Name: Besleyicisiz ve Kimyasal Olarak Tanımlanmış Kültür Koşulları Altında İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Kullanan Postgangliyonik Sempatik Nöronların Verimli Farklılaşması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Keşfedin, insan pluripotent kök hücrelerinden besleyicisiz koşullarda postgangliyonik sempatik nöronların 20 günde verimli farklılaşmasını. Bu yöntem, otonomik bozuklukların hastalık modellemesi ve ilaç taraması için güçlü bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Heidi Ulrichs'e makalenin eleştirel okuması ve düzenlenmesi için teşekkür ederiz.

<ol><li>Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Familial+dysautonomia%3A+History%2C+genotype%2C+phenotype+and+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research.</a> Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).</li>
<li>Stone, J. B., DeAngelis, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-treatment-induced+neurotoxicity--focus+on+newer+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Cancer-treatment-induced neurotoxicity--focus on newer treatments.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 13 (2), 92-105 (2016).</li>
<li>Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. J., Wu, T., Sharabi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+sympathetic+denervation+predicts+PD+in+at-risk+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinsonism+Related+Disorders%22%5BJournal%5D)">Cardiac sympathetic denervation predicts PD in at-risk individuals.</a> Parkinsonism Related Disorders. 52, 90-93 (2018).</li>
<li>Froeschl, M., Hadziomerovic, A., Ruzicka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Percutaneous+renal+sympathetic+denervation%3A+2013+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Percutaneous renal sympathetic denervation: 2013 and beyond.</a> Canadian Journal of Cardiology. 30 (1), 64-74 (2014).</li>
<li>Wehrwein, E. A., Orer, H. S., Barman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+Anatomy%2C+Physiology%2C+and+Pharmacology+of+the+Autonomic+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Overview of the Anatomy, Physiology, and Pharmacology of the Autonomic Nervous System.</a> Comprehensive Physiology. 6 (3), 1239-1278 (2016).</li>
<li>Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLe+Douarin%2C+NM+%22The+Neural+Crest%22">The Neural Crest</a>. , Cambridge University Press. (1999).</li>
<li>Simões-Costa, M., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+neural+crest+development+and+evolution+from+genomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Insights into neural crest development and evolution from genomic analysis.</a> Genome Research. 23 (7), 1069-1080 (2013).</li>
<li>Labosky, P. A., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+winged+helix+transcription+factor+Hfh2+is+expressed+in+neural+crest+and+spinal+cord+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">The winged helix transcription factor Hfh2 is expressed in neural crest and spinal cord during mouse development.</a> Mechanisms of Development. 76 (1-2), 185-190 (1998).</li>
<li>Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox10+mutation+disrupts+neural+crest+development+in+Dom+Hirschsprung+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model.</a> Nature Genetics. 18 (1), 60-64 (1998).</li>
<li>Aruga, J., Tohmonda, T., Homma, S., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zic1+Promotes+the+Expansion+of+Dorsal+Neural+Progenitors+in+Spinal+Cord+by+Inhibiting+Neuronal+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Zic1 Promotes the Expansion of Dorsal Neural Progenitors in Spinal Cord by Inhibiting Neuronal Differentiation.</a> Developmental Biology. 244 (2), 329-341 (2002).</li>
<li>Garnett, A. T., Square, T. A., Medeiros, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP%2C+Wnt+and+FGF+signals+are+integrated+through+evolutionarily+conserved+enhancers+to+achieve+robust+expression+of+Pax3+and+Zic+genes+at+the+zebrafish+neural+plate+border%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">BMP, Wnt and FGF signals are integrated through evolutionarily conserved enhancers to achieve robust expression of Pax3 and Zic genes at the zebrafish neural plate border.</a> Development. 139 (22), Cambridge, England. 4220-4231 (2012).</li>
<li>Kam, M. K., Lui, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Hoxb5+in+the+development+of+vagal+and+trunk+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Growth%2C+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells.</a> Development Growth, Differentiation. 57 (2), 158-168 (2015).</li>
<li>Guillemot, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+achaete-scute+homolog+1+is+required+for+the+early+development+of+olfactory+and+autonomic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mammalian achaete-scute homolog 1 is required for the early development of olfactory and autonomic neurons.</a> Cell. 75 (3), 463-476 (1993).</li>
<li>Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homeobox+gene+Phox2b+is+essential+for+the+development+of+autonomic+neural+crest+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The homeobox gene Phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives.</a> Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).</li>
<li>Wildner, H., Gierl, M. S., Strehle, M., Pla, P., Birchmeier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insm1+%28IA-1%29+is+a+crucial+component+of+the+transcriptional+network+that+controls+differentiation+of+the+sympatho-adrenal+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Insm1 (IA-1) is a crucial component of the transcriptional network that controls differentiation of the sympatho-adrenal lineage.</a> Development. 135 (3), Cambridge, England. 473-481 (2008).</li>
<li>Trainor, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTrainor%2C+P+%22Neural+Crest+Cells%3A+Evolution%2C+Development+and+Disease%22">Neural Crest Cells: Evolution, Development and Disease</a>. , Academic Press. (2013).</li>
