Name: Yüksek Saf Yüksek Yoğunluklu Lipoprotein gelen miRNA Yüksek koymak Through-İzolasyon için hızlı ve basitleştirilmiş Yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Keşfedin, insan kan plazmasından yüksek yoğunluklu lipoprotein izolasyonu için hızlı ve basitleştirilmiş bir yöntem. Bu teknik, mikroRNA analizi ve kardiyovasküler sağlık araştırmalarında HDL'nin koruyucu işlevlerini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, tamamen veya kısmen, NIH Hibeleri R01 AA 020758-04, U01DK 061731-13 ve T32 DK 007150-38 tarafından AJS'ye ve T32 DK 007150-38'den AA'ya desteklenmiştir. Bu orijinal bir çalışmadır ve yayınlanmak üzere başka bir yerde değerlendirilmemektedir.

Kan Örneklerinin 1. Koleksiyonu <ol><li> Antekübital fossa önemli bir ven standart olarak damar delinerek (diğer pıhtılaşma önleyiciler göre birçok avantajı vardır) pıhtılaşma önleyici etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ihtiva eden 10 ml&#39;lik plastik tüplere periferal venöz kan örnekleri açlık toplayın. </li><li> kırmızı kan hücreleri ve RNA az miktarda serbest plazma elde etmek için bir masaüstü santrifüj 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 1600 x g&#39;de, kan örnekleri santrifüj. </li><li> Sıralı, sırasıyla, kalan hücre debrisini uzaklaştırmak için WBC ve Trombositler ve 15 dakika daha sonra ilave çıkarmak için 10 dakika boyunca bir sallanan kepçeli rotor içinde 3.000 g (4 ° C) süpernatant santrifüj. </li><li> üretim talimatlarına göre oda sıcaklığında bir dansitometresi kullanılarak plazma yoğunluğunu ölçün. Not: yoğunluk ayarı (d = 1.023 g / ml),% 0.9 tuzlu su çözeltisi ile eksozomlann çıkarılması ancak önceden yoğunluk gradyan ultrasantrifüjü sonrası gerekebilir. </li></ol&gt; Plazma 2. Exosome Kaldırma <ol><li> HDL benzer bir yoğunluğa sahip dolaşan eksozomlar çıkarın ve miRNA 3 sayısal olarak önemli bir kaynağını temsil etmektedir. <ol><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca kuluçkalandı ve ardından 1 mL plazmaya 252 ul eksozom çökelme çözeltisi ekleyerek bu fazlası. eksozomlar üzerinden pelet için 4 ° C sıcaklıkta 1500 g&#39;de 30 dakika boyunca karışımın santrifüjlenir. </li><li> HDL, yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüjleme ile daha fazla işlenmek üzere bir polikarbonat kalın duvarlı bir ultra santrifüj tüpüne elde edilen süpernatan transferi 1 mi izole etmek için (aşağı bakınız). </li></ol></li></ol> 3. Yoğunluk Gradient Ultrasantrifügasyon (Şekil 1). <ol><li> HDL sabit açılı rotor 448.811 x G çalışan ve 8 ° C, sırasıyla bir kat ultrasantrifüjdeki kullanan bir 3 aşamalı bir süreci kullanmak ayırmak için. </li><li> Üç farklı yoğunluk çözeltileri, sırasıyla, her izolasyonu için taze hazırlayın. <ol><li> Çözelti A Hazırlama (VLDL izolasyonu, d = 1.006 g / ml) 11.4 gr NaCI (NaCI: 0.195 mol) eritilmesi ile otoklava damıtılmış su 1000 ml, 0.1 g EDTA * 2Na, 1 ml 1 N NaOH. Daha sonra otoklav damıtılmış su ilave 3 ilave edin. </li><li> 100 mi A çözeltisi (NaCI 0.195 mol, NaBr 2.44 mol), 25.2 gr, NaBr ekleyerek Çözelti B hazırlanması (LDL izolasyonu, d = 1.182 g / ml). </li><li> Çözelti A, 100 ml (NaCI 0.195 mol, NaBr 7.7 mol) 78.8 g, NaBr karıştırılarak (d = 1.470 g / ml HDL izolasyonunu) Çözüm C hazırlayın. Bir dansitometresi kullanılarak oda sıcaklığında uygun yoğunluğu onaylayın. sonraki kullanıma kadar 4 ° C &#39;de, tüm çözümler tutun. </li></ol></li></ol> VLDL 4. İzolasyonu <ol><li> Plazma 1 ml (ortalama yoğunluğu = 1.023 g / ml), 6.5 mi polikarbonat kalın duvarlı bir ultra santrifüj tüpüne Yağ Kırmızı 7B ve nükleaz bilgilerini 200 ul karıştırın. </li><li> Sonra dikkatlice karışımın üstüne çözelti A 5 ml katman. Gerekirse, çözüm A t üstünde ek Yağ Kırmızı 7B ekleyino Her tüpün ağırlığını dengeleyecek. - 2 saat (5 hızlanma) için santrifüj (yavaşlama - 7). Not: Santrifüj sırasında, lipoproteinler kendi denge yoğunluk bölgelerinde bir bant olarak biriktirilir. </li><li> çalışma sonunda 2 kat gözlemlemek. 4 ° C &#39;de üst tabaka ve mağaza temsil VLDL fraksiyonunun 1.5 mL çıkarın. </li><li> Son olarak, LDL içeren tüpün tabanından bir pipet aktarım işlemlerinin 4 ml kullanılarak, HDL, LDL izolasyonu için yeni bir polikarbonat tüpüne albumin ve yağ asidi fraksiyonu. </li></ol> LDL 5. İzolasyon <ol><li> sırasıyla LDL ve HDL fraksiyonu (bölüm 4) ihtiva eden bir tüpe B çözeltisi ve 100 ul nükleaz serbest yağlı kırmızı 7B 2 ml karıştırın. </li><li> Ardından 3 saat (hızlanma 9, yavaşlama 7) için dışarı santrifüj. Daha sonra, üst tabaka temsil LDL fraksiyonu 1.5 mL çıkarın ve -80 ° C &#39;de 4 ° C ya da mağaza tutun. Son olarak, HDL içeren tüpün tabanından 4 ml aktarmakYeni bir polikarbonat tüp kısmı. </li></ol> HDL&#39;nin 6. İzolasyonu <ol><li> 2 solüsyonu C ml, 100 ul nükleaz serbest yağ Kırmızı 7B sırasıyla, HDL fraksiyonu ihtiva eden bir tüpe% 98 β-merkaptoetanol 15 ul karıştırın. </li><li> 3 saat (hızlanma 9, yavaşlama 7) için santrifüj. Bundan sonra üst tabaka temsil HDL fraksiyonu 2 ml çıkarın ve -80 ° C &#39;de 4 ° C&#39; de devam veya mağaza ya da. </li></ol> 7. Tuzdan arındırma ve Lipoprotein Fraksiyonlarının Konsantrasyon <ol><li> sonraki agaroz jel elektroforezi ve PCR ile bir girişimi engellemek için, üreticinin talimatlarında belirtildiği şekilde (LDL / HDL için VLDL ve 10K tüp 3K tüp) uygun molekül ağırlığı kesme ile santrifüj filtre cihazları kullanılarak yoğunluk gradyan Ultrasantrifügasyon sırasında eklenen aşırı tuz kaldırmak. <ol><li> Kısaca, soğuk bir PBS (137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4) içinde 2.5 ml eklenmesinden sonra SantrifüjGE tüm VLDL fraksiyon toplandı-sırasında yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüjleme 4 ° C&#39;de bir sallanma kepçe rotor kullanılarak 60 dakika boyunca. </li><li> 30 dakika her biri için 10 ml buz gibi soğuk PBS ile iki kez, LDL fraksiyonu desalt. Daha sonra, HDL fraksiyonu tuzdan arındırma iki kez 13 ml buz gibi soğuk PBS kullanın. yüksek PBS hacmi agaroz jel elektroforezi ile