eder. Bu alt-tabaka bağlanma modu PPEP-1&#39;e özgü olan ve bugüne kadar, insan proteazlar bulunamadı. Bu umut verici bir ilaç hedef haline getirir ve çok olası inhibitörlerinin hedef dışı etkileri. Ekran seçici PPEP-1 inh geliştirmek veibitors gelecek saf ve tek dağılımlı PPEP-1 proteininin büyük bir miktarı gereklidir. Bundan başka, tespit edilmesi gerekir PPEP-1 ilk önleyicileri, ko-kristal yapıları bağlanmasının modunu belirler. Bizim ellerde PPEP-1 sürekli iç içe gelişmiş kristaller üretir. Böylece PPEP-1 tek sapması kalitede kristaller üretmek için bir optimizasyon yöntemi geliştirmişlerdir. Bu protokolde, ayrıntılı PPEP-1 14 üretimi, saflaştırma, kristalleştirme ve Yapı çözümü tarif etmektedir. Bu salgılama sinyal dizisi, saflaştırma işareti kaldırılması ile afinite kromatografisi ve boyut çıkarma kromatografisine eksik PPEP-1 varyantın Escherichia coli hücre içi ifade kullanmak, çinko tek dalga boyu anormal dağılma vasıtasıyla bir optimizasyon ekran ve yapı belirlenmesi halinde 16 mikro-tohumlama ardından (çinko-SAD) 17. Bu protokol, (diğer proteinlerin üretimi ve yapı tayini için uyarlanabilir, örneğin &lt;/ Em&gt; metaloproteazlar) ile iç içe gelişmiş kristallerinin üretilmesi proteinler için, özellikle de. İstek üzerine, yapının DNA (pET28a-USES-rPPEP-1) ve difraksiyon verileri, eğitim amacıyla temin edilebilir.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Genler / Vektörler / hücre suşları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET28a vektörü</td><td>Merck-Millipore</td><td>69864</td><td>Trombin bölünebilir N-terminal His-tag</td></tr><tr><td>E. coli< > suşu BL21 (DE3) Star</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C601003</td> PPEP-1'in (CD630_28300) <td>RNase H eksikliği</td></tr> kodonu <tr><td>için optimize edilmiş gen (E. coli için)</td><td>Geneart (Thermo Fisher Scientific)</td> <td>özel</td><td>amino asitler 27-220</td></tr> <tr><td>< güçlü > İsim< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Şirket< güçlü ></td> <td>< güçlü > Katalog Numarası < / güçlü ></td> <td>< güçlü > Yorumlar< / güçlü</td></tr> <tr><td>> < güçlü > Kimyasallar< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Maya herhangi</td><td>bir</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripton</td><td></td> özü<td></td><td></td></tr><tr><td>Köpük Önleyici B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5757</td><td>sulu-silikon emülsiyonu</td></tr><tr><td>Agar</td><td>herhangi bir</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td>herhangi bir</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>AppliChem</td><td>A1008</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>AppliChem</td><td>A1087</td><td>Tampon sınıfı</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>herhangi bir</td><td></td><td>Tampon sınıfı</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>AppliChem</td><td>A1073</td><td>Tampon sınıfı</td></tr><tr><td>Trombin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum fosfat dibazik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215996</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol %</td><td></td><td></td>100 <td>en saf sınıf</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Sıvı kristallerin</td><td>depolanması ve kriyo soğutulması için</td> <td>nitrojen</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>strong<>Ekipman (genel)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shake inkübatörü</td><td>herhangi biri</td><td></td><td>20 °C sıcaklık sağlar &deg; C - 37 derece > C</td></tr><tr><td>Züccaciye,</td><td>herhangi bir</td><td></td><td>şaşkın Erlenmeyer şişesi (50 ml - 2.8 L)</td></tr> <tr><td>Büyük kültür hacimleri için santrifüj</td>, <td>12 L'ye kadar olan hacimleri işlemek için</td><td>herhangi bir</td><td></td> santrifüj</tr>, <tr><td>Sonicator, Vibra-Cell VCX500</td>, <td>Sonics</td><td>SO-VCX500</td><td>veya başka herhangi bir sonikatör / hücre bozucu</td></tr>, <tr><td>Ultrasantrifüj,</td><td>150.000 x g'ye</td><td></td> kadar hız sağlayan herhangi bir <td></td> santrifüj</tr><tr><td>NiNTA Superflow reçine</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boş Cam Econo-Column</td><td>Bio-Rad</td><td>7371007</td><td>veya başka herhangi bir boş cam veya plastik kolon</td></tr><tr><td>Boyut dışlama kromatografi sütunu HiLoad Superdex 200 16/600</td><td>GE Sağlık</td><td>Hizmetleri 28989335</td><td></td></tr><tr><td>Kromatografi sistemi ve AUML; kta Arıtıcı</td>, <td>GE Healthcare</td><td>28406264</td><td>veya başka herhangi bir kromatografi sistemi</td></tr>, <tr><td>Diyaliz tüpü, Spectra/Por 3</td>, <td>Spectrum Labs</td><td>132724</td><td></td></tr><tr><td>Diyaliz tüpü kapakları</td>, <td>Spectrum Labs</td><td>132738</td><td></td></tr>, <tr><td>Ultrafiltrasyon üniteleri (yoğunlaştırıcılar), 10.000 NWCO</td>, <td>herhangi</td> bir <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>UV-Vis spektrofotometresi</td></tr><tr><td>< güçlü > İsim< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Şirket< / güçlü</td> <td>> < güçlü > Katalog Numarası< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Yorumlar< / güçlü ></td></tr> <tr><td>< güçlü > Ekipman (kristalografi) < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Düşük hacimli pipet 0.1-10 ve mikro; l</td><td>herhangi bir</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pozitif deplasmanlı pipet Microman M10</td><td>Gilson</td><td>F148501</td><td></td></tr><tr><td>Kristalizasyon robotu</td><td></td>, üç protein kuyusu TTP 4150-05810 veya başka herhangi bir 96 kuyulu kristalizasyon plakası olan herhangi bir <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>96 oyuklu kristalizasyon plakası TTP</td> <td>IQ</td> ></tr><tr><td>24 kuyulu CombiClover Junior Plate</td><td>Jena Bioscience</td><td>EB-CJR</td><td></td></tr><tr><td>Kristal Berraklığında Sızdırmazlık Bandı</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-511</td><td></td></tr><tr><td>Silikonize Cam Kapak Slaytları</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-225</td><td></td></tr><tr><td>Ticari kristalizasyon ekranları: SaltRx, İndeks, PEG/İyon, Crystal</td><td>Hampton Research</td><td>çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>Ticari kristalizasyon ekranları: Sihirbaz, PACT++, JCSG++Jena</td> <td>Bioscience</td><td>çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>JBS Tohum Boncukları</td><td>Jena Bioscience</td><td>CO-501</td><td></td></tr><tr><td>CrystalCap SPINE HT (naylon halkalar)</td><td>Hampton Research</td><td>çeşitli</td><td>döngü boyutları 0,025 mm - 0,5 mm</td></tr><tr><td>CrystalCap Flakon</td><td>Araştırma</td><td>HR4-904</td><td></td></tr><tr><td>Kriyojenik Köpük Dewar 800 ml</td><td>Hampton Araştırma</td><td>HR4-673</td><td></td></tr><tr><td>Kriyojenik Köpük Dewar 2 L</td><td>Hampton Araştırma</td><td>HR4-675</td><td></td></tr><tr><td>Flakon Kelepçesi, Düz</td><td>Hampton Araştırma</td><td>HR4-670</td><td></td></tr><tr><td>Kristal Değnek Manyetik, Düz</td><td>Hampton Araştırma</td><td>HR4-729</td><td></td></tr><tr><td>CryoCane 6 Flakon Tutucu</td><td>Hampton Araştırma</td><td>HR4-711</td><td></td></tr><tr><td>CryoSleeve</td><td>Hampton Araştırma</td><td>HR4-708</td><td></td></tr><tr><td>Kriyo Kamışı Renk Kodlayıcı - Beyaz</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-713</td><td></td></tr><tr><td>Neşter</td><td>herhangi</td><td></td><td></td></tr> bir <tr><td>Düz mikrokuvvet</td><td>herhangi</td><td></td> bir <td>sızdırmazlık bandının manipülasyonu için. etc.</td></tr><tr><td>Akupunktur iğnesi</td><td>herhangi bir</td> <td>eczaneden <</td><td></td>em></tr><tr><td>Stereo mikroskop</td><td>herhangi</td><td></td><td>kristalizasyon plakalarının ve kristal montajının incelenmesi için, 160X'e kadar büyütme</td></tr></tbody></table>

