Bir Well-established organel izolasyon Kit kullanarak hızlı Lipid damlacık yalıtım Protokolü

Lipid damlacık biyolojisi araştırma arınma zorluk tarafından engel olmuştur. Ayrıca, hücresel lipid akısı incelenmesi birden fazla organel eşzamanlı arıtma gerektirir, ve basit protokoller şu anda mevcut idi. Bu tekniğin en büyük avantajı lipid damlacık arınma daha erişilebilir hale getirmektir.

Aynı anda lipid damlacıkları, endoplazmik retikulum ve tek bir örnekten lizozomizole etmek için ticari olarak kullanılabilir bir kiti modifiye ettik. Karaciğer lipid damlacık birikimi ilerleyici karaciğer hastalığına obez ve alkolik hastalar yatkınlık. Bu, lipid damlacıklarının görüşünü inert depolama bölmelerinden dinamik biyolojik olarak önemli organellere kaydırmıştır.

Başlamak için, arka-ön eksenüzerinde ötanazi farenin karın deri ve kas tabakalarını kesmek için steril forceps ve diseksiyon makas kullanın, karaciğer açığa. Karaciğeri bağırsağa bağlayan bağları kesin. Forceps kullanarak, karaciğer uzak bağırsak çekin, posterior doğru.

Karaciğeri diyaframa bağlayan bağı kesin. Sonra, karaciğer ve dorsal göğüs kafesi arasında kesilmiş, anterior posterior hareket, karaciğer serbest olana kadar. 10 mililitre soğuk 1x PBS ile karaciğeri beş santimetrelik soğuk bir Petri kabına aktarın ve karaciğeri 10 mililitre soğuk 1x PBS'de iki kez dört santigrat derecede beş dakika boyunca yıkayın.

Son yıkamadan sonra, 1x PBS dökün ve çanak içinde üç ila beş milimetrelik parçalar halinde karaciğer zar için bir boyut-10 steril cerrahi bıçak kullanın. Daha sonra doğranmış karaciğeri 10 mililitre soğuk 1x PBS ile iki kez dört santigrat derecede beş dakika yıkayın. 1x PBS decant, ve soğuk bir 45 mililitrelik Dounce homogenizer doğranmış karaciğer parçaları aktarın, tüm parçalar alt ta olmasını sağlamak.

Yedi mililitre soğuk 1x IE tampon ekleyin. Zararlı ları 20 kez yukarı ve aşağı hareket ettirerek buz üzerinde homojenize, her vuruş sırasında pestle homogenizer altına gider emin olun. Homojeni 15 mililitrelik soğuk bir santrifüj tüpe aktarın.

Homogenizer'i bir mililitre soğuk 1x IE tamponla durulayın ve homojenin geri kalanına ekleyin. Çekirdekleri çıkarmak için homojefunate'i 1,000 kez g'de 10 dakika 4 santigrat derecede yüksek kapasiteli bir santrifüjde santrifüj edin. LD kaybını önlemek için 15 mililitrelik tüpün üst kısmında toplanan herhangi bir lipid resuspended olduğundan emin olun.

Tüpün altındaki nükleer peletin bozulmadığından emin olun, lipid içeren post-nükleer supernatant'ı 50 mililitrelik taze bir soğuk santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra saflık analizi için buz üzerinde soğuk 1.7 mililitrelik mikrosantrifüj tüp için post-nükleer supernatant bir 100 mikrolitrelik aliquot aktarın. Mitokondriyi çıkarmak için, nükleer sonrası süpernatant örneğini 12,000 kez g'de 12 derece lik bir soğutuculu yüksek hızlı santrifüjde santrifüj edin.