<li>Howard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+perspectives+on+differentiation+of+autonomic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and perspectives on differentiation of autonomic neurons.</a> Developmental Biology. 277 (2), 271-286 (2005).</li>
<li>Zeltner, N., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cell-based+disease+modeling%3A+current+hurdles+and+future+promise%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cell-based disease modeling: current hurdles and future promise.</a> Current Opinion in Cell Biology. 37, 102-110 (2015).</li>
<li>Oh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Coupling+with+Cardiac+Muscle+Promotes+Maturation+of+hPSC-Derived+Sympathetic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional Coupling with Cardiac Muscle Promotes Maturation of hPSC-Derived Sympathetic Neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (1), 95-106 (2016).</li>
<li>Frith, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+axial+progenitors+generate+trunk+neural+crest+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Human axial progenitors generate trunk neural crest cells in vitro.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Kirino, K., Nakahata, T., Taguchi, T., Saito, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+derivation+of+sympathetic+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells+with+a+defined+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient derivation of sympathetic neurons from human pluripotent stem cells with a defined condition.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12865(2018).</li>
<li>Wu, H. F., Zeltner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+Methods+to+Differentiate+Sympathetic+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Overview of Methods to Differentiate Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Current Protocols Stem Cell Biology. 50 (1), 92(2019).</li>
<li>Zeltner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+the+biology+of+disease+severity+in+a+PSC-based+model+of+familial+dysautonomia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia.</a> Nature Medicine. 22 (12), 1421-1427 (2016).</li>
<li>Saito-Diaz, K., Wu, H. F., Zeltner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomic+Neurons+with+Sympathetic+Character+Derived+From+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Autonomic Neurons with Sympathetic Character Derived From Human Pluripotent Stem Cells.</a> Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 78(2019).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Fattahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+human+ENS+lineages+for+cell+therapy+and+drug+discovery+in+Hirschsprung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease.</a> Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li>
<li>Tchieu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modular+Platform+for+Differentiation+of+Human+PSCs+into+All+Major+Ectodermal+Lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages.</a> Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).</li>
<li>Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catecholaminergic+systems+in+stress%3A+structural+and+molecular+genetic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+Review%22%5BJournal%5D)">Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches.</a> Physiology Review. 89 (2), 535-606 (2009).</li>
<li>Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Generation+of+Trunk+Neural+Crest+and+Sympathetic+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Via+a+Neuromesodermal+Axial+Progenitor+Intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate.</a> Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 81(2019).</li>
<li>Saito-Diaz, K., Zeltner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+for+disease+modeling%2C+cell+therapy+and+drug+discovery+in+genetic+autonomic+disorders%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Autonomic+Research%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review.</a> Clinical Autonomic Research. 29 (4), 367-384 (2019).</li>
<li>Clements, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+stimulation+of+multiwell+MEA+plates+for+neural+and+cardiac+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Neurophotonics%3B+Neural+Imaging+and+Sensing%3B+and+Optogenetics+and+Optical+Manipulation%22%5BJournal%5D)">Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications.</a> Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Geçenlerde iki değerlendirme yayınladı, bir hastalık modelleme için hPSC kaynaklı symNs kullanımını tartışırken31 yanı sıra mevcut farklılaşma protokolleri derinlemesine bir karşılaştırma22. Bu nedenle, burada ilgili araştırmacı symNs yapmada başarılı yardımcı olmak için mevcut protokol sorun giderme üzerinde duruluyor. Tüm farklılaşma sürecinde, sağlıklı farklılaşmış hücrelerin yanı sıra tutarlı veri elde etmek için, her aşamada kontaminasyon dikkatle kontrol edilmelidir. ...

Postganglionik sempatik nöronlar (symNs) otonom sinir sistemine ait (ANS) ve yanıt ve bilinç bağımsız vücudun homeostaz düzenlenmesinde birden fazla önemli rolleri vardır. Örneğin, stres symNs uyarır ve kalp hızı, kan basıncı ve terleme bir artışa yol açan mücadele-veya-uçuş yanıtı çağrıştırıyor. SymNs genetik nedeniyle birden fazla insan bozuklukları etkilenir, toksisite / yaralanma, ya da diğer hastalıklara yardımcı olarak. Genetik nöropati nin bir örneği çocukluk çağı bozukluğu Ailesel Disotonomi (FD), symNs şiddetli bir disregülasyon disotonomik krize neden olur, terleme ile belirgin, cilt lekeleme, kusma atakları, hipertansiyon, ve anksiyete1. Toksisite bir örnek kemoterapi tedavisi, hangi otonom nöronlar üzerinde toksik yan etkileri olduğu bildirilmiştir2. Bu otonom denervasyon ve hiper-innervasyon hem yol açabilir bilinmektedir, ya da eşlik, Parkinson hastalığı veya hipertansif böbrek hastalığı gibi hastalıklar3,4. Bu nedenle, symN biyolojisi ve hastalıkları bağlamında kusurların mekanlarını araştırabilmek ve anlayabilmek, yeni ve etkili tedavilerin araştırılmasında faydalıdır.
Anatomi Periferik sinir sistemi duyusal