Yüksek Saf Yüksek Yoğunluklu Lipoprotein gelen miRNA Yüksek koymak Through-İzolasyon için hızlı ve basitleştirilmiş Yöntemi

Bu yöntemin genel amacı, mikro RNA analizi için insan kan plazmasından saflaştırılmış yüksek yoğunluklu lipoproteinleri hızla izole etmek üzere basitleştirilmiş bir yaklaşım geliştirmektir. Bu yöntem, yüksek yoğunluklu lipoproteinlerin moleküler mekanizmalarının ve koruyucu işlevlerinin anlaşılması gibi hepatoloji ve kardiyoloji alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajlarından bazıları, saflaştırılmış HDL mikro RNA'ların kısa bir süre içinde daha düşük örnek hacimlerinden önceden izole edilmiş olarak elde edilmesidir.

Bu protokolde, plazma, protokol metninde açıklandığı üzere çoklu santrifüj adımlarıyla aç karnına alınan periferik venöz kan örneklerinden elde edilir. Plazmayı yeni bir tüpe aktarın. Ardından, üretici talimatlarına uygun olarak oda sıcaklığında bir densitometre kullanarak plazmanın yoğunluğunu ölçün.

mikro RNA kontaminasyonu kaynağını temsil eden dolaşımdaki eksozomları uzaklaştırmak için, 1 mL plazmaya 252 µL eksozom çöktürme solüsyonu ekleyin. Ardından 4 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Son olarak, eksozomları çöktürmek için karışımı 30 dakika boyunca santrifüjleyin.

Bir sonraki video bölümünde gösterildiği gibi, elde edilen süpernatantın bir mililitresini daha ileri işlemler için polikarbonat kalın duvarlı bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın. Yüksek yoğunluklu lipoproteinlerin (HDL) izolasyonu; çok düşük yoğunluklu lipoproteinlerin (VLDL), düşük yoğunluklu lipoproteinlerin (LDL) ve HDL'nin ardışık olarak izole edilmesini içeren üç aşamalı bir yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüjasyon protokolü ile gerçekleştirilir. Üç farklı yoğunluk çözeltisi (A, B ve C), protokol metninde açıklanan prosedür takip edilerek taze olarak hazırlanmalıdır.

6,5 mililitrelik polikarbonat kalın duvarlı bir ultrasantrifüj tüpünde, bir mililitre plazma ve 200 mikrolitre nükleaz içermeyen Fat Red 7B'yi karıştırın. Ardından, beş mililitre çözelti A'yı dikkatlice karışımın üzerine katman olarak ekleyin. Gerekirse, her tüpün ağırlığını dengelemek için çözelti A'nın üzerine ek Fat Red 7B ekleyin.

Tüpleri önceden soğutulmuş bir rotora yerleştirin. Rotoru bir masaüstü santrifüje yerleştirin ve iki saat boyunca santrifüjleyin. İşlem sonunda iki tabaka görülmelidir.

VLDL fraksiyonunu temsil eden üst katmandan 1.5 milliliters çekin ve bunu dört degrees Celsius sıcaklıkta saklayın. Tüpün alt kısmından dört milliliters hacmi yeni bir 50 milliliters tüpe aktarmak için bir pipet kullanın.

Bu kısım LDL ve HDL fraksiyonlarını içerir. Bir sonraki adım LDL'nin izolasyonudur. LDL ve HDL fraksiyonlarını içeren tüpe iki mililitre çözelti B ve 100 µL nükleaz içermeyen Fat Red 7B ekleyip karıştırın.

Beş ila on dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Karıştırılmış numunenin 6.5 mililitresini polikarbonat kalın duvarlı bir ultrasentrifüj tüpüne aktarın. Tüpü önceden soğutulmuş bir rotora yerleştirin ve üç saat boyunca santrifüjleyin.

Santrifüj işlemi tamamlandığında, LDL fraksiyonunu temsil eden üst katmandan 1,5 mililitre alın ve dört santigrat derecede saklayın. Tüpün alt kısmında bulunan ve HDL fraksiyonunu içeren dört mililitreyi 50 mililitrelik steril bir tüpe aktarın. Üçüncü adım, HDL izolasyonudur.