mobiliteyi geliştirmek için gereklidir. Santrifüj işleminden sonra, lipoprotein içeren çözünmüş çıkarın ve 4 ° C&#39;de tutun veya -80 ° C&#39;de saklanır. </li></ol></li></ol> 8. Agaroz Jel Elektroforez <ol><li> şu şekilde üreticinin talimatlarına küçük değişikliklerle kiti kullanılarak lipoprotein agaroz jel elektroforezi perfrom. NOT: Bu adım konsantre lipoprotein örneklerinin kalite ve saflık değerlendirmek için sadece budur. <ol><li> Kısaca, yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüjleme ile tuzdan arındırılmış lipoprotein fraksiyonu 6 ul elde edilir ve bir ön dökme lipoprotein jel üzerine yüklenir. İnsan lipop kullanınboyutu, referans olarak VLDL, LDL ve HDL için rotein standartları. Rep Hazırlık tampon kullanarak 60 dakika boyunca 100 V oda sıcaklığında elektroforez yürütmek. </li><li> 10 dakika için jel Kuru ve yağlı kırmızı 7B ile oda sıcaklığında 10 dakika süre ile boyanır. 5 dakika boyunca tekrar metanol-su 75:25 (v / v) ve kuru bir karışımı içinde jel destain. </li></ol></li></ol> 9. RNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması <ol><li> Serum / plazma MiRNA izolasyon ve saflaştırma kiti kullanılarak saflaştırılmış insan HDL ile miRNA&#39;nın izole perfrom. <ol><li> Kısaca, bir vortexer ile karıştırın ve daha sonra nükleoprotein kompleksleri ve RNases inaktivasyonu tam ayrılmasını sağlamak üzere, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca kuluçkaya yatırılır, saflaştırılmış HDL 200 ul RNA liziz reaktifi 1 ml. </li><li> (1.6 x 10 8 kopya / ml cel-miR-39) karışım içine daha sonra sentetik Caenorhabditis elegans microRNA 3.5 ul başak. Daha sonra, üreticinin talimatlarına uygun olarak bir RNA özütleme gerçekleştirmek. </li></ol></li><li> cevap verecek gerçekleştirinüreticinin talimatlarına göre uzaklaştırma spin kolonların ile ekstre-miRNA üzerinde. Bir spectrophorometer ile saflaştırılmış HDL gelen miRNA konsantrasyonu ölçün. NOT: Spin sütunlarından miRNA sıyrılması RNaz içermeyen su 16 ul kullandı. </li></ol> 10. Ters Transkripsiyon (RT-PCR) <ol><li> HDL&#39;den miRNA&#39;nın 100 ng izole sentetik miRNA (Cel-miR-39) ve ters transkripsiyon kiti kullanılarak ve imalatçının talimatlarına göre bir 20 ul reaksiyon hacmi içinde, ters kopyalanmış ile arttı. </li><li> Şablon miRNA (NTC) olmadan ve ters transkriptaz enzim karışımı (NRT) olmadan uygun kontroller gerçekleştirin. </li></ol> 11. Real-time PCR (QRT-PCR) <ol><li> cDNA 2 seyreltme, 10 ul PCR karışımı, 2 ul genel primer 2 MiRNA primerler ul 4 ul RNaz içermeyen su bir 1: 2 ul 20 ul bir toplam hacim içinde gerçek-zamanlı PCR perfrom. </li><li> Reacti çalıştırın15 saniye ve 30 saniye boyunca 55 ° C ve 30, 70 ° C de uzatma aşaması 94 ° C&#39;de 45 döngü, 15 dakika boyunca 95 ° C&#39;de 96 oyuklu plakalar, içeri üç kez tüm reaksiyonlar perfrom s.ec . </li><li> Sonraki üreticinin talimatlarına göre sentetik temizlik gene normale döndükten sonra 2 -ΔΔ Ct yöntemini kullanarak miRNA calcuate göreceli miktarları. </li></ol>

