Yüksek Saf Yüksek Yoğunluklu Lipoprotein gelen miRNA Yüksek koymak Through-İzolasyon için hızlı ve basitleştirilmiş Yöntemi

Bu yöntemin genel amacı, mikro RNA analizi için insan kan plazmasından saflaştırılmış yüksek yoğunluklu lipoproteinleri hızlı bir şekilde izole etmek için basitleştirilmiş bir yaklaşım geliştirmektir. Bu yöntem, yüksek yoğunluklu lipoproteinlerin moleküler mekanizmalarını ve koruyucu işlevlerini anlamak gibi hepatoloji ve kardiyolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin bazı temel avantajları, saflaştırılmış HDL mikro RNA'nın kısa bir süre içinde daha az hacimli numuneden önceden izole edilmiş olmasıdır.

Bu protokolde açlık periferik venöz kan örneklerinden protokol metninde anlatıldığı gibi çoklu santrifüj adımları ile plazma elde edilir. Plazmayı yeni bir tüpe aktarın. Ve üreticinin talimatlarına göre oda sıcaklığında bir dansitometre kullanarak plazmanın yoğunluğunu ölçün.

Bir mikro RNA kontaminasyonu kaynağını temsil eden dolaşımdaki eksozomları çıkarmak için, bir mililitre plazmaya 252 mikrolitre eksozom çökeltme çözeltisi ekleyin. Ve dört santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Daha sonra eksozomları çıkarmak için karışımı 30 dakika santrifüjleyin.

Elde edilen süpernatanın bir mililitresini, bir sonraki video segmentinde gösterildiği gibi, daha sonraki işlemler için polikarbonat kalın duvarlı bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın. Yüksek yoğunluklu lipoproteinlerin veya HDL'nin izolasyonu, çok düşük yoğunluklu lipoproteinlerin veya VLDL, düşük yoğunluklu lipoproteinlerin veya LDL ve HDL'nin sıralı izolasyonunu içeren üç aşamalı bir yoğunluk gradyan ultrasantrifüjleme protokolü ile gerçekleştirilir. A, B ve C olmak üzere üç farklı yoğunluk çözeltisi, protokol metninde açıklanan prosedür izlenerek taze olarak hazırlanmalıdır.

6.5 mililitrelik polikarbonat kalın duvarlı bir ultrasantrifüj tüpünde, bir mililitre plazma ve 200 mikrolitre nükleaz içermeyen Yağ Kırmızısı 7B'yi karıştırın. Ardından, karışımın üzerine dikkatlice beş mililitre A çözeltisi koyun. Gerekirse, her tüpün ağırlığını dengelemek için çözelti A'nın üzerine ilave Yağ Kırmızısı 7B ekleyin.

Tüpleri önceden soğutulmuş bir rotora yükleyin. Rotoru bir zemin santrifüjüne yerleştirin ve iki saat santrifüjleyin. Koşunun sonunda iki katman görünür olmalıdır.

VLDL fraksiyonunu temsil eden üst tabakanın 1,5 mililitresini çıkarın. Ve dört santigrat derece saklayın. Dört mililitreyi tüpün altından yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarmak için bir pipet kullanın.

Bu, LDL ve HDL fraksiyonunu içerir. Bir sonraki adım LDL'nin izolasyonudur. LDL ve HDL fraksiyonunu içeren tüpe iki mililitre çözelti B ve 100 mikrolitre nükleaz içermeyen Yağ Kırmızı 7B'yi karıştırın.

Beş ila on dakika buza koyun. Karıştırılan numunenin 6,5 mililitresini polikarbonat kalın duvarlı bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın. Tüpü önceden soğutulmuş bir rotora yükleyin ve üç saat boyunca santrifüjleyin.

Santrifüjleme tamamlandığında, LDL fraksiyonunu temsil eden üst tabakanın 1,5 mililitresini çıkarın ve dört santigrat derecede tutun. HDL fraksiyonunu içeren tüpün altından dört mililitreyi 50 mililitrelik steril bir tüpe aktarın. Üçüncü adım, HDL'nin izolasyonudur.

