Name: Bir Well-established organel izolasyon Kit kullanarak hızlı Lipid damlacık yalıtım Protokolü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Öğrenin fare karaciğerinden lipid damlacığı izolasyonu için modifiye edilmiş endoplazmik retikulum kiti kullanarak hızlı ve erişilebilir bir yöntem. Bu teknik eşzamanlı organel saflaştırması sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Abramson aile Kanser Araştırma Enstitüsü teşekkür ediyoruz. Bu eser aşağıdaki hibe tarafından desteklenir: NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, Robert Wood Johnson Vakfı, Harold Amos Tıp Fakültesi geliştirme Ödülü, 7158, IDOM DRC Pilot Ödülü P30 DK019525 (R.M.C.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (JC). Bu eser kısmen NIH P30-DK050306 tarafından desteklendi ve çekirdek tesisleri (Moleküler Patoloji ve Imaging Core, moleküler biyoloji/gen ifade çekirdek ve hücre kültür Core) ve pilot program verin. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.

Tüm deneyler ile kişisel koruyucu ekipman için biyogüvenlik düzeyi 1, önlük, eldiven ve koruyucu gözlük gibi uygun bir laboratuvar tezgah üzerinde yapılmıştır. Deneyler kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Pennsylvania Üniversitesi tarafından onaylanmış protokolleri göre yapıldı. Tüm çabaları hayvan rahatsızlık en aza indirmek için yapılmış ve hayvanlar ile insana ilişkin bakım tedavi edildi.
1. bir ER izolasyon kit kullanarak LD yalıtım
<ol><li>
Hazırlık Not: Listelenen tutarları tek 1 g fare karaciğer için uygundur.<ol>
<li>10 mL 1 x izotonik ayıklama arabelleği (IE arabellek, ER izolasyon Kit) 5 x IE arabellek 2 mL 8 mL ultrasaf su ile sulandrarak hazırlayın. Arabellek buza yerleştirerek serin.</li>
		<li>100 mL 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x 10 x PBS ultrasaf su 90 ml 10 mL sulandrarak hazırlayın. Buzda yerleştirerek sakin ol.</li>
		<li>10 mL % 5 polietilen glikol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-fenil eter (PGPE) 9.5 mL ultrasaf su 500 µL sulandrarak, PGPE hazırlayın. 1 mL şırınga viskoz olduğu gibi PGPE ölçmek için kullanın. Buzda yerleştirerek sakin ol.</li>
		<li>Buzda yerleştirerek tüm tüpler cool: 1.7 mL microcentrifuge tüpler, 15 mL santrifüj tüpleri, 50 mL yüksek hızlı santrifüj tüpleri ve 13 mL ultracentrifuge tüpleri.</li>
		<li>4 gerekli tüm santrifüjler serin ° C: bir microcentrifuge 15 mL için yüksek kapasite santrifüj tüpü 50 mL tüpler ve bir ultracentrifuge için yüksek hızlı bir santrifüj.</li>
		<li>Forseps ve diseksiyon makası tarafından ısıyla sterilize.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Doku hazırlık
	<ol>
<li>Fare servikal çıkığı gerçekleştirerek % 100 CO2 10 dk. Onayla ötenazi için dolu bir odaya yerleştirerek ötenazi.</li>
		<li>Steril forseps ve karaciğer ortaya çıkarmak için arka/ön ekseninde karın kas ve deri katmanları kesmek diseksiyon makası kullanarak.</li>
		<li>Diyafram ve bağırsak karaciğer bağlayan ligament kesti. Forseps bağırsak karaciğer ligament ortaya çıkarmak için arka doğru uzak çekmek için kullanın.</li>
		<li>Karaciğer ve dorsal göğüs kafesi arasında kesme, posterior anterior karaciğer kadar hareketli özgür oldu.</li>
		<li>Karaciğer soğuk 5 cm 10 mL soğuk 1 x PBS ile Petri kabına aktarın.</li>
		<li>Karaciğer 2 yıkama x 10 ml soğuk 1 x PBS 5 cm Petri kabına 4 ° C'de 5 min için sallanan bir platformda. 1 x PBS sonra son yıkama dökün.</li>
		<li>Bir boyut-10 steril cerrahi bıçak kullanın (5 cm Petri kabına (şekil 1A) 3-5 mm parçalara karaciğer zar için Malzemeler tablobkz:).</li>
		<li>Doğranmış karaciğer 2 yıkama x 10 mL soğuk 1 x 5 cm Petri kabına 4 ° C'de 5 min için PBS ile. Not: Lysosome yalıtımı, 0.5 g karaciğer temiz 45 mL homogenizer aktarmak ve lysosome çıkarma tarafından sağlanan yönergeleri izleyin ( Tablo reçetesigörmek) kit.</li>
		<li>1 x PBS dikkatle boşaltmak ve doğranmış karaciğer adet soğuk 45 mL Dounce homogenizer için transfer. Tüm taşlarını homogenizer altındaki gidin emin olun.</li>
		<li>7 mL soğuk 1 x IE arabelleğinden (ER izolasyon kit) ekleyin ve buz üzerinde havaneli 20 x yukarı ve aşağı hareket ettirerek homojenize. Havaneli her inme sırasında homogenizer altına gider emin olun.</li>
		<li>Homogenate (şekil 1B) soğuk 15 mL santrifüj tüpü aktarın.</li>
		<li>Durulama soğuk 1 IE arabelleğinden (ER izolasyon kit) x 1 mL ile homogenizer ve bu homogenate geri kalanına ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
LD yalıtım
	<ol>
<li>Çekirdeklerin 4 ° c (şekil 1 c) 10 dk 1000 x g de yüksek kapasite santrifüj homogenate centrifuging tarafından kaldırın.</li>
		<li>Postnuclear süpernatant (PNS) yeni, soğuk 50 mL santrifüj tüpü aktarın. LD kaybını önlemek için 15 mL tüp başında toplanan herhangi bir lipid PNS aktarmadan önce resuspended emin olun.</li>
		<li>100 µL PNS saflık analizi için aliquot alıp bir soğuk 1.7 mL microcentrifuge tüpü yerleştirin. Buza koyun.</li>
		<li>Mitokondri kaldırmak için PNS örnek, 12.000 x g de buzdolabında yüksek hızlı santrifüj 4 ° C'de 15 dakika içinde aliquot değil santrifüj kapasitesi<ol>