<ol><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li>
<li>Arroyo, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argonaute2+complexes+carry+a+population+of+circulating+microRNAs+independent+of+vesicles+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 5003-5008 (2011).</li>
<li>Vickers, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+are+transported+in+plasma+and+delivered+to+recipient+cells+by+high-density+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins.</a> Nat Cell Biol. 13 (4), 423-433 (2011).</li>
<li>Wagner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+levels+and+cellular+transfer+of+circulating+lipoprotein-bound+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of levels and cellular transfer of circulating lipoprotein-bound microRNAs.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 1392-1400 (2013).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+185%2C+96%2C+and+223+repress+selective+high-density+lipoprotein+cholesterol+uptake+through+posttranscriptional+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs 185, 96, and 223 repress selective high-density lipoprotein cholesterol uptake through posttranscriptional inhibition.</a> Mol Cell Biol. 33 (10), 1956-1964 (2013).</li>
<li>Rayner, K. J., Moore, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+control+of+high-density+lipoprotein+metabolism+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA control of high-density lipoprotein metabolism and function.</a> Circ Res. 114 (1), 183-192 (2014).</li>
<li>Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+endosomal-derived+vesicles+shipping+extracellular+messages%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosomes: endosomal-derived vesicles shipping extracellular messages.</a> Curr Opin Cell Biol. 16 (4), 415-421 (2004).</li>
<li>Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+plasma+lipoproteins+by+density-gradient+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation.</a> Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).</li>
<li>Foreman, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+human+serum+lipoproteins+by+single-spin+gradient+ultracentrifugation%3A+quantification+of+apolipoproteins+B+and+A-1+and+lipid+components%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Fractionation of human serum lipoproteins by single-spin gradient ultracentrifugation: quantification of apolipoproteins B and A-1 and lipid components.</a> J Lipid Res. 18, 759-767 (1977).</li>
<li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+LDL-+and+HDL-cholesterol+determined+by+ultracentrifugation+and+HPLC%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Serum LDL- and HDL-cholesterol determined by ultracentrifugation and HPLC.</a> J Lipid Res. 52, 383-388 (2011).</li>
<li>Tong, H., Knapp, H. R., VanRollings, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((low+temperature+flotation+method+to+rapidly+isolate+lipoproteins+from+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">low temperature flotation method to rapidly isolate lipoproteins from plasma.</a> J Lipid Res. 39, 1696-1704 (1998).</li>
<li>Fless, G. M., ZumMallen, M. E., Scanu, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+properties+of+apolipoprotein+%28a%29+and+lipoprotein+%28a-%29+derived+from+the+dissociation+of+human+plasma+lipoprotein+%28a%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Physicochemical properties of apolipoprotein (a) and lipoprotein (a-) derived from the dissociation of human plasma lipoprotein (a).</a> J Biol Chem. 261, 8712-8718 (1986).</li>
<li>Brownie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elimination+of+primer-dimer+accumulation+in+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The elimination of primer-dimer accumulation in PCR.</a> Nucleic Acids Res. 25, 3235-3241 (1997).</li>
<li>Alton, E., Inyoul, L., Leroy, H., David, G., Kai, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+microRNA%3A+a+new+source+of+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular microRNA: a new source of biomarkers.</a> Mutat Res. 717 (1-2), 85-90 (2011).</li>
<li>Stefanie, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+biomarker+profiling+with+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cancer biomarker profiling with microRNAs.</a> Nature Biotechnology. 26, 400-401 (2008).</li>
<li>Prasun, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+as+promising+biomarkers+in+cancer+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarker+Research%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs as promising biomarkers in cancer diagnostics.</a> Biomarker Research. 2 (19), (2014).</li>
<li>Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+novel+biomarkers+and+extracellular+communicators+in+cardiovascular+disease%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease?</a> Circ Res. 110, 483-495 (2012).</li>
<li>Jonathan, S., Martin, S., Eric, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJonathan%2C+S+%22miRNA+profiling+from+blood+-challenges+and+recommendations%22">miRNA profiling from blood -challenges and recommendations</a>. , 
 <a target="_blank" href="www.qiagen.com">www.qiagen.com</a> (2015).</li>
<li>Francesco, M., Paola, D. C., Anna, T., Jesper, T., Sergio, A., Riccardo, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+circulating+microRNA+expression+data+obtained+by+quantitative+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR.</a> Brief Bioinform. 3, 1-9 (2015).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%2C+novel+biomarkers+of+acute+myocardial+infarction%3A+a+systemic+review%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Emerg+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs, novel biomarkers of acute myocardial infarction: a systemic review.</a> World J Emerg Med. 3, 257-260 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