Üretim, kristalleşme ve yapı tayini ve<em&gt; c. difficile</em&gt; ppep-1 mikro-tohumlama ve Çinko-sad aracılığıyla

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

İnsan sağlığı için büyük bir tehdit olan Clostridium difficile enfeksiyonlarını tedavi etmek için yeni tedavilere ihtiyaç var. C. difficile metalloprotaz PPEP-1, patojenin virülansını azaltmak için gelecekteki inhibitörlerin geliştirilmesi için bir hedeftir. Biyofiziksel ve yapısal karakterizasyonun yanı sıra inhibitör taraması yapmak için büyük miktarlarda saf ve aktif proteine ihtiyaç duyulacaktır. PPEP-1'in verimli üretimi ve saflaştırılması için, kristalleşme ve yapı tayini için yeterli miktarda ve saflıkta protein sağlayan ekspresyon konakçısı olarak E. coli'nin kullanılmasıyla bir protokol geliştirdik. Ek olarak, mikro tohumlama kullanılarak, yüksek oranda iç içe geçmiş PPEP-1 kristalleri, X-ışını kırınım analizi için uygun iyi düzenlenmiş kristallere büyütülebilir. Yöntemler ayrıca diğer rekombinant proteinleri üretmek ve iç içe geçmiş kristaller üreten diğer proteinlerin yapılarını incelemek için de kullanılabilir.

rPPEP-1, E. coli BL21 (DE3) Yıldız (Şekil 1C) en yüksek verimle çeşitli E.coli suşları aşırı eksprese edilir. İlk Ninta afinite kromatografi basamağından sonra, 6xHis-Tag başarılı protein çoğundan yanlabilir ve ikinci Ninta aşamada, düzenlenmemiş protein tam trombin sindirilmiş protein (Şekil 1D) ayrılabilir. Ara sıra muhtemelen dimerik türler (Şekil 2A) &#39;e uygun önü ile, monomer olarak bir S200 16/600 kolonu etiket...

Prolin-prolin endopeptidaz-1 (PPEP-1), insan patojeni Clostridium difficile'den salgılanan bir metalloprotaz ve umut verici ilaç hedefidir. Burada, bu proteinin üretimi ve yapısının belirlenmesi için gerekli tüm yöntemleri açıklıyoruz.

Üretim, Kristalleşme ve Yapı Tayini ve<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 mikro-tohumlama ve Çinko-SAD aracılığıyla