<li>İsteğe bağlı: için ham LD (CID) yalıtır (sitozol ve hücre zarının kirlenme) ile cam pipet kullanarak üst lipit katmanı toplamak ve 1.7 mL microcentrifuge tüp transferi. 1.4 Bölüm devam ediyor.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Postmitochondrial süpernatant (PMS) bir ultracentrifuge tüp aktarın. LD kaybını önlemek için üst kısmında toplanan herhangi bir lipid PMS aktarmadan önce resuspended emin olun.</li>
		<li>100 µL PMS saflık analizi için aliquot alıp bir soğuk 1.7 mL microcentrifuge tüpü yerleştirin. Buza koyun.</li>
		<li>Bir ultracentrifuge tüp ağzına kadar soğuk 1 tüp ultrasantrifüj sırasında çöken önlemek için IE arabellek x ile doldurun.</li>
		<li>Örnekleri denge ve onları bir ultracentrifuge 60 dk 4 ° c (şekil 1 d) için 100.000 x g de içinde santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>LD katman kaldırmak için tüp 45 ° açıyla eğilme ve Aspire edin için cam pipet kullanın. Pelet soğuk 1.7 mL microcentrifuge tüp aktarın. Not: Pelet izole ER içerir. Bu kesir aşağı ER yalıtımı için kullanma.</li>
		<li>Post-ER süpernatant (PER) altında lipit katmanı saflık analizi için 100 µL toplamak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
LD çamaşır
	<ol>
<li>1 x PBS 1.3 mL toplam hacmiyle 1.7 microcentrifuge tüp içinde toplanan LD kesir ekleyin.</li>
		<li>Girdap örnek.</li>
		<li>Bir microcentrifuge 4 ° C'de herhangi bir hücre artıkları cips için 5 min için üst hızda santrifüj kapasitesi. Tüpü yavaşça elle LD katman resuspend yardımcı olmak için sıcak. Lipid katmana yeni bir 1,7 mL microcentrifuge tüp de dahil olmak üzere süpernatant, aktarın.</li>
		<li>Adımları 1.4.1–1.4.3 tekrar 2 x-3 x, pelet görünene kadar.</li>
		<li>1 x PBS Pelet ücretsiz LD 1,5 mL nihai bir birime süpernatant ekleyin. Yıkama lipid kısmı bir microcentrifuge 4 ° C'de 5 min için üst hızda Santrifüjü tarafından</li>
		<li>1 mL 1 x PBS (altında lipit katmanı) cam pipet ile lipit katmanı bozmadan kaldırın.</li>
		<li>1.4.5 ve 1.4.6. adımları yineleyin 4 x x-5, 1 x PBS yok bulanıklık ile görsel olarak saydam olana.</li>
		<li>Tümünü Kaldır cam pipet (şekil 1E) kullanarak 1 x PBS lipid katmanın altında.</li>
		<li>Sonuç, saf LD kesir aşağı akım analizi için kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
LD protein Nefelometri bicinchoninic asit tahlil tarafından Not: LD Morfoloji değerlendirilmek için ise bir bicinchoninic asit tahlil (BCA) kullanmayın.<ol>
<li>LD % 5 PGPE 500 μL içinde resuspend.</li>
		<li>Örnekleri 95 ° C'de 5 dakika kaynatın girdap onları ve örnekleri soğuması 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>1.5.2 ek 2 x arasındaki adımları yineleyin.</li>
		<li>Örnekleri ile bir 30 5 min için solüsyon içeren temizleyicide s açma/kapama döngüsü, Orta yoğunluk.</li>
		<li>Örnekleri BCA tahlil tarafından protein konsantrasyonu tüm saflık analizi örnekleri ve LD kesir ölçerek normalleştirmek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Sükroz yoğunluk gradient kullanarak LD yalıtım
<ol><li>
Hazırlık
	<ol>
<li>TE arabellek (10 mM Tris-[pH 7.4], HCl 1 mM EDTA [pH 8.0]) 200 mL olun. Buzda yerleştirerek sakin ol.</li>
		<li>100 mL % 60'ı (w/v) Sükroz çözeltisi TE arabellekte 60 g Sükroz son hacim için 100 mL getiren TE arabellekte çözülerek olun. Buzda yerleştirerek sakin ol.</li>
		<li>6 mL % 40 (w/v) Sükroz çözeltisi % 60 Sükroz 4 mL 2 mL TE arabelleği ekleyerek olun. Buzda yerleştirerek sakin ol.</li>
		<li>6 mL % 25 (w/v) Sükroz çözeltisi TE arabellek için 3,5 mL 2.5 mL % 60 Sükroz ekleyerek getirin. Buzda yerleştirerek sakin ol.</li>
		<li>4 mL % 10 (w/v) Sükroz çözeltisi TE arabellek için 3,3 mL % 60 Sükroz 0.7 mL ekleyerek getirin. Buzda yerleştirerek sakin ol.</li>
		<li>Fosfataz ve proteaz inhibitörü çözüm 10 mL 10 mL TE arabelleği fosfataz ve proteaz inhibitörleri bir tablet ekleyerek getirin.</li>
		<li>Doku homogenate arabellek 4 mL fosfataz ve proteaz inhibitörü çözeltisi 50 mL % 60 Sükroz stok çözeltisi ekleyerek hazırlayın. Buzda yerleştirerek sakin ol.</li>
		<li>Bindirme arabellek TE arabellek için 50 mL 2 mL fosfataz ve proteaz inhibitörü çözeltisi ekleyerek hazırlayın. Buzda yerleştirerek sakin ol.</li>
		<li>100 mL 1 x PBS 10 x PBS ultrasaf su 90 ml 10 mL sulandrarak hazırlayın. Buzda yerleştirerek sakin ol.</li>
		<li>10 mL % 5'lik hazırlamak 9.5 mL ultrasaf su 500 µL sulandrarak, PGPE tarafından PGPE. 1 mL şırınga viskoz olduğu gibi PGPE ölçmek için kullanın. Buzda yerleştirerek sakin ol.</li>
		<li>Aşağıdaki santrifüj tüpleri buza yerleştirerek cool: 1.7 mL microcentrifuge tüpler, 15 mL santrifüj tüpleri, 50 mL yüksek hızlı santrifüj tüpleri ve 13 mL ultracentrifuge tüpleri.</li>
		<li>4 gerekli santrifüjler serin ° c a microcentrifuge, yüksek kapasite santrifüj (15 mL tüpler için) (50 mL tüpler için) yüksek hızlı bir santrifüj ve bir ultracentrifuge.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Doku hazırlık
	<ol>
<li>Doku homojenizasyon için hazırlamak için adımlar 1.2.1–1.2.9 kullanın.</li>
