Üretim, Kristalleşme ve Yapı Tayini ve C. difficile PPEP-1 mikro-tohumlama ve Çinko-SAD aracılığıyla

Bu prosedürün genel amacı, rekombinant prolin prolin, endopeptidaz-1 veya rPPEP-1 proteininin tek kafes kırınım kalitesi kristallerini verimli bir şekilde büyütmektir. Bu yöntem olmadan, rPPEP-1 anında xray kırınım analizi için uygun olmayan yüksek oranda iç içe geçmiş kristaller üretir. Bu tekniğin ana avantajı, rPPEP-1'in yapısal tayini için çok sayıda iyi düzenlenmiş ve iyi kırınım yapan kristallerin kısa sürede ve sınırlı malzeme girdisi ile üretilebilmesidir.

Bu prosedür, mikroşehir yöntemini kullanır ve rPPEP-1'in yanı sıra substrat peptit komplekslerinin her başarılı ilk kristalizasyon koşulu için uyarlanabilir. Bu yöntem, iç içe geçmiş kristaller veren hemen hemen her proteinin iyi düzenlenmiş kristallerini üretmek için uyarlanabilir. Ayrıca çapraz tohumlama deneylerinde, protein varyansında veya küçük moleküllerle kokristalizasyon deneylerinde de kullanılabilir.

Kristalizasyon yöntemlerinin işlenmesinin görsel olarak gösterilmesi çok önemlidir, çünkü küçük değişiklikler bile kristallerin kırınım kalitesi üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Piyasada bulunan standart ekranlar ve bir kristalizasyon robotu kullanarak oturarak damla formatında kristalizasyon denemeleri gerçekleştirin. İlk olarak, saflaştırılmış proteini, 4000 kez g ve dört santigrat derecede beş dakikalık aralıklarla santrifüjlü bir ultrafiltrasyon cihazı kullanarak mililitre başına 12 miligrama konsantre edin.

Çökelmeyi ve ağırlaşmayı önlemek için proteini her aralıktan sonra karıştırın. Molar santimetre başına 25.900 yok olma katsayısını kullanarak 280 nanometredeki protein konsantrasyonunu belirleyin. Proteini 20 santigrat dereceye kadar dengeledikten sonra, tüm parçacıkları ve tozu 10 dakika boyunca 16000 kez g ve 20 santigrat derece santrifüjleme ile temizleyin.

Kristal ekranları gerçekleştirmek için, dört santigrat derecede kapatılmış ve saklanmış önceden doldurulmuş kristalizasyon plakaları kullanın. Denemeleri kurarken, küçük hacimler hızla kuruduğu için hızlı çalışın. Ayrıca mümkünse robotun yuvasının etrafında bir nem odası kullanın.

Tüm kristalizasyon plakalarını 20 santigrat dereceye kadar dengeledikten sonra, protein rezervuarını iki ila dört alt kuyuya pipetleyerek ekranı kurun. 300 nanolitrelik bir damla hacmi kullanın. İkinci kuyu için 200:100, üçüncü kuyu için 150:150 ve dördüncü kuyu altı için 100:200 protein / rezervuar oranları kullanın.

Plakayı hemen kapatın ve 20 santigrat derecede bir odaya yerleştirin. Kurulumdan sonra tepsileri ilk hafta boyunca her gün inceleyin ve ardından haftalık inceleme ile takip edin. Substrat peptit rPPEP-1 komplekslerinin bir kokristalizasyonu için, rPPEP-1'i mililitre başına 24 miligramda 1: 1 oranında yedi kat molar fazla peptit çözeltisi ile karıştırın, tris tamponlu tuzlu su içinde çözündürülmüş liyofilize toz serin.

20 santigrat derecede 30 dakika inkübe ettikten sonra, 16000 kez g ve 20 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleme ile tüm parçacıkları ve tozu temizleyin. Bağlanmamış rPPEP-1 proteini ile aynı mikro tohumlama prosedürünü kullanarak kristalleştirmeye devam edin. rPPEP-1'in yüksek oranda iç içe geçmiş kristalleri, iki gün sonra 2.4 molar amonyum fosfat dibazik ve 0.1 molar trisapseal pH 8.5 içeren bir durumda ortaya çıktı.