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

Bu prosedürün genel amacı, rekombinant prolin prolin, endopeptidaz-1 veya rPPEP-1 proteininin tek kafes kırınım kalitesi kristallerini verimli bir şekilde büyütmektir. Bu yöntem olmadan, rPPEP-1 anında xray kırınım analizi için uygun olmayan yüksek oranda iç içe geçmiş kristaller üretir. Bu tekniğin ana avantajı, rPPEP-1'in yapısal tayini için çok sayıda iyi düzenlenmiş ve iyi kırınım yapan kristallerin kısa sürede ve sınırlı malzeme girdisi ile üretilebilmesidir.Bu prosedür, mikroşehir yöntemini kullanır ve rPPEP-1'in yanı sıra substrat peptit komplekslerinin her başarılı ilk kristalizasyon koşulu için uyarlanabilir. Bu yöntem, iç içe geçmiş kristaller veren hemen hemen her proteinin iyi düzenlenmiş kristallerini üretmek için uyarlanabilir. Ayrıca çapraz tohumlama deneylerinde, protein varyansında veya küçük moleküllerle kokristalizasyon deneylerinde de kullanılabilir.Kristalizasyon yöntemlerinin işlenmesinin görsel olarak gösterilmesi çok önemlidir, çünkü küçük değişiklikler bile kristallerin kırınım kalitesi üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Piyasada bulunan standart ekranlar ve bir kristalizasyon robotu kullanarak oturarak damla formatında kristalizasyon denemeleri gerçekleştirin. İlk olarak, saflaştırılmış proteini, 4000 kez g ve dört santigrat derecede beş dakikalık aralıklarla santrifüjlü bir ultrafiltrasyon cihazı kullanarak mililitre başına 12 miligrama konsantre edin.Çökelmeyi ve ağırlaşmayı önlemek için proteini her aralıktan sonra karıştırın. Molar santimetre başına 25.900 yok olma katsayısını kullanarak 280 nanometredeki protein konsantrasyonunu belirleyin. Proteini 20 santigrat dereceye kadar dengeledikten sonra, tüm parçacıkları ve tozu 10 dakika boyunca 16000 kez g ve 20 santigrat derece santrifüjleme ile temizleyin.Kristal ekranları gerçekleştirmek için, dört santigrat derecede kapatılmış ve saklanmış önceden doldurulmuş kristalizasyon plakaları kullanın. Denemeleri kurarken, küçük hacimler hızla kuruduğu için hızlı çalışın. Ayrıca mümkünse robotun yuvasının etrafında bir nem odası kullanın.Tüm kristalizasyon plakalarını 20 santigrat dereceye kadar dengeledikten sonra, protein rezervuarını iki ila dört alt kuyuya pipetleyerek ekranı kurun. 300 nanolitrelik bir damla hacmi kullanın. İkinci kuyu için 200:100, üçüncü kuyu için 150:150 ve dördüncü kuyu altı için 100:200 protein / rezervuar oranları kullanın.Plakayı hemen kapatın ve 20 santigrat derecede bir odaya yerleştirin. Kurulumdan sonra tepsileri ilk hafta boyunca her gün inceleyin ve ardından haftalık inceleme ile takip edin. Substrat peptit rPPEP-1 komplekslerinin bir kokristalizasyonu için, rPPEP-1'i mililitre başına 24 miligramda 1: 1 oranında yedi kat molar fazla peptit çözeltisi ile karıştırın, tris tamponlu tuzlu su içinde çözündürülmüş liyofilize toz serin.20 santigrat derecede 30 dakika inkübe ettikten sonra, 16000 kez g ve 20 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleme ile tüm parçacıkları ve tozu temizleyin. Bağlanmamış rPPEP-1 proteini ile aynı mikro tohumlama prosedürünü kullanarak kristalleştirmeye devam edin. rPPEP-1'in yüksek oranda iç içe geçmiş kristalleri, iki gün sonra 2.4 molar amonyum fosfat dibazik ve 0.1 molar trisapseal pH 8.5 içeren bir durumda ortaya çıktı.Başlangıç koşulunu optimize etmek için, 10 optimizasyon ekranına izin veren her koşuldan iki mililitre elde etmek için