		<li>7 mL soğuk doku homogenate arabellek ekleyin ve havaneli 20 x yukarı ve aşağı hareket ettirerek buza lunaparkçı. İlk beş vuruş sırasında havan tokmağı homogenizer altına gider emin olun.</li>
		<li>Homogenate soğuk 15 mL santrifüj tüpü aktarın.</li>
		<li>Homogenizer 1 mL soğuk doku homogenate arabelleği ile durulayın ve önceden kullanılan 15 mL santrifüj tüpü için transfer.</li>
		<li>Homogenate hacmi getirmek doku homogenate arabellek ile ilâ 10 mL.</li>
		<li>1000 x g de yüksek kapasite santrifüj 4 ° C'de 10 dakika için örnekte santrifüj kapasitesi</li>
		<li>Transfer süpernatant 8 mL 50 mL santrifüj tüpü.</li>
		<li>Saflık analizi için PNS örnek olarak, kalan süpernatant 100 µL aktarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sükroz gradyan
	<ol>
<li>PNS 45 ° açıyla 8 mL içeren 50 mL santrifüj tüpü yatırmak. 6 mL % 40 Sükroz çözeltisi, iki aşamada ayrı kalmak sağlamak dikkatle ekleyin.</li>
		<li>Benzer şekilde, yavaş yavaş 6 mL % 25 Sükroz çözeltisi ekleyin; daha sonra 4 mL % 10 Sükroz çözeltisi ekleyin; son olarak, bindirme arabellek 8 mL ekleyin.</li>
		<li>30 dk için yüksek hızlı bir santrifüj 30.000 x g 4 ° c de örnekte santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>1.7 mL microcentrifuge Tube LDs içeren üst tabaka aktarın.</li>
		<li>LD yıkanmasında 1.4 bölümündeki adımları izleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Lipid+Droplets+from+Cells+by+Density+Gradient+Centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation.</a> Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+lipid+droplets+from+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolating lipid droplets from multiple species.</a> Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).</li>
<li>Gao, Q., Goodman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+droplet-a+well-connected+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The lipid droplet-a well-connected organelle.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49(2015).</li>
<li>Correnti, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+and+C2+ceramide+activate+fatty+acid+oxidation+in+human+hepatoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12923(2018).</li>
<li>Williams, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+ceramide+synthase+6+in+mouse+and+human+alcoholic+steatosis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis.</a> FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).</li>
<li>Carr, R. M., Ahima, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+lipid+droplet+proteins+in+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases.</a> Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).</li>
<li>Carr, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perilipin+Staining+Distinguishes+Between+Steatosis+and+Nonalcoholic%5BTitle%5D)+AND+%22Steatohepatitis+in+Adults+and+Children.+Clinical+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic.</a> Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).</li>
<li>Carr, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+TIP47+improves+hepatic+steatosis+and+glucose+homeostasis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Regulatory%2C+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).</li>
<li>Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+perilipin+2+prevents+hepatic+steatosis%2C+glucose+intolerance+and+ceramide+accumulation+in+alcohol-fed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice.</a> PLoS One. 9 (5), e97118(2014).</li>
<li>Tsai, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+constitutive+lipid+droplet+protein+PLIN2+regulates+autophagy+in+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver.</a> Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).</li>
<li>Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).</li>
<li>Liu, K., Czaja, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lipid+stores+and+metabolism+by+lipophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy.</a> Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).</li>
<li>Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cellular+lipid+droplets%3A+two+purification+techniques+starting+from+yeast+cells+and+human+placentas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e509814(2014).</li>
<li>Sato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+lipid+droplet+proteins+in+hepatoma+cell+lines+expressing+hepatitis+C+virus+core+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein.</a> Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).</li>
<li>Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R. 3rd, McManaman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+reveal+a+link+between+the+endoplasmic+reticulum+and+lipid+secretory+mechanisms+in+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells.</a> Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologically+and+Functionally+Distinct+Lipid+Droplet+Subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations.</a> Scientific Reports. 6, 29539(2016).</li>
</ol>