HDL fraksiyonunu içeren tüpe iki mililitre C çözeltisi, 100 mikrolitre nükleaz içermeyen Yağ Kırmızısı 7B ve 15 mikrolitre% 98 beta merkaptoetanol karıştırın. Karışımın yoğunluğunu kontrol edin. Tüpü önceden soğutulmuş bir rotora yükleyin ve üç saat boyunca santrifüjleyin.

Bundan sonra, HDL fraksiyonunu temsil eden üst tabakanın iki mililitresini çıkarın ve dört santigrat derecede tutun. Sonraki agaroz jel elektroforezi ve PCR ile etkileşimi önlemek için lipoprotein fraksiyonlarından aşırı tuz çıkarılmalıdır. Bu videoda, sadece HDL fraksiyonu için tuzdan arındırma ve konsantrasyon gösterilecektir.

HDL fraksiyonuna 13 mililitre soğuk PBS ekleyin ve moleküler ağırlık kesimi 10K olan bir santrifüj filtre cihazına aktarın. 30 dakika boyunca 4000 kez g ve dört santigrat derecede sallanan bir kova rotorunda santrifüjleyin. HDL fraksiyonunu ikinci kez tuzdan arındırın, 13 mililitre soğuk PBS kullanın ve daha önce olduğu gibi santrifüjleyin.

Santrifüjlemeden sonra, çözünen maddeler içeren lipoproteini çıkarın ve dört santigrat derecede tutun. İzole edilen lipoproteinlerin kalitesini ve saflığını değerlendirmek için, boyut referansı olarak dahil edilen insan lipoprotein standartları ile agaroz jel elektroforezi gerçekleştirildi. Beta merkaptoetanol içermeyen bir izolasyondan elde edilen temsili sonuçlar, HDL fraksiyonunun herhangi bir VLDL kontaminasyonundan yoksun olduğunu ve tipik alfa hareketliliği sergilediğini gösterdi.

Bununla birlikte, HDL fraksiyonu ayrıca lipoproteinlerle kontaminasyona bağlı olarak beta hareketliliğinin izlerini gösterir. Son santrifüjleme adımı sırasında çözelti C'ye beta merkaptoetanol eklenmesi, tüm kirletici lipoproteinleri HDL fraksiyonundan etkili bir şekilde uzaklaştırır. İnsan HDL'sinde taşınan ve bu yöntemle saflaştırılan mikro RNA'ların niceliklerinin belirlenmesinin fizibilitesini göstermek için, iki farklı mikro RNA, gerçek zamanlı kantitatif PCR ile amplifiye edildi.

Bu amplifikasyon grafiklerinde, yatay çizgiler algılama eşiğini temsil eder. Altı örnekten elde edilen izole HDL'den elde edilen temsili gerçek zamanlı PCR verileri, her iki mikro RNA'nın tutarlı bir şekilde tespit edildiğini gösterdi. Son olarak, erime eğrisi analizleri, önceki PCR'deki spesifik amplifikasyon ile tutarlı olarak, her iki mikro RNA için belirgin bir tek tepe noktasını açıkça göstermektedir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde yapılırsa, tuz giderme prosedürleriyle birlikte dokuz saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, her zaman dört ila sekiz santigrat derecede çalışmak önemlidir. Ve ultrasantrifüjlemeden önce her bir lipoprotein fraksiyonunun yoğunluğunu ayarlamak için.

Bu prosedürü takiben, HDL'nin saflığı gibi ek soruları yanıtlamak için elektron mikroskobu gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, metabolik sendrom alanındaki araştırmacıların, yağlı karaciğer hastalığı olduğundan şüphelenilen insanlarda HDL ile ilişkili mikro RNA'ları biyo belirteçler olarak keşfetmelerine izin verecektir. HDL'nin işlevini ve hücre biyolojisini değiştirdiği moleküler mekanizmaları daha iyi anlamak için de kullanılabilir.