hacimleri ve pipetleme şemasını hesaplamak için yazılım kullanın. Koşullar, 0.15 molar'lık adımlarla 1.8 ila 2.55 molar amonyum fosfat dibazik ve ayrıca 0.1 molar trisapseal pH'ı, 0.5 pH birimi'lik adımlarla 7.5 ila 9.0'ı içerir. Stok çözümlerinden 24 koşuldan oluşan bir ızgara ekranı hazırlayın.Bireysel koşulları oluşturmak için pipetleme şemasını kullanın. Her ızgara elek çözeltisinden 200 mikrolitreyi 24 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına pipetleyin ve plakayı 20 santigrat derecede dengeleyin. Kristalizasyon plakasını manuel olarak ayarlayın.Üç mikrolitrelik bir damla hacmi ve 2: 1, 1.5: 1: 5 ve 1: 2'lik bir protein rezervuar oranı kullanın. Burada, hava kabarcığı oluşumunu önlemek için pozitif yer değiştirmeli bir pipet kullanın. Plakayı hemen kapatın.Ardından plakayı 20 santigrat derecede bir odaya yerleştirin. Bir ila dört gün sonra, 2.55 molar amonyum fosfat dibazik ve 0.1 molar trisapseal pH 7.5 ila 9.0 içeren dört koşulda yüksek oranda iç içe geçmiş rPPEP-1 kristalleri ortaya çıkarken, kalan 20 koşulda kristal oluşmaz. Bu koşullarda tek rPPEP-1 kristalleri elde etmek için mikro tohumlama prosedürünü gerçekleştirin.Bir mikro tohum stoğu hazırlamak için, önce başarılı koşullardan birinden tek bir iç içe geçmiş kristal seçin. Daha sonra, ilgili ana likörün 50 mikrolitresini küçük, çok cilalı bir cam boncuk ve bir mikrolitre ana likör içeren 1,5 mililitrelik bir tüpe cam kapak slaytına aktarın. Monte edilmiş bir naylon yağ kullanarak kristali çıkarın ve cam kapak sürgüsündeki damlaya aktarın.Daha sonra kristali içeren sıvıyı tüpe aktarın ve cam boncuğun döndüğünden emin olarak 30 saniye boyunca yüksek hızda girdap yapın. Tohum stoğunu aynı taze hazırlanmış koşulu içeren 1.5 mililitrelik yeni bir tüpe 1:1000 oranında seyreltin ve beş saniye boyunca iyice girdap yapın. Ardından, 20 koşulu şeffaf damlalarla kaplayan plakanın contasını çıkarın.Tohum stoğunun 0,5 mikrolitresini kuyucuklara pipetleyin. Plakayı kapatın ve 20 santigrat derecede bir odaya yerleştirin. Bu mikro tohumlama tekniğini uyguladıktan sonra, 1.8 ila 2.4 molar amonyum fosfat ve 0.1 molar tris pH 7.5 ila dokuz içeren, çeşitli koşullarda kurulumdan birkaç saat ila birkaç gün sonra yüksek kırınım kalitesine sahip tek kristaller ortaya çıkar.Kristaller en büyük boyutta 100 ila 200 mikron boyuta kadar büyür. Seçilen kristallerin maksimum uzunluğu için en uygun naylon halka boyutunu, halkayı kristalin hemen üzerindeki sızdırmazlık bandına yerleştirerek ve yukarı ve aşağı odaklayarak seçin. rPPEP-1 kristallerinin tipik en uzun erişimi yaklaşık 100 ila 200 mikrondur.Ayrıca uygun kriyocondition'ı hazırlayın. Köpük dewers'ı sıvı nitrojenle doldurun. Daha sonra flakon kelepçesini bir flakon ile yükleyin ve sıvı nitrojen dolgulu 800 mililitre köpük delinin içinde önceden soğutun.Sıvı nitrojen dolgulu iki litrelik köpük kanalizasyona uygun bir tanımlayıcı ile işaretlenmiş bir kriyokan tutucusu ve bir kriyosleeve yerleştirin. Ardından manyetik çubuğu doğru boyutta monte edilmiş naylon halka ile yükleyin. Daha sonra, kristalizasyon plakası üzerindeki sızdırmazlık bandını keskin bir neşter ile kesin ve forseps ile çıkarın.Kriyocondition bir mikrolitreyi kapak sürgüsüne pipetleyin. Bu adımda hızlı çalışmak özellikle önemlidir, çünkü kristalin veya döngüdeki küçük hacimli kriyoçözeltinin kuruması, kristal kalitesinde dalgalanmalara ve hatta tam bir kırınım kaybına neden olabilir. Tüm kristal