HDL fraksiyonunu içeren tüpe iki mililitre çözelti C, 100 mikrolitre nükleaz içermeyen Fat Red 7B ve 15 mikrolitre %98 beta merkaptoetanol ekleyip karıştırın. Karışımın yoğunluğunu kontrol edin. Tüpü önceden soğutulmuş bir rotora yerleştirin ve üç saat boyunca santrifüjleyin.

Ardından, HDL fraksiyonunu temsil eden üst katmandan iki mililitre alın ve dört derece Celsius'ta saklayın. Sonraki agaroz jel elektroforezi ve PCR süreçlerine müdahale edilmesini önlemek için lipoprotein fraksiyonlarından fazla tuz uzaklaştırılmalıdır. Bu videoda, tuzdan arındırma ve konsantrasyon işlemi yalnızca HDL fraksiyonu için gösterilecektir.

HDL fraksiyonuna 13 mililitre soğuk PBS ekleyin ve 10K moleküler ağırlık kesim limitine sahip bir santrifüj filtre cihazına aktarın. Sallanan kova rotorunda, 4000 ×g'de ve dört santigrat derecede, 30 dakika boyunca santrifüjleyin. HDL fraksiyonunu, 13 mililitre soğuk PBS kullanarak ve daha önce olduğu gibi santrifüj ederek ikinci kez tuzdan arındırın.

Santrifüjden sonra, lipoprotein içeren çözeltileri uzaklaştırın ve dört °C'de saklayın. İzole edilen lipoproteinlerin kalite ve saflığını değerlendirmek için, boyut referansı olarak eklenen insan lipoprotein standartları ile agaroz jel elektroforezi gerçekleştirilmiştir. Beta merkaptoetanol içermeyen bir izolasyondan elde edilen temsili sonuçlar, HDL fraksiyonunun herhangi bir VLDL kontaminasyonundan ari olduğunu ve tipik alfa mobilitesi sergilediğini göstermiştir.

Bununla birlikte, HDL fraksiyonu, lipoprotein kontaminasyonu nedeniyle beta mobilite izleri de göstermektedir. Son santrifüj basamağı sırasında çözelti C'ye beta merkaptoetanol eklenmesi, HDL fraksiyonundaki tüm kontamine lipoproteinleri etkili bir şekilde uzaklaştırır. Bu yöntemle saflaştırılan, insan HDL'si tarafından taşınan mikro RNA'ların miktarının belirlenmesinin uygulanabilirliğini göstermek amacıyla, iki farklı mikro RNA gerçek zamanlı kantitatif PCR ile amplifiye edilmiştir.

Bu amplifikasyon grafiklerinde yatay çizgiler tespit eşiğini temsil etmektedir. Altı örnekten elde edilen izole HDL'den alınan temsili gerçek zamanlı PCR verileri, her iki mikro RNA'nın da tutarlı bir şekilde tespit edildiğini göstermiştir. Son olarak, erime eğrisi analizleri, her iki mikro RNA için de önceki PCR'daki spesifik amplifikasyonla uyumlu, belirgin ve tek bir pik göstermektedir.

Bu teknikte uzmanlaşıldığında, düzgün bir şekilde uygulandığı takdirde, tuzdan arındırma prosedürleriyle birlikte dokuz saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, her aşamada dört ila sekiz santigrat derece sıcaklıkta çalışmak önemlidir. Ayrıca, ultrasantrifüjlemeden önce her lipoprotein fraksiyonunun yoğunluğunun ayarlanması gerekir.

Bu prosedürün ardından, HDL saflığı gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla elektron mikroskobu gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, metabolik sendrom alanındaki araştırmacıların, karaciğer yağlanması hastalığından şüphelenilen insanlarda HDL ile ilişkili mikro RNA'ları biyobelirteçler olarak incelemesine olanak sağlayacaktır. Ayrıca, HDL'nin fonksiyonunu ve hücre biyolojisini değiştirme biçimindeki moleküler mekanizmaları daha iyi anlamak için de kullanılabilir.