kandan yeni biyomarkerlerin tanımlanması çeşitli hastalıkların klinik tanı ve prognoz yardımcı olacaktır. MikroRNA&#39;lar biyomarkerların tüm niteliklere sahip olduğu bilinen ve çeşitli çalışmalarla 14-17 de gösterilmiştir. Bu çalışmada, plazma HDL Mirna izole etmek için hızlı ve basit bir kolay bir yöntem gösterilmiştir. VLDL, LDL ve HDL izolasyonu geleneksel yoğunluk gradyanı, ultra-santrifüj yöntemi plazma doğru örnekleme, tampon çözeltisi tam bir şekilde hazırlanması, yoğunluk ve taban lipoprotein f...

MicroRNA'lar, yüksek oranda korunmuş ve belirli hedef haberci RNA'ları parçalayarak veya baskılayarak çeşitli biyolojik süreçlerin düzenlenmesinde kilit oyuncular olarak kabul edilen endojen, kodlamayan küçük RNA türleridir1. MiRNA'lar hücre içi olarak hareket ettikleri için, doku kaynaklı biyobelirteçler olarak keşfedilmişlerdir ve bu da bu miRNA'nın dokuya özgü işlevlerinin keşfedilmesine yol açmıştır. Bununla birlikte, miRNA'lar hücre dışı olarak ya proteinlerle ilişkili olarak ya da onları hücre dışıRNazlar 2 tarafından bozulmaya karşı etkili bir şekilde koruyabilen eksozomlarda/mikro veziküllerde bulunur. Daha yeni çalışmalar, HDL'nin koruyucu etkisinin, kolesterol akışını teşvik etme kabiliyeti ile yakından bağlantılı olmayabileceğini, daha ziyade, özellikle dolaşımdaki bir miRNA taşıyıcısı olarak, kolesterol olmayan yüküyle yakından bağlantılı olabileceğini göstermiştir 3, 4. Bu miRNA'lar sadece lipid metabolizmasını modüle etmekle kalmaz, aynı zamanda HDL-miRNA kompleksinin 5, 6 anti-inflamatuar, antioksidan ve antitrombotik etkileri ile de ilişkilidir.
HDL partiküllerinde taşınan miRNA'ların rolünü daha fazla araştırmak için, klinik rutinde kullanılmak üzere izole edilmiş yüksek oranda saflaştırılmış HDL'den miRNA ekstraksiyonu için basit ve kolay bir protokol oluşturulmalıdır. HDL'yi izole etmek için çok sayıda yöntem tanımlanmıştır. Bu yöntemler ya çok zaman alıcıdır ya da numune havuzu, izole lipoproteinlerin tuzdan arındırılması için kapsamlı diyaliz gerektirebilecek büyük hacimli plazma gerektirir ve sırasıyla bir miRNA kaynağı olarak eksozomları tamamen çıkarmazlar3. Burada, daha büyük ölçekte küçük hacimli kan örnekleri kullanarak miRNA'yı yüksek oranda saflaştırılmış HDL'den izole edebilen basit ve hızlı bir yöntemi açıklıyoruz. Bu yöntemin, dolaşımdaki miRNA'ların rolüne ve özellikle HDL'nin çeşitli hücreler ve organlar arasındaki iletişimi kolaylaştırmadaki rolüne ilişkin araştırmaları teşvik etmek için iyi bir referans görevi görebileceğine inanıyoruz.