manipülasyon adımları stereo mikroskop altında gerçekleştirilmelidir.Kristal plastik yüzeye yapışırsa, çevredeki plastiği bir akupunktur iğnesi ile deforme ederek yerden ayırın. Monte edilmiş naylon halka ile avlayarak kristali damladan çıkarın. Kristali hızlı bir şekilde kriyocondition damlasına aktarın ve bir saniye boyunca dengelenmesine izin verin.Ardından, monte edilmiş naylon halka ile kristali mümkün olan en kısa sürede damladan çıkarın. Alınan kristali hemen sıvı nitrojen içinde dondurun. Monte edilmiş halkanın etrafındaki sıvı nitrojen kaynamayı bıraktığında, halkayı şişeye yerleştirin.Şişeyi kriyokan tutucusuna yerleştirin. Tutucuya altı şişe yüklendikten sonra, tutucunun etrafına bir kriyosleeve yerleştirin. Kristalleri kullanılana kadar sıvı nitrojen ile dolu bir tankta saklayın.Veri toplamayı gerçekleştirmek için, monte edilmiş kristali bir kelepçe kullanarak kriyokandan dikkatlice alın ve taşıma için bir köpük kanalda saklayın. Işın durdurucuyu ve dedektörü park konumuna getirin ve kriyonozulu birkaç milimetre yukarı hareket ettirin. Şişeyi hızlı bir şekilde çıkarırken tabanı parmaklarınızla tutarak kriyokapağın tabanını açıölçer kafasına monte edin.Ardından kriyonozulu ve ışın durdurucuyu tekrar yerine getirin ve kristali ortalayın. Her zaman ışın durdurucuya veya dedektöre dokunmamaya dikkat edin. Burada gösterildiği gibi 0,1 derecelik bir salınım açısına sahip 180 derecelik veri setini toplamaya devam edin.Burada, 1.4 sodyum sitrat tribazik dihidrat, 0.1 molar HEPES sodyum, pH 7.5 içinde ticari kristalizasyon ekranları kullanılarak ilk taramadan elde edilen yüksek oranda iç içe geçmiş rPPEP-1 kristalleri gösterilmektedir. Burada, %60 hacim ila hacim taksimat, pH 7.0, 0.1 molar BIS-TRIS propan, pH 7.0 ile ilk taramadan elde edilen kristaller gösterilmektedir. Kristaller ayrıca 2.4 molar amonyum fosfat dibazik, 0.1 molar tris, pH 8.5'te ortaya çıktı.Mikro tohumlama optimizasyon prosedürünü uyguladıktan sonra, tek kristaller, 2.1 molar amonyum fosfat dibazik, 0.1 molar tris, pH 8 ve 2.25 molar amonyum fosfat dibazik, 0.1 molar tris, pH 8 dahil olmak üzere çeşitli koşullarda muhafaza edildi. Naylon halkalara monte edilen kristaller 100 ila 200 mikron boyutundadır ve mikroskobik incelemeden tek bir kafese sahip gibi görünmektedir. Xray kırınım analizi, bu kristallerin gerçekten de tek bir kafes sergilediğini ve xray'leri atomik çözünürlüğe yakın bir çözünürlüğe kırdığını göstermektedir.Rekombinant PPEP-1 substrat peptit kompleksinin kristal yapısının çözülmesi, PPEP-1'in substrat bağlama modu hakkında bilgi verir. Substrat peptidi, açık onayında PPEP-1'in substrat bağlama grubuna yayılabilir. Daha sonra döngü kapanması meydana geldiğinde, substrat, hidrojen bağları ve S-döngüsü üzerinde bulunan benzersiz alifatik-aromatik yan zincir ağı aracılığıyla PPEP-1 ile etkileşime girer.Substrat, cızırtılı peptit bağında ve P2 prime ila P3 prime peptit bağındaki bükülmelerle benzersiz bir çift bükülmüş konformasyonda bağlanır. Bu videoyu izledikten sonra, yapısal çalışmalar için rekombinant PPEP-1'in tek kafes iyi kırınımlı kristallerinin nasıl üretileceğini iyi anlamış olmalısınız. Benzer yaklaşımlar, yüksek oranda iç içe geçmiş kristaller ve daha fazla değişen inkübasyon sıcaklığı ve C-stok seyreltmesi sağlayan diğer proteinlerle de kullanılabilir.Çok yönlülüğü ve basit kullanımı nedeniyle, bu basit teknik her kristal optimizasyon işleminde denenmelidir.