Tüpün üst kısmında toplanan herhangi bir lipid LD kaybını önlemek için resuspended olduğundan emin olun, ve sonra 13 mililitrelik ultracentrifuge tüp post-mitokondriyal supernatant transfer. Daha sonra saflık analizi için buz üzerinde soğuk 1.7 mililitrelik mikrosantrifüj tüp post-mitokondriyal supernatant bir 100 mikrolitre aliquot aktarın. Ultrasantrifüj tüpünü, ultrasantrifüj sırasında çökmesini önlemek için soğuk 1x IE tampon ile ağzına kadar mitokondriyal supernatant ile doldurun.

Örnekleri dengeleyin ve sonra 100, 000 kez g 4 santigrat derece 60 dakika ultracentrifuge içinde santrifüj. LD tabakasını çıkarmak için tüpü 45 derecelik bir açıyla yatırın ve cam pipetle aspire edin. Peletsoğuk 1.7 mililitrelik mikrosantrifüj tüp aktardıktan sonra, saflık analizi için lipid tabakası altında post-ER supernatant 100 mikrolitre toplamak.

Herhangi bir hücre enkaz, dört santigrat derece beş dakika boyunca en yüksek hızda bir mikrocentrifuge santrifüj pelet için. Daha sonra, LD tabakasını yeniden askıya almaya yardımcı olmak için tüpü elleriyle hafifçe ısıtın ve yağ tabakası da dahil olmak üzere süpernatantı yeni bir 1.7 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bu yıkama adımlarını tekrarlayın, boruyu 2-3 kez ısıtın, ta ki pelet artık görünmez olana kadar.

Sonra, pelet içermeyen LD supernatant yıkamak için, 1.5 mililitre son hacmine 1x PBS ekleyin ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca en yüksek hızda bir mikrosantrifüj santrifüj. Lipid tabakasını rahatsız etmeden, lipid tabakasının altında bulunan bir mililitre 1x PBS'yi çıkarmak için cam bir pipet kullanın. 1x PBS bulanıklık olmadan görsel olarak saydam olana kadar LD yıkamayı dört ila beş kez tekrarlayın.

Daha sonra, lipid tabakasının altındaki tüm 1x PBS kaldırmak için bir cam pipet kullanın ve downstream analizi için ortaya çıkan saf LD fraksiyonu kullanın. Temsili 20x floresan ve brightfield LD görüntüleri hem ER kiti LD izolasyon ve sakaroz LD izolasyon yöntemleri alınmıştır, onlar iki farklı protokolleri kullanarak benzer saflıklar düşündüren, partikül madde benzer düzeylerde ortaya. Arınmayı takiben, LD trigliserid ve protein düzeyleri kolorimetrik tahliller kullanılarak ölçüldü ve veriler karaciğer ağırlığına normalleştirildi ve başlangıç materyali normalleştirildiğinde LD trigliserid ve protein verimlerinin ER kiti ve sakaroz yöntemi kullanılarak benzer olduğunu gösterdi.

LD çapları, ER kiti LD izolasyonu ve sakaroz LD izolasyonunun benzer boyutlarda KISVeLER verdiğini gösteren görüntü analiz yazılımı kullanılarak ölçüldü. LD saflığını değerlendirmek için, örnekler immünoblotting tarafından analiz edildi, ER kiti LD izolasyon ve sakaroz gradyan protokolü elde edilen LDs her ikisi de eşit saflıkta olduğunu gösteren. PLIN2, bir LD marker, ER kiti LD izolasyon PER ve sakaroz PNS dışında tüm örneklerde tespit edildi.

İmmünoblotkullanan bir ER fraksiyonunun saflık analizi, LD marker PLIN2'den arınmış olduklarını ancak ER SEC61A proteininin önemli seviyelerine sahip olduklarını göstermektedir. Lyzosome zenginleştirme kiti kullanılarak lizozomların daha fazla saflaştırılmasından sonra bir lizomal fraksiyonun saflığı da değerlendirildi. Discovery şu anda protokolümüzün en yararlı uygulamasıdır.

Saflaştırılmış organellerde lipidomik ler gerçekleştiriyoruz ve lipotokninlerin özellikle alkolik karaciğer hastalığında lipid damlacıklarında arttığını gösterdik.