Başlangıç koşulunu optimize etmek için, 10 optimizasyon ekranına izin veren her koşuldan iki mililitre elde etmek için hacimleri ve pipetleme şemasını hesaplamak için yazılım kullanın. Koşullar, 0.15 molar'lık adımlarla 1.8 ila 2.55 molar amonyum fosfat dibazik ve ayrıca 0.1 molar trisapseal pH'ı, 0.5 pH birimi'lik adımlarla 7.5 ila 9.0'ı içerir. Stok çözümlerinden 24 koşuldan oluşan bir ızgara ekranı hazırlayın.

Bireysel koşulları oluşturmak için pipetleme şemasını kullanın. Her ızgara elek çözeltisinden 200 mikrolitreyi 24 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına pipetleyin ve plakayı 20 santigrat derecede dengeleyin. Kristalizasyon plakasını manuel olarak ayarlayın.

Üç mikrolitrelik bir damla hacmi ve 2: 1, 1.5: 1: 5 ve 1: 2'lik bir protein rezervuar oranı kullanın. Burada, hava kabarcığı oluşumunu önlemek için pozitif yer değiştirmeli bir pipet kullanın. Plakayı hemen kapatın.

Ardından plakayı 20 santigrat derecede bir odaya yerleştirin. Bir ila dört gün sonra, 2.55 molar amonyum fosfat dibazik ve 0.1 molar trisapseal pH 7.5 ila 9.0 içeren dört koşulda yüksek oranda iç içe geçmiş rPPEP-1 kristalleri ortaya çıkarken, kalan 20 koşulda kristal oluşmaz. Bu koşullarda tek rPPEP-1 kristalleri elde etmek için mikro tohumlama prosedürünü gerçekleştirin.

Bir mikro tohum stoğu hazırlamak için, önce başarılı koşullardan birinden tek bir iç içe geçmiş kristal seçin. Daha sonra, ilgili ana likörün 50 mikrolitresini küçük, çok cilalı bir cam boncuk ve bir mikrolitre ana likör içeren 1,5 mililitrelik bir tüpe cam kapak slaytına aktarın. Monte edilmiş bir naylon yağ kullanarak kristali çıkarın ve cam kapak sürgüsündeki damlaya aktarın.

Daha sonra kristali içeren sıvıyı tüpe aktarın ve cam boncuğun döndüğünden emin olarak 30 saniye boyunca yüksek hızda girdap yapın. Tohum stoğunu aynı taze hazırlanmış koşulu içeren 1.5 mililitrelik yeni bir tüpe 1:1000 oranında seyreltin ve beş saniye boyunca iyice girdap yapın. Ardından, 20 koşulu şeffaf damlalarla kaplayan plakanın contasını çıkarın.

Tohum stoğunun 0,5 mikrolitresini kuyucuklara pipetleyin. Plakayı kapatın ve 20 santigrat derecede bir odaya yerleştirin. Bu mikro tohumlama tekniğini uyguladıktan sonra, 1.8 ila 2.4 molar amonyum fosfat ve 0.1 molar tris pH 7.5 ila dokuz içeren, çeşitli koşullarda kurulumdan birkaç saat ila birkaç gün sonra yüksek kırınım kalitesine sahip tek kristaller ortaya çıkar.

Kristaller en büyük boyutta 100 ila 200 mikron boyuta kadar büyür. Seçilen kristallerin maksimum uzunluğu için en uygun naylon halka boyutunu, halkayı kristalin hemen üzerindeki sızdırmazlık bandına yerleştirerek ve yukarı ve aşağı odaklayarak seçin. rPPEP-1 kristallerinin tipik en uzun erişimi yaklaşık 100 ila 200 mikrondur.

Ayrıca uygun kriyocondition'ı hazırlayın. Köpük dewers'ı sıvı nitrojenle doldurun. Daha sonra flakon kelepçesini bir flakon ile yükleyin ve sıvı nitrojen dolgulu 800 mililitre köpük delinin içinde önceden soğutun.

Sıvı nitrojen dolgulu iki litrelik köpük kanalizasyona uygun bir tanımlayıcı ile işaretlenmiş bir kriyokan tutucusu ve bir kriyosleeve yerleştirin. Ardından manyetik çubuğu doğru boyutta monte edilmiş naylon halka ile yükleyin. Daha sonra, kristalizasyon plakası üzerindeki sızdırmazlık bandını keskin bir neşter ile kesin ve forseps ile çıkarın.

Kriyocondition bir mikrolitreyi kapak sürgüsüne pipetleyin. Bu adımda hızlı çalışmak özellikle önemlidir, çünkü kristalin veya döngüdeki küçük hacimli kriyoçözeltinin kuruması, kristal kalitesinde dalgalanmalara ve hatta tam bir kırınım kaybına neden olabilir. Tüm kristal manipülasyon adımları stereo mikroskop altında gerçekleştirilmelidir.