production-crystallization-structure-determination-c-difficile-ppep-1

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Burada lipidik mesophases membran proteinlerinin kristalizasyon denemeleri elle kurmak için Caffrey Membran Yapısal ve Fonksiyonel Biyoloji Grubu uygulanan prosedür açıklanmıştır.

Lipidik Mesophases kullanarak Yapı Tayini için Membran Proteinleri Kristalize

Yapı-esaslı ecza tasarımı ilaç gelişmesinde önemli bir rol oynar. Paralel olarak birden çok hedef edinerek büyük ölçüde kurşun keşfi için başarı şansını artırır. Aşağıdaki makale Enfeksiyon Hastalıkları için Seattle Yapısal Genomik Merkezi PB2 influenza A alt birimi gen-için-yapı tayini için bir çoklu hedef yaklaşım kullanır nasıl vurgulamaktadır.

Grip Polimeraz Gen-to-yapı belirlenmesi PB2 alt birimi için çoklu hedef Paralel İşleme Yaklaşımı

Kaynak: Figueroa, D.M., et.al. Antimikrobiyal peptit lokalizasyonunu karakterize etmek için bakteriyel sferoplastların ve protoplastların üretimi ve görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2018)Bu video, önce filamentasyonu indüklemek için hücre bölünmesini inhibe ederek, ardından hücre duvarının enzimatik sindirimini izleyerek Escherichia coli sferoplastlarının üretimini göstermektedir. İşlem, mikroskobik gözlem için uygun sferoplast oluşumunu ve stabilitesini sağlamak için bir şelatlama maddesi,...