Dr. Carr müdahale ilaç araştırma desteği alır.

Hepatik LD Biyoloji giderek kritik bir regülatör hepatosellüler Fizyoloji sağlığı ve hastalıkları olarak kabul. Olarak iyi niyetli organelleri, LDs dinamiktir, diğer Hücresel yapıları ile etkileşim ve biyoaktif bileşenler lipid ve glukoz homeostazı yer onları içinde içerir. Sükroz degrade LD yalıtım için rutin olarak kullanılan ve Müfettişler LD yapısı çalışma sağlar, ancak çok sayıda arabellekleri yapmak onlara gerektirir. Biz piyasada bulunan bir ER izolasyon kit kullanımı tandem yalıtım ER ve lysosome, ama sadece LD y...

LDs sitozol en ökaryotik hücre ve bazı prokaryotik hücreler1,2,3biyoaktif organelleri vardır. LD çekirdek Trigliserid (TG) ve kolesterol esterleri gibi nötr lipitler oluşur. Ayrıca Seramidler, biyoaktif lipidler hücresel sinyal yolları4,5' te yer alan içerirler. LDs Fosfolipid monolayer tarafından çevrili ve perilipin protein perilipin 2 (PLIN2) ve 3 (PLIN3)1,5,6dahil olmak üzere proteinler ile kaplı. Ayrıca lipogenic enzimler, lipaz ve alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı, alkolik karaciğer hastalığı ve hepatit C3,5 de dahil olmak üzere birkaç hepatik steatotic hastalıklar için bağlı membran kaçakçılığı proteinler mevcuttur ,6,7,8,9,10.
LDs acil servis dış membran form ve serbest yağ asitleri ER elde edilen11' den kaynaklı yeni sentezlenmiş TG içeren düşünülmektedir. Havuza alınan lipidler bud, ancak, bilinmeyen kalır bağlı kalan veya ER6,11yalıtım LDS teknik olarak zor ER ücretsiz yapma, güvenliğe. Serbest yağ asidi LDS'den enerji üretim veya membran sentezi için sağlamak için yüzey lipazlar eylem tarafından özgür olmak. Ayrıca, LDs lipophagy bir düzenleyici mekanizma olarak ve serbest yağ asitleri12üretmek için düşebilir.
ER ve organellerin yanı sıra, diğer organelleri vardır — mitokondri, endosomes, tanımladıkları ve plazma zarı gibi — LDs11yakın ilişki içinde bulunur. Bu sıkı çok eşlilik bir saf LD çekimi gerçekleştirmek zorlaştırır. Ancak, nötr lipitler doğuştan gelen düşük yoğunluklu Santrifüjü5üzerinden avantaj alınabilir.
Geleneksel olarak, LDs Sükroz yoğunluk gradient1,5,13kullanarak izole edilmiştir. Ancak, bu yöntemleri diğer organelleri yalıtmak için tasarlanmış değil. Ayrıca, onlar reaktifler zaman alıcı hazırlık gerektirir. Bu iletişim kuralı bir piyasada bulunan ER yalıtım adapte LD yalıtım için izin vermek için (bkz. Tablo reçetesi) kit. Biz paketi tarafından sağlanan ayıklama arabellek LD yalıtım adım ekleme kullanın. Ayrıca, protokol ER ve LDs yaşam döngüsünün daha kapsamlı bir resim için izin aynı örnekleri kullanarak lizozomal yalıtım için de kullanılabilir. Bu yeni yöntem doğrulamak için LD verim, Morfoloji, boyutu ve saflık tahlil. Biz burada sunulan bu LD yalıtım için Sükroz degrade kullanan yaygın olarak kullanılan bir iletişim kuralı ile elde edilen sonuçlar karşılaştırın.
Biz bir 10 - için 12-hafta-yaşlı kullanılan, su ücretsiz erişim ile 16 h (5 Açıkhava 9: sabah LD yalıtım kez gıda kaldırmayı) için 20 g kadın C57BL/6 fare oruç tuttum. TG için tipik verim 0.6 mg/g karaciğer için LD protein, 0.25 mg/g karaciğer mi var... Bu ~ 10 immunoblots tarafından SDS sayfası için yeterli malzeme sağlar. Ayrıntılar kullanılan reaktifler aşağıda Protokolü ve bir tek 1 g karaciğer için uygun bir protokol. Sükroz degrade yalıtım Protokolü Sato14 ve Wu15uyarlanmıştır.

<table><tbody><tr><td>BioExpress Vorteks Karıştırıcı</td><td></td><td>GeneMate S-3200-1</td><td>Vorteks Karıştırıcı</td></tr><tr><td>Santrifüj 54242 R</td><td>Eppendorf</td><td>54242 R Soğutmalı</td><td>Sayaç Mikrosantrifüj Rotor: FA-45-24-11</td></tr><tr><td>Santrifüj Sorvall RC6 +</td> <td>Thermo Scientific</td><td>RC6 +</td> <td>Soğutmalı Yüksek Hızlı Santrifüj Rotor: F21S-8x50y</td></tr><tr><td>Santrifüj Sorvall Legend RT +</td> <td>Thermo Scientific</td><td>Legend RT +</td> <td>Soğutmalı Yüksek Kapasiteli Santrifüj Rotor: 75006445 Kova: 75006441</td></tr><tr><td>cOmplete Proteaz İnhibitörü Kokteyl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>04 693 116 001</td><td>Proteaz İnhibitör Tabletleri</td></tr><tr><td>Diagenode Bioruptur UCD-200</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200</td><td>Sonication Sistemi</td></tr><tr><td>Dounce Doku Öğütücü (45 mL)</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td>Gevşek havaneli kullanın</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu (1x)</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>Endoplazmik Retikulum İzolasyon Kiti</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ER0100</td><td>ER kiti için Ekstraksiyon: İçindekiler: İzotonik Ekstraksiyon Tamponu 5X 100 mL Hipotonik Ekstraksiyon Tamponu 10 mL Kalsiyum klorür, 2.5 M çözelti 5 mL OptiPrep Yoğunluk Gradyan Ortamı 100 mL Künt Burunlu İğne 1 adet.</td></tr><tr><td>Floresan uyarım için harici ışık kaynağı</td><td>Leica</td><td>Leica EL6000</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1758</td><td>Hidroklorik Asit</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Görüntü Analiz Yazılımı</td></tr><tr><td>Ters Modülasyonlu Kontrast Mikroskobu</td><td>Leica Leica</td><td>DM IRB</td><td></td></tr><tr><td>Dokular ve Kültürlenmiş Hücreler için Lizozom Zenginleştirme Kiti</td><td>Thermo Fisher Lizozom</td><td>İzolasyon Mikroskobu için</td>Bilimsel <td>89839</td></tr><tr><td></td><td>Kamera Qimaging</td><td>QICAM hızlı 1394</td><td></td></tr><tr><td>Optima XL-100K Ultrasantrifüj</td><td>Beckman-Coulter</td><td>XL-100K</td><td>Ultrasantrifüj Rotor: SW41Ti</td></tr><tr><td>Pastör Pipetleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-042817</td> Petri Kabı 5 cm Fisher Scientific FB0875713A <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Test Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>04 906 845 001</td><td>Fosfataz İnhibior Tabletler</td></tr><tr><td>Steril Cerrahi Bıçak #10</td><td>Pioneer</td><td>S2646</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td>Kristal/Sertifikalı ACS</td></tr><tr><td>Trigliserit Liquicolor</td><td>Kiti Stanbio&nbsp;</td><td>2200-225</td><td>Kolorimetrik Trigliserit kiti</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>TE tamponu</td></tr><tr><td>için Triton X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151-100</td><td>%5, Polietilen glikol p- (1,1,3,3-tetrametilbutil) -fenil eter, Protein Lizis Reaktifi</td></tr><tr><td>UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0)</td> <td>TE tamponu için</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-038</td></tr></tbody></table>

bir well-established organel izolasyon kit kullanarak hızlı lipid damlacık yalıtım protokolü

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Lipid damlacıkları (LDs) biyoaktif organelleri en ökaryotik ve bazı prokaryotik hücreler sitozol içinde bulundu vardır. LDs nötr lipitler fosfolipitler ve proteinler monolayer ile kaplı oluşur. Seramidler ve proteinlerinin hepatik LD lipidler hepatik yağlanma neden çeşitli hastalıklarda karıştığı. Önceki yöntemler LD yalıtım için kurulmuş olsa da, onlar reaktifler zaman alıcı bir hazırlık gerektirir ve birden çok hücre altı bölmeleri yalıtım için tasarlanmamıştır. Yalıtım LDs, endoplazmik retikulum (ER) ve organellerin tek fare karaciğer üzerinden etkinleştirmek için yeni bir iletişim kuralı kurmak istedi.
Ayrıca, tüm reaktifler burada sunulan protokolünde kullanılan piyasada bulunan ve LD saflık ödün vermeden en az reaktif hazırlık gerektirir. Burada veri standart Sükroz degrade iletişim kuralı, bu yeni iletişim kuralına karşılaştırma karşılaştırılabilir saflık, morfoloji ve verim gösteren mevcut. Ayrıca, biz ER ve aynı örnek kullanarak organellerin oluşumu ve lipidler ve onların ilişkili proteinler hücre içi akı gösteren ayrıntılı bilgilere sağlayan ortadan kaldırabilirsiniz.

Biz LD yalıtım ER kiti ile yaklaşık 30 fareler üzerinde yapılan ve yaklaşık 40 fareler üzerinde Sükroz yalıtım Protokolü izleyenler ile sonuçları karşılaştırılır. Her iki protokoller için tipik bildirilen bulgulardir. Fareler gecede LD verimi artırmak için su, ücretsiz erişim ile oruç. Sükroz degrade kullanarak LD yalıtım ER kiti LD yalıtım protokolü ile paralel olarak çalıştırıldı. PNS, PMS, örnekleri başına, CLDs ve LDs ER kiti LD yalıtım Protokolü toplanan. İş akışı kısıtlaması nedeniy...

Bu iletişim kuralı bir roman yöntemi lipid damlacık tecrit ve arıtma fare karaciğer, bir iyi kurulmuş endoplazmik retikulum izolasyon kit kullanarak üzerinden kurar.

Bir Well-established organel izolasyon Kit kullanarak hızlı Lipid damlacık yalıtım Protokolü

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

Lipid damlacık biyolojisi araştırma arınma zorluk tarafından engel olmuştur. Ayrıca, hücresel lipid akısı incelenmesi birden fazla organel eşzamanlı arıtma gerektirir, ve basit protokoller şu anda mevcut idi. Bu tekniğin en büyük avantajı lipid damlacık arınma daha erişilebilir hale getirmektir.Aynı anda lipid damlacıkları, endoplazmik retikulum ve tek bir örnekten lizozomizole etmek için ticari olarak kullanılabilir bir kiti modifiye ettik. Karaciğer lipid damlacık birikimi ilerleyici karaciğer hastalığına obez ve alkolik hastalar yatkınlık. Bu, lipid damlacıklarının görüşünü inert depolama bölmelerinden dinamik biyolojik olarak önemli organellere kaydırmıştır.Başlamak için, arka-ön eksenüzerinde ötanazi farenin karın deri ve kas tabakalarını kesmek için steril forceps ve diseksiyon makas kullanın, karaciğer açığa. Karaciğeri bağırsağa bağlayan bağları kesin. Forceps kullanarak, karaciğer uzak bağırsak çekin, posterior doğru.Karaciğeri diyaframa bağlayan bağı kesin. Sonra, karaciğer ve dorsal göğüs kafesi arasında kesilmiş, anterior posterior hareket, karaciğer serbest olana kadar. 10 mililitre soğuk 1x PBS ile karaciğeri beş santimetrelik soğuk bir Petri kabına aktarın ve karaciğeri 10 mililitre soğuk 1x PBS'de iki kez dört santigrat derecede beş dakika boyunca yıkayın.Son yıkamadan sonra, 1x PBS dökün ve çanak içinde üç ila beş milimetrelik parçalar halinde karaciğer zar için bir boyut-10 steril cerrahi bıçak kullanın. Daha sonra doğranmış karaciğeri 10 mililitre soğuk 1x PBS ile iki kez dört santigrat derecede beş dakika yıkayın. 1x PBS decant, ve soğuk bir 45 mililitrelik Dounce homogenizer doğranmış karaciğer parçaları aktarın, tüm parçalar alt ta olmasını sağlamak.Yedi mililitre soğuk 1x IE tampon ekleyin. Zararlı ları 20 kez yukarı ve aşağı hareket ettirerek buz üzerinde homojenize, her vuruş sırasında pestle homogenizer altına gider emin olun. Homojeni 15 mililitrelik soğuk bir santrifüj tüpe aktarın.Homogenizer'i bir mililitre soğuk 1x IE tamponla durulayın ve homojenin geri kalanına ekleyin. Çekirdekleri çıkarmak için homojefunate'i 1,000 kez g'de 10 dakika 4 santigrat derecede yüksek kapasiteli bir santrifüjde santrifüj edin. LD kaybını önlemek için 15 mililitrelik tüpün üst kısmında toplanan herhangi bir lipid resuspended olduğundan emin olun.Tüpün altındaki nükleer peletin bozulmadığından emin olun, lipid içeren post-nükleer supernatant'ı 50 mililitrelik taze bir soğuk santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra saflık analizi için buz üzerinde soğuk 1.7 mililitrelik mikrosantrifüj tüp için post-nükleer supernatant bir 100 mikrolitrelik aliquot aktarın. Mitokondriyi çıkarmak için, nükleer sonrası süpernatant örneğini 12,000 kez g'de 12 derece lik bir soğutuculu yüksek hızlı santrifüjde santrifüj edin.Tüpün üst kısmında toplanan herhangi bir lipid LD kaybını önlemek için resuspended olduğundan emin olun, ve sonra 13 mililitrelik ultracentrifuge tüp post-mitokondriyal supernatant transfer. Daha sonra saflık analizi için buz üzerinde soğuk 1.7 mililitrelik mikrosantrifüj tüp post-mitokondriyal supernatant bir 100 mikrolitre aliquot aktarın. Ultrasantrifüj tüpünü, ultrasantrifüj sırasında çökmesini önlemek için soğuk 1x IE tampon ile ağzına kadar mitokondriyal supernatant ile doldurun.Örnekleri dengeleyin ve sonra 100, 000 kez g 4 santigrat derece 60 dakika ultracentrifuge içinde santrifüj. LD tabakasını çıkarmak için tüpü 45 derecelik bir açıyla yatırın ve cam pipetle aspire edin. Peletsoğuk 1.7 mililitrelik mikrosantrifüj tüp aktardıktan sonra, saflık analizi için lipid tabakası altında post-ER supernatant 100 mikrolitre toplamak.Herhangi bir hücre enkaz, dört santigrat derece beş dakika boyunca en yüksek hızda bir mikrocentrifuge santrifüj pelet için. Daha sonra, LD tabakasını yeniden askıya almaya yardımcı olmak için tüpü elleriyle hafifçe ısıtın ve yağ tabakası da dahil olmak üzere süpernatantı yeni bir 1.7 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bu yıkama adımlarını tekrarlayın, boruyu 2-3 kez ısıtın, ta ki pelet artık görünmez olana kadar.Sonra, pelet içermeyen LD supernatant yıkamak için, 1.5 mililitre son hacmine 1x PBS ekleyin ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca en yüksek hızda bir mikrosantrifüj santrifüj. Lipid tabakasını rahatsız etmeden, lipid tabakasının altında bulunan bir mililitre 1x PBS'yi çıkarmak için cam bir pipet kullanın. 1x PBS bulanıklık olmadan görsel olarak saydam olana kadar LD yıkamayı dört ila beş kez tekrarlayın.Daha sonra, lipid tabakasının altındaki tüm 1x PBS kaldırmak için bir cam pipet kullanın ve downstream analizi için ortaya çıkan saf LD fraksiyonu kullanın. Temsili 20x floresan ve brightfield LD görüntüleri hem ER kiti LD izolasyon ve sakaroz LD izolasyon yöntemleri alınmıştır, onlar iki farklı protokolleri kullanarak benzer saflıklar düşündüren, partikül madde benzer düzeylerde ortaya. Arınmayı takiben, LD trigliserid ve protein düzeyleri kolorimetrik tahliller kullanılarak ölçüldü ve veriler karaciğer ağırlığına normalleştirildi ve başlangıç materyali normalleştirildiğinde LD trigliserid ve protein verimlerinin ER kiti ve sakaroz yöntemi kullanılarak benzer olduğunu gösterdi.LD çapları, ER kiti LD izolasyonu ve sakaroz LD izolasyonunun benzer boyutlarda KISVeLER verdiğini gösteren görüntü analiz yazılımı kullanılarak ölçüldü. LD saflığını değerlendirmek için, örnekler immünoblotting tarafından analiz edildi, ER kiti LD izolasyon ve sakaroz gradyan protokolü elde edilen LDs her ikisi de eşit saflıkta olduğunu gösteren. PLIN2, bir LD marker, ER kiti LD izolasyon PER ve sakaroz PNS dışında tüm örneklerde tespit edildi.İmmünoblotkullanan bir ER fraksiyonunun saflık analizi, LD marker PLIN2'den arınmış olduklarını ancak ER SEC61A proteininin önemli seviyelerine sahip olduklarını göstermektedir. Lyzosome zenginleştirme kiti kullanılarak lizozomların daha fazla saflaştırılmasından sonra bir lizomal fraksiyonun saflığı da değerlendirildi. Discovery şu anda protokolümüzün en yararlı uygulamasıdır.Saflaştırılmış organellerde lipidomik ler gerçekleştiriyoruz ve lipotokninlerin özellikle alkolik karaciğer hastalığında lipid damlacıklarında arttığını gösterdik.

rapid-lipid-droplet-isolation-protocol-using-well-established

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, desteklenen bir lipid çift tabakası (SLB) üzerinde doğal öldürücü (NK) hücrelerde immünolojik sinaps oluşumunu görselleştirmek için bir tekniği göstermektedir. SLB ilk olarak florofor etiketli bir NK hücre aktive edici reseptör ligandı ile etiketlenir, ardından NK hücreleri ile inkübasyon yapılır. Daha sonra, hücreler polimerize aktin ve perforin pozitif litik granüller için boyanır. Bu yaklaşım, uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskobu kullanılarak sinaps oluşumunun...

Desteklenen Bir Lipid Çift Tabakası Üzerinde NK Hücre İmmünolojik Sinaps Oluşumunun Süper Çözünürlüklü Görüntülenmesi

Yama-kelepçe elektrofizyoloji ile kombine edildiğinde tanımlanan kompozisyon dev lipozomlar içine fonksiyonel membran proteinleri yeniden kurgulamak güçlü bir yaklaşımdır. Ancak, geleneksel dev lipozom üretim protein istikrar ile uyumsuz olabilir. Biz saf lipidler veya iyon kanalları içeren küçük lipozomlar gelen dev lipozomlar üretmek için protokolleri tarif.

Görüntüleme ve Patch-Kelepçe Elektrofizyoloji için dev Liposome Hazırlık

: 1) hücresel lipid damlacıkları izole maya hücreleri ve 2) insan plasenta sunulmuştur için iki teknikleri. Her iki prosedürlerinin merkezinde damlacıkları ihtiva eden elde edilen yüzer tabaka, hali hazırda, göz ile görselleştirilmiştir ekstre edilmiş ve saflık için Western Blot analizi ile tayin edilebilir yoğunluk gradyan santrifüj vardır.

Hücresel Lipid damlacıklar İzolasyonu: Maya Hücreleri ve insan plasentası itibaren iki Arıtma Teknikleri

MikroRNA'lar önemli bir düzenleyici rol oynar ve çeşitli insan hastalıkları için yeni bir terapötik hedef olarak ortaya çıkmaktadır. MiRNA'ların yüksek yoğunluklu lipoprotein taşınmaktadır gösterilmiştir. Hızla insan plazmasından MiRNA analizi için uygun, saflaştırılmış HDL izole edilmesi için basit bir yöntem geliştirdik.

Yüksek Saf Yüksek Yoğunluklu Lipoprotein gelen miRNA Yüksek koymak Through-İzolasyon için hızlı ve basitleştirilmiş Yöntemi

Burada, tek bir molekül duyarlılık ve ~ 15 msn zaman çözünürlüğü ile polarize TIRFM kullanılarak lipozomlar ve mikroakışkan kanallarda desteklenen iki katmanlı arasındaki tek tuzak aracılı füzyon olayları tespit etmek için bir protokol mevcut. Lipid ve çözünür kargo sürümü aynı anda tespit edilebilir. Lipozom boyutu, lipit yayınım ve füzyon gözenek özellikleri ölçülmüştür.

Polarize TIRF Mikroskopi tarafından İzlenen mikroakışkan Akış Hücredeki Gergin Desteklenen Bilayers Tek Proteoliposomes ve tuzak aracılı Fusion

Bu protokol, yüksek yoğunluklu lipoprotein küçük RNA'ların izolasyonunu ve miktar tayinini açıklar.

Küçük RNA miktarının belirlenmesi Sigara kodlama için yüksek yoğunluklu lipoproteinler izolasyonu

Lipid damlacıkları Hepatit C virüsü (HCV), dahil olmak üzere çeşitli patojenlere replikasyonu için önemli organellerdir. Bu ilişkili proteinler kantitatif kütle spektrometresi için lipid damlacıkları izole edilmesi için bir yöntem tarif; bu tür virüs enfeksiyonu, çevresel stres veya ilaç tedavisi gibi koşullar, çeşitli altında kullanılabilir.

Kantitatif Kütle Spektrometresi Analiz lipid Damlacık izolasyonu

Çeşitli fotosentetik organizmalarla ilişkili plastoglobül lipid damlacıklarının izolasyonu için hızlı ve etkili bir protokol sunulmaktadır. İzole plastoglobüllerin başarılı bir şekilde hazırlanması, proteomik ve lipidomik analizler gibi ayrıntılı moleküler araştırmalardan önce gelen çok önemli bir ilk adımdır.

Plastoglobül Lipid Damlacığı İzolasyonu Bitki Yaprağı Dokusu ve Siyanobakterilerden

Membran proteinlerinin yeniden yapılandırılması ve enzimlerin ve diğer suda çözünür bileşenlerin mikrometre altı ve mikrometre boyutundaki lipid veziküllerinde kapsüllenmesi için bir protokol sunuyoruz.

Nano ve Mikrometre Boyutlu Veziküllerde Denge Dışı Metabolik Ağların İnşası

Lipofaji, lipid damlacıklarının bozulmasını içeren seçici bir otofaji şeklidir. Bu süreçteki işlev bozuklukları kanser gelişimi ile ilişkilidir. Bununla birlikte, kesin mekanizmalar henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Bu protokol, otofaji, lipid metabolizması ve kanser ilerlemesi arasındaki etkileşimi daha iyi anlamak için kantitatif görüntüleme yaklaşımlarını açıklar.

Lipofaji Yoluyla Lipid Damlacık Katabolizmasının Düzenlenmesinin Araştırılması

Öğrenin fare karaciğerinden lipid damlacığı izolasyonu için modifiye edilmiş endoplazmik retikulum kiti kullanarak hızlı ve erişilebilir bir yöntem. Bu teknik eşzamanlı organel saflaştırması sağlar.

Bir Well-established organel izolasyon Kit kullanarak hızlı Lipid damlacık yalıtım Protokolü

Daha fazla video keşfet