<table><tbody><tr><td>Plastik Vacutainer Lavanta K2EDTA tüpleri&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>366643</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R&nbsp;</td><td></td><td></td>75004261</tr><tr><td>Densito 30PX dansitometre</td><td>Mettler Toledo</td><td>MT51324450</td><td></td></tr><tr><td>ExoQuick çözümü&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>4484451</td><td></td></tr><tr><td>Polikarbonat kalın duvarlı ultrasantrifüj tüpü</td><td>Thermo Scientific</td><td>O3237</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall WX100 ultrasantrifüj ve nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>46902</td><td></td></tr><tr><td>Yağ Kırmızı 7B&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201618</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Santrifüj filtre cihazları 10K</td><td>Millipore UFC901008</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-santrifüj filtre cihazları 3K</td><td>Millipore</td><td>UFC800308</td><td></td></tr><tr><td>QuickGel Lipo kiti&nbsp;</td><td>Helena Laboratuvarları&nbsp;</td><td>3344,3544T</td><td></td></tr><tr><td>VLDL, LDL ve HDL LipoTrol için insan lipoprotein standartları</td><td>; Helena Laboratories</td><td>5069</td><td></td></tr><tr><td>Rep Hazırlık tamponu&nbsp;</td><td>Helena Laboratuvarları&nbsp;</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute spin kolonları&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 analizörü</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miScript II RT Kiti&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Touch gerçek zamanlı PCR tespit sistemi</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plazma Kiti</td><td>QIAGEN</td><td>217184</td><td></td></tr><tr><td>miScript Primer Testleri</td><td>QIAGEN</td><td>141078139</td><td></td></tr><tr><td>miScript SYBR Yeşil PCR Kiti&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>218073</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plazma Spike-In Kontrolü</td><td>QIAGEN</td><td>219610</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>480878 0.20 & # 181; M steril şırınga filtresi</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>Z227536</td><td></td></tr></tbody></table>

yüksek saf yüksek yoğunluklu lipoprotein gelen mirna yüksek koymak through-İzolasyon için hızlı ve basitleştirilmiş yöntemi

Fast and Simplified Method for High Through-put Isolation of miRNA from Highly Purified High Density Lipoprotein

Küçük kodlamayan RNA'lar (miRNA'lar), metabolik sendromlar da dahil olmak üzere çeşitli insan hastalıklarında rol oynamıştır. Tanı ve prognoz için biyobelirteç olarak kullanılabilirler veya sırasıyla ilaç geliştirme için hedef olarak hizmet edebilirler. Son zamanlarda, miRNA'ların lipoproteinlerde, özellikle yüksek yoğunluklu lipoproteinlerde (HDL) taşındığı ve alım için alıcı hücrelere iletildiği gösterilmiştir. Bu, miRNA'ların, gen ekspresyonunun düzenlenmesinin yanı sıra hücre-hücre iletişimi ve organlar arasındaki karışma için haberci yoluyla hücresel ve organ fonksiyonunda kritik ve önemli bir rol oynama olasılığını artırır. Saflaştırılmış HDL'den miRNA izolasyonu için mevcut yöntemler, büyük ölçekte küçük numuneler kullanıldığında pratik değildir. Bu, büyük ölçüde lipoprotein izolasyonu için kullanılan zaman alıcı ve zahmetli yöntemlerden kaynaklanmaktadır. Plazma örneklerinden miRNA analizine uygun saflaştırılmış HDL'yi hızlı bir şekilde izole etmek için basitleştirilmiş bir yaklaşım geliştirdik. Bu yöntem, miRNA'ların sağlık ve hastalıktaki rolüne ilişkin araştırmaları kolaylaştırmalı ve özellikle HDL'ye atfedilen ters kolesterol taşınmasının dışındaki çeşitli biyolojik işlevler hakkında yeni bilgiler sağlamalıdır. Ayrıca, HDL'de bulunan miRNA türleri, çeşitli hastalıkların teşhisi için klinik biyobelirteçler hakkında değerli bilgiler sağlayabilir.

Eksozomlann Cerrahisi Sonrası Yüksek Yoğunluklu Lipoprotein İzolasyonu Yüksek derecede saflaştırılmış HDL gelen miRNA edinmek için miRNA kontaminasyon 7 kaynağı temsil eksozomlar kaldırmak için gereklidir. Bu ticari olarak temin edilebilir kit ile yoğunluk gradyan ultrasantrifüjü önce yapıldı. Pratik amaçlar için ticari şirket tarafından geliştirilen bir üç adım standart yoğunluk degrade Ultrasantrifügasyon protokolü (Şekil 1)</...

MikroRNA&#39;lar önemli bir düzenleyici rol oynar ve çeşitli insan hastalıkları için yeni bir terapötik hedef olarak ortaya çıkmaktadır. MiRNA&#39;ların yüksek yoğunluklu lipoprotein taşınmaktadır gösterilmiştir. Hızla insan plazmasından MiRNA analizi için uygun, saflaştırılmış HDL izole edilmesi için basit bir yöntem geliştirdik.

Yüksek Saf Yüksek Yoğunluklu Lipoprotein gelen miRNA Yüksek koymak Through-İzolasyon için hızlı ve basitleştirilmiş Yöntemi

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for ...

Bu yöntemin genel amacı, mikro RNA analizi için insan kan plazmasından saflaştırılmış yüksek yoğunluklu lipoproteinleri hızla izole etmek üzere basitleştirilmiş bir yaklaşım geliştirmektir. Bu yöntem, yüksek yoğunluklu lipoproteinlerin moleküler mekanizmalarının ve koruyucu işlevlerinin anlaşılması gibi hepatoloji ve kardiyoloji alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajlarından bazıları, saflaştırılmış HDL mikro RNA'ların kısa bir süre içinde daha düşük örnek hacimlerinden önceden izole edilmiş olarak elde edilmesidir.Bu protokolde, plazma, protokol metninde açıklandığı üzere çoklu santrifüj adımlarıyla aç karnına alınan periferik venöz kan örneklerinden elde edilir. Plazmayı yeni bir tüpe aktarın. Ardından, üretici talimatlarına uygun olarak oda sıcaklığında bir densitometre kullanarak plazmanın yoğunluğunu ölçün.mikro RNA kontaminasyonu kaynağını temsil eden dolaşımdaki eksozomları uzaklaştırmak için, 1 mL plazmaya 252 µL eksozom çöktürme solüsyonu ekleyin. Ardından 4 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Son olarak, eksozomları çöktürmek için karışımı 30 dakika boyunca santrifüjleyin.Bir sonraki video bölümünde gösterildiği gibi, el

fast-simplified-method-for-high-through-put-isolation-mirna-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada örnek sınırlı miktarda çalışma, özellikle microRNA (miRNA) ekspresyon düzeyleri için bir maliyet ve zaman etkili yüksek verimli bir tarama aracı olarak mikroakışkan platformu ile birlikte optimize edilmiş bir multiplex ters transkriptaz kantitatif PCR (QRT PCR) protokolü açıklamak.

Yüksek Verimli MicroRNA Profil: Optimize edilmiş, Multiplex QRT-PCR Fluidigm Dinamik ArrayTM IFCS Nanoliter Ölçeğinde

Bu videoda, organik ekstraksiyon kullanılarak kolorektal kanser hastalarının plazma örneklerinden dolaşımdaki mikroRNA'nın ekstraksiyonu ve ardından cam elyaf kolon zenginleştirme işlemi açıklanmaktadır. miRNA'lar serum ve plazma gibi biyolojik sıvılarda stabildir, bu da onları kanser teşhisi, prognozu ve tedavi kararı verme ve izleme için ideal dolaşımdaki biyobelirteçler haline getirir. Bu yöntem, hastalarda klinik sonuçları tahmin edebilen yeni dolaşımdaki biyobelirteçlerin tanımlanmasına...

Dolaşımdaki miRNA Ekstraksiyonu: Organik Ekstraksiyon ve Küçük RNA Zenginleştirme Yoluyla Plazma Örneklerinden miRNA'yı İzole Etmek İçin Bir Yöntem

Exosomes istikrarlı microRNA (miRNA'lar) varlığı biyolojik olarak ve terapötik müdahale için bir yol olarak potansiyel programı için, hücreler arası iletişim yeni bir mod olarak büyük ilgi üretti. Burada taşınmaları miRNAs tespit etmek kantitatif PCR tarafından takip edilir ve kan kültür ortamından saflaştırılması exosome göstermektedir.

Kan ve Kültür Medya türetilen Exosomes saflaştırılması ve microRNA Profil

Bu protokol, insan serumundan küçük RNA'ların ekstre edilmesi için bir yöntem tarif eder. Biz DNA dizileri kullanmak için kanser serumdan microRNA izole ve aynı zamanda singleplex kantitatif PCR için bu yöntemi kullandık. Protokol yüksek kalitede RNA elde edildi modifikasyonlarla fenol ve guanidinyum tiosiyanat reaktifler kullanır.

Insan serumundan küçük kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar izolasyonu

MicroRNA'lar (miRNA'lar), yaygın olarak korunan bir düzenleyici molekül sınıfıdır. Burada, iki güçlü ligasyon adımına ve ardından yüksek verimli dizilemeye dayanan bir miRNA klonlama yöntemini açıklıyoruz. Yöntemimiz, miRNA'ların genom çapında doğru bir şekilde kantitasyonuna izin verir.

Yüksek Verim Dizilimine tarafından MicroRNA ölçümü için Küçük RNA molekülleri, yüksek Verimli ligasyonu

Safra sıvısı, potansiyel olarak önemli biyobelirteçler içeren hücre dışı veziküller/eksozomlar için değerli bir kaynaktır. Bu protokol, miRNA profillemesi de dahil olmak üzere daha ileri analizler için eksozomları insan safrasından izole etmek için sağlam bir yöntemi temsil eder.

İzolasyon ve profil MicroRNA içeren İnsan Bile dan ekzozomlar

Bu protokol, yüksek yoğunluklu lipoprotein küçük RNA'ların izolasyonunu ve miktar tayinini açıklar.

Küçük RNA miktarının belirlenmesi Sigara kodlama için yüksek yoğunluklu lipoproteinler izolasyonu

Bu iletişim kuralı bir roman yöntemi lipid damlacık tecrit ve arıtma fare karaciğer, bir iyi kurulmuş endoplazmik retikulum izolasyon kit kullanarak üzerinden kurar.

Bir Well-established organel izolasyon Kit kullanarak hızlı Lipid damlacık yalıtım Protokolü

Burada, lipoprotein parçacıklarının yerel Micro-RNA içeriğinin (mutlak/göreceli) belirlenmesi için nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyon tabanlı protokol sunulur. Buna ek olarak, Mikro-RNA seviyesini artırmak için bir yöntem, hem de lipoprotein parçacıkları hücresel alımını oranını belirlemek için bir yöntem gösterilmiştir.

MicroRNA ile yerli lipoprotein parçacıkları zenginleştirme ve onların mutlak/bağıl microRNA Içerik ve onların hücresel transfer hızı sonraki belirlenmesi

Burada, küçük RNA'ları yalıtmak, mikroRNA'lar için zenginleştirmek ve yüksek iş elde etme sıralaması için numune hazırlamak için adım adım bir strateji tanımlıyoruz. Daha sonra açık kaynak araçlarını kullanarak sıra okumaları nasıl işleyip mikroRNA'lara hizalayan açıklarız.

MikroRNA'ları Yalıtmak ve Sıralamak ve Açık Kaynak Araçlarını Kullanarak Analiz Etmek Için Komple Bir Boru Hattı

Plazma lipoproteinlerinin analizi için çeşitli yöntemler kullanılmıştır; ancak, ultrasantrifüjleme hala en popüler ve güvenilir yöntemlerden biridir. Burada, sıralı yoğunluklu ultrasantrifüjasyon kullanarak lipoproteinlerin plazmadan nasıl izole edilmesi ve apolipoproteinlerin hem tanı hem de araştırma amacıyla nasıl analiz edilmesi ile ilgili bir yöntem açıklıyoruz.

Plazma Lipoproteinlerinin Ultracentrifugation ile İzolasyonu ve Analizi

Keşfedin, insan kan plazmasından yüksek yoğunluklu lipoprotein izolasyonu için hızlı ve basitleştirilmiş bir yöntem. Bu teknik, mikroRNA analizi ve kardiyovasküler sağlık araştırmalarında HDL'nin koruyucu işlevlerini anlamaya yardımcı olur.

Yüksek Saf Yüksek Yoğunluklu Lipoprotein gelen miRNA Yüksek koymak Through-İzolasyon için hızlı ve basitleştirilmiş Yöntemi

Daha fazla video keşfet