E. coli Sferoplastların Hazırlanması

Membran-gömülü protein etki arasındaki etkileşimler biyofiziksel ve biyokimyasal çalışmalarda uygun çalışma malzemesi elde edilir ilki birçok teknik sorunlarla karşı karşıya. Bu makale, çözelti nükleer manyetik rezonans (NMR) ve diğer analitik uygulamalar tarafından yapısal analizi için uygun olan disülfid stabilize transmembran peptid komplekslerini üretme ve arıtma için bir protokol açıklanmaktadır.

Yapısal Çalışmaları üretimi disülfid stabilize Transmembran Peptit Kompleksi

β namlulu dış zar proteinleri (OMP'ler), Gram-negatif bakterilerin, mitokondrilerin ve kloroplastların dış zarları içinde birçok işleve hizmet eder. Burada, X-ışını kristalografisi veya NMR spektroskopisi ile yapı belirleme için yeterli miktarlarda β namlulu OMP'lerin üretimi için protokoller sunarak yapısal çalışmalarda bilinen bir darboğazı hafifletmeyi umuyoruz.

β-varil Dış Membran Proteinleri Yapı Tayini Doğru - Yapıların itibaren Crystals

Karbonhidrat substrat bağlayıcı protein geniş bir biyokimyasal ve yapısal karakterizasyon Streptococcus pneumoniae gerçekleştirmek için akıcı bir protokol sunulmuştur.

Karbonhidrat taşıma substrat-bağlayıcı-protein SP0092 biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu

Burada Ayagin Gram-negatif Escherichia coli (e.coli) üretmek için bir protokol mevcut spheroplasts ve gram-pozitif Bacillus megaterium (B. megaterium) önceki açıkça görselleştirmek ve hızla karakterize peptid-bakteri etkileşimler. Bu yerelleştirme ve peptidler translocating membran tanımlamak için sistematik bir yöntem sağlar.

Üretim ve bakteriyel Spheroplasts ve önceki antimikrobiyal peptid yerelleştirme karakterize etmek için görselleştirme

NEMO'nun IKK-bağlayıcı alanının x-ışını kristalografisi ile yapı tayinine ilişkin protokolleri açıklıyoruz. Bu yöntemler arasında protein ekspresyonu, saflaştırma ve karakterizasyonunun yanı sıra başarılı kristal optimizasyonu ve proteinin sınırsız formunda yapı tespiti stratejileri yer almaktadır.

NEMO'nun IKK bağlayıcı alanının üretimi, kristalizasyonu ve Yapı Tayini

Bu protokol, yapısal düzeyde bir M42 aminopeptidaz olan TmPep1050'nin dimer-dodecamer geçişini incelemek için geliştirilmiştir. Protein arınması ile X-ışını veri işlemeye kadar basit bir boru hattıdır. Crystallogenezis, veri seti indeksasyonu ve moleküler replasman çalışma bir olgu ile vurgulanmıştır, TmPep1050H60A H307A varyantı.

X-Ray Kristalografi Thermotoga maritima M42 Aminopeptidaz TmPep1050 Oligomerik Devlet Geçiş Çalışma

Karşı difüzyon yöntemini kullanarak bir enzimin kristalleşmesini, ıslatarak kristallere bir substratın girmesini ve oda sıcaklığında çipin içindeki kristallerin seri analizi ile enzim:substrat kompleksinin 3D yapısının belirlenmesini sağlayan çok yönlü bir mikroakışkan cihaz tarif edilir.

Çok Yönlü Bir Mikroakışkan Çipte Seri Kristalografi ile Bir Enzim:Substrat Kompleksinin Kristalizasyonu ve Yapısal Belirlenmesi

CryoEM kullanılarak makromoleküler komplekslerin yapı tespiti, belirli protein ve kompleks sınıfları için rutin hale gelmiştir. Burada, bu işlem hattı özetlenmiştir (numune hazırlama, tarama, veri toplama ve işleme) ve okuyucular daha zorlu numuneler durumunda değiştirilebilecek daha ayrıntılı kaynaklara ve değişkenlere yönlendirilir.

Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskopisi: Numuneden Yapıya

Öğrenin, C. difficile PPEP-1 metaloproteazının yüksek kaliteli kristallerini mikro-tohumlama ve çinko-SAD yöntemleriyle üretmeyi. Bu teknik, yapısal biyolojide ilaç hedefi belirleme çalışmalarına katkı sağlar.

Üretim, Kristalleşme ve Yapı Tayini ve

Daha fazla video keşfet