Yüksek içeriği hedef nişan yapisan hücrelerdeki ölçmek için Imaging kullanarak
29 Kasım 2018
Uyuşturucu hedef nişan ölçümleri etkili ilaç geliştirme ve kimyasal sonda doğrulama için merkezi. Burada, uyuşturucu-hedef nişan yüksek içerik görüntüleme hücresel termal kayması tahlil (CETSA) bir Mikroplaka uyumlu uyum içinde kullanarak ölçmek için bir protokol ayrıntılı.
Bu yöntem, kimyasal biyoloji ve ilaç keşfi nde anahtar soruların cevapyardımcı olabilir. Mesela, bileşiğiniz hedef proteine bağlanır mı? Bu tekniğin başlıca avantajları, yapışık hücrelerin ayrılmasına gerek olmamasıdır.
Ve mekansal lokalizasyon görüntüleme ile belirlenebilir. Bu yöntemi hücre hatlarında uygulamış olsak da, bu yöntemi birincil kültürler ve kokültürler gibi diğer hücre sistemlerine de uygulamak mümkündür. Hücreleri tohumlamadan önce, bir doku kültürü kaputuna siyah 384 kuyulu görüntüleme test plakaları yerleştirin ve her plakanın her iki ucunda üç adet 3,5 milimetre çapında delik açmak için standart bir matkap kullanmadan önce plakaları alüminyum folyo ile kaplayın.
Plakalar hazır olduğunda, 5 ila 10 mililitre PBS ile A-431 hücre kültürünü yıkamak için aseptik tekniği kullanın. Ve hücreler ayrışana kadar hücreleri 37 derecede iki mililitre tripsin ile kuluçkaya yatırın. Sayma sonra, 5 kez 10 kültür orta mililitre başına 4 hücreleri hücreleri seyreltmek ve her bir deneme plakaher bir kuyuya hücrelerin 40 mikrolitre tohum.
Yavaşça iyi dipleri arasında hücrelerin homojen bir dağılımını sağlamak için tohumlama sonra yan yana her plaka sallayarak. Plaka kenarı etkilerini en aza indirmek için, hücrelerin 37 santigrat derece ve % 5 karbondioksit iki ila üç gün boyunca özel bir nemlendirilmiş odaya plakaları yerleştirmeden önce laminar akış kaputunun arka oda sıcaklığında 20 dakika boyunca hakemlik plakaları altında yerleşmek için izin verin. Deney günü, her kuyudan orta aspire etmek için bir tabak yıkama kullanın.
Ve uygun deneysel kuyulara uygun deneysel konsantrasyonda 30 mikrolitre lik ilgi bileşiğinde ekleyin. Bileşik işlenmiş istinat plakalarını nefes alabilen plaka mühürleriyle kapatın. Ve plakaları 30 dakika lığına hücre kültürü kuluçka makinesine geri verin.
Hücreleri bir ısı sorununa maruz bırakmak için, önce su banyosunu uygun deneysel sıcaklığa ayarlayın ve kuyuların içindeki sıcaklığı izlemek için bir termokupl termometre ile birlikte, her biri orta ve aynı hacimde aynı hacimde bir kalıp plakası içeren mühürsüz bir kukla plakayı banyoya yerleştirin. Uygun deneysel sıcaklığa ulaşıldığında, her bir deney plakasından nefes alabilen mührü çıkarın ve su banyosunda sonraki ısıtma sırasında kuyulara su sızmamasını sağlamak için plakaları sıkı yapışkan alüminyum folyo ile yeniden kapatın. Plaka çerçevesi içinde delinmiş delikleri erişilebilir tutmak.
Plakaların altından kalan havayı zorlamak için su yüzeyine doğru açılı plakaların dipleri ile, banyoya yeni bir kukla plaka ve banyo yerleştirin ve yeni kukla plaka sıcaklığını izlemeye başlayın. Plakanın eşit bir şekilde ısıtılması, istinat performansı için çok önemlidir. Altında sıkışmış hiçbir hava kabarcıkları vardır su banyosu nda plaka yerleştirmek için dikkat edin.
Üç dakika sonra, hemen kendi analiz önce beş dakika boyunca oda sıcaklığında su ikinci bir su banyosunda plakaları soğutun. Hücreleri görüntülemek için, ilk oda sıcaklığında 20 dakikalık bir kuluçka için doğrudan deneme plakaları için% 16 paraformaldehit 10 mikrolitre ekleyin. Fiksasyon döneminin sonunda hücreleri plaka yıkayucuüzerinde 300 mikrolitre PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 10 dakikalık bir kuluçka için %0,1 NP40'lık 20 mikrolitre ekleyin.
Kuluçka sonunda, gösterildiği gibi hücreleri yıkayın. Ve oda sıcaklığında bir saat için% 1 sığır serum albumin veya BSA 15 mikrolitre ile hücreleri bloke. Daha sonra, bloke serum aspire için plaka yıkayıcını kullanın ve oda sıcaklığında bir saatlik kuluçka için uygun kuyulara ilgi birincil antikor 10 mikrolitre ekleyin.
Kuluçka sonunda, her kuyuyu 300 mikrolitre PBS ile yıkayın ve hücreleri ışıktan korunan oda sıcaklığında bir saat boyunca uygun ikincil antikordan 10 mikrolitre ile etiketlayın. Hücrelerin nükleer boyama için, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca her kuyuya uygun bir nükleer boya 10 mikrolitre ekleyin. Ve pbs hücreleri gösterildiği gibi yıkayın.
Hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca her kuyuda 10 mikrolitre hücre maskesi ile etiketleyin. Ardından PBS ile son bir yıkama. Sonra her kuyuya 60 mikrolitre taze PBS dağıtın ve plakaları görüntülemeye kadar alüminyum folyo ile kapatın.
Hücreleri görüntülemek için, otomatik lazer otofokus kullanarak 10 kat hedefi altında uygun floresan kanalları kullanarak yüksek içerikli görüntüleyicide her biri için dört görüntü yakalayın ve satın alma sırasında binning uygulayın. Ardından görüntüleri meta verilerle birlikte 16 bit gri tonlama nokta-tiff dosyaları olarak saklayın. Hedef proteinde ligand bağlanması ile indüklenebilecek konformasyonel değişikliklerle antikor tanıma sı bozulmamalıdır.
Örneğin, BIRB796 uzun bir kapalı oranı vardır ve hedef nişan quantification sadece bir antijen alma adımı uygulayarak mümkündür. Pozitif ve negatif kontrol bileşikleri ile tedavi hücreler için bu temsili termal toplama eğrisi deneyi çeşitli sıcaklıklarda bileşikler ile hücrelerin tedavisinden sonra tipik protein stabilizasyon aralıkları göstermektedir. Burada tipik bir izomal doz-yanıt parmak izi deneydeneysel bileşik farklı dozlarda yanıt olarak protein stabilizasyonu temsili aralıkları göstermek için gösterilmiştir.
Hedef proteinin yeni bağlayıcılarını belirlemek için bileşik tarama için izotermal ısı zorluklarının uygulanması, hedef protein stabilizasyonunu doğrulamak için isabetlerin izotermal doz yanıtı parmak izi öncesinde, tek bir konsantrasyonda çok sayıda bileşiğin analizini sağlar. Bu prosedürü denerken, ısı mücadelesinin uzunluğu ve sıcaklığı gibi tam deneysel koşulların bileşiklerin gözlenen gücünü etkilediğini unutmamak önemlidir. Paraformaldehit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın.
Ve bu prosedürü uygularken kurumsal güvenlik yönergelerine uymak gibi önlemler her zaman alınmalıdır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, hücresel termal kayma analizi (CETSA)’nin bir mikroplate uyumlu adaptasyonunda yüksek içerikli görüntüleme kullanarak ilaç-hedef bağlanmasını ölçmek için bir protokolü detaylandırmaktadır. Bu yöntem, kimyasal biyoloji ve ilaç keşfi konularındaki önemli sorulara yanıt vermek için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kimyasal Biyoloji
- İlaç Keşfi
- Görüntüleme Teknikleri
Arka Plan
- İlaç hedef bağlanması, etkili ilaç geliştirme için esastır.
- Hücresel termal kayma analizi (CETSA), bu bağlamda değerli bir araçtır.
- Bu yöntem, görüntüleme yoluyla uzamsal lokalizasyona izin verir.
- Primer kültürler ve kokültürler de dahil olmak üzere çeşitli hücre sistemlerine uygulanabilir.
Çalışmanın Amacı
- Bir bileşiğin hedef proteine bağlanıp bağlanmadığını belirlemek.
- İlaç geliştirmede kimyasal probların geçerliliğini sağlamak.
- İlaç-hedef etkileşimleri hakkında anlamayı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Mikroplate formatında yüksek içerikli görüntüleme.
- Siyah 384-kuyuklu görüntüleme analiz plakasının hazırlanması.
- Hücre ekimi sırasında plakaları örtmek için alüminyum folyo kullanımı.
- Uygun kullanım için plakalarda delikler açma.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, ilaç-hedef bağlanmasının etkili ölçümüne izin verir.
- İlaç etkileşimlerinin uzamsal lokalizasyonunu sağlar.
- Hücre hatlarının ötesinde çeşitli hücre tiplerine uygulanabilir.
- Kimyasal probların geçerliliğini kolaylaştırır.
Sonuçlar
- Bu protokol, ilaç keşfi tekniklerinde önemli bir ilerlemedir.
- İlaç-hedef etkileşimlerini değerlendirmek için güvenilir bir yöntem sunar.
- Gelecek uygulamaları, daha karmaşık biyolojik sistemlere uzanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantifying drug-target engagement in adherent cells is a pivotal inflection point for target validation and early drug discovery. High content imaging adaptation of CETSA enables direct, modification-free assessment of compound binding, supporting predictive confidence and mechanistic de-risking in heterogeneous cell populations. This workflow advances portfolio triage by providing robust, spatially resolved engagement data at scale.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of compound-target binding in physiologically relevant adherent cells.
- Supports functional target validation without requiring protein or ligand modification.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing compound effects in heterogeneous cell populations.
- Provides quantitative engagement data to inform go/no-go decisions in discovery portfolios.
Screening & Assay Development
- Delivers high-throughput, plate-based readiness for screening compound libraries.
- Ensures assay reproducibility and standardization through automated imaging and analysis.
- Generates quantitative, spatially resolved readouts for robust compound evaluation.
- Enables scalable platform reuse across diverse cell systems, including primary and cocultures.
Translational & Preclinical Research
- Aligns compound engagement data with disease-relevant cellular contexts when using primary or coculture systems.
- Supports translational continuity by bridging discovery findings to preclinical model validation.
- Reduces biological risk by confirming target engagement in complex, heterogeneous populations.
Pipeline & Workflow Integration
This high content CETSA workflow integrates from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis testing and downstream screening.
- Discovery Biology: Provides direct evidence of target engagement, clarifying pathway relevance and reducing mechanistic ambiguity.
- Screening: Offers high-throughput, quantitative, and reproducible outputs for compound triage.
- Analytics: Enables statistical comparison of engagement across compounds, doses, and conditions.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease-relevant systems by accommodating primary and coculture models.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, modification-free platform for repeated use across programs and targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces late-stage attrition by confirming target engagement in relevant cell systems.
- Operational Value: Standardizes workflows and enables reproducible, high-throughput data generation.
- Strategic Value: Informs portfolio decisions with robust, quantitative engagement metrics.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in high content imaging and quantitative image analysis.
- Demands access to automated imaging platforms and compatible assay plates.
- Necessitates cross-team standardization of assay conditions and data analysis pipelines.
- Adaptable to various adherent cell systems, including primary and cocultures, with protocol optimization.
- Experimental parameters such as heat challenge duration and temperature must be empirically determined for each target.