Kristal plastik yüzeye yapışırsa, çevredeki plastiği bir akupunktur iğnesi ile deforme ederek yerden ayırın. Monte edilmiş naylon halka ile avlayarak kristali damladan çıkarın. Kristali hızlı bir şekilde kriyocondition damlasına aktarın ve bir saniye boyunca dengelenmesine izin verin.

Ardından, monte edilmiş naylon halka ile kristali mümkün olan en kısa sürede damladan çıkarın. Alınan kristali hemen sıvı nitrojen içinde dondurun. Monte edilmiş halkanın etrafındaki sıvı nitrojen kaynamayı bıraktığında, halkayı şişeye yerleştirin.

Şişeyi kriyokan tutucusuna yerleştirin. Tutucuya altı şişe yüklendikten sonra, tutucunun etrafına bir kriyosleeve yerleştirin. Kristalleri kullanılana kadar sıvı nitrojen ile dolu bir tankta saklayın.

Veri toplamayı gerçekleştirmek için, monte edilmiş kristali bir kelepçe kullanarak kriyokandan dikkatlice alın ve taşıma için bir köpük kanalda saklayın. Işın durdurucuyu ve dedektörü park konumuna getirin ve kriyonozulu birkaç milimetre yukarı hareket ettirin. Şişeyi hızlı bir şekilde çıkarırken tabanı parmaklarınızla tutarak kriyokapağın tabanını açıölçer kafasına monte edin.

Ardından kriyonozulu ve ışın durdurucuyu tekrar yerine getirin ve kristali ortalayın. Her zaman ışın durdurucuya veya dedektöre dokunmamaya dikkat edin. Burada gösterildiği gibi 0,1 derecelik bir salınım açısına sahip 180 derecelik veri setini toplamaya devam edin.

Burada, 1.4 sodyum sitrat tribazik dihidrat, 0.1 molar HEPES sodyum, pH 7.5 içinde ticari kristalizasyon ekranları kullanılarak ilk taramadan elde edilen yüksek oranda iç içe geçmiş rPPEP-1 kristalleri gösterilmektedir. Burada, %60 hacim ila hacim taksimat, pH 7.0, 0.1 molar BIS-TRIS propan, pH 7.0 ile ilk taramadan elde edilen kristaller gösterilmektedir. Kristaller ayrıca 2.4 molar amonyum fosfat dibazik, 0.1 molar tris, pH 8.5'te ortaya çıktı.

Mikro tohumlama optimizasyon prosedürünü uyguladıktan sonra, tek kristaller, 2.1 molar amonyum fosfat dibazik, 0.1 molar tris, pH 8 ve 2.25 molar amonyum fosfat dibazik, 0.1 molar tris, pH 8 dahil olmak üzere çeşitli koşullarda muhafaza edildi. Naylon halkalara monte edilen kristaller 100 ila 200 mikron boyutundadır ve mikroskobik incelemeden tek bir kafese sahip gibi görünmektedir. Xray kırınım analizi, bu kristallerin gerçekten de tek bir kafes sergilediğini ve xray'leri atomik çözünürlüğe yakın bir çözünürlüğe kırdığını göstermektedir.

Rekombinant PPEP-1 substrat peptit kompleksinin kristal yapısının çözülmesi, PPEP-1'in substrat bağlama modu hakkında bilgi verir. Substrat peptidi, açık onayında PPEP-1'in substrat bağlama grubuna yayılabilir. Daha sonra döngü kapanması meydana geldiğinde, substrat, hidrojen bağları ve S-döngüsü üzerinde bulunan benzersiz alifatik-aromatik yan zincir ağı aracılığıyla PPEP-1 ile etkileşime girer.

Substrat, cızırtılı peptit bağında ve P2 prime ila P3 prime peptit bağındaki bükülmelerle benzersiz bir çift bükülmüş konformasyonda bağlanır. Bu videoyu izledikten sonra, yapısal çalışmalar için rekombinant PPEP-1'in tek kafes iyi kırınımlı kristallerinin nasıl üretileceğini iyi anlamış olmalısınız. Benzer yaklaşımlar, yüksek oranda iç içe geçmiş kristaller ve daha fazla değişen inkübasyon sıcaklığı ve C-stok seyreltmesi sağlayan diğer proteinlerle de kullanılabilir.

Çok yönlülüğü ve basit kullanımı nedeniyle, bu basit teknik her kristal optimizasyon işleminde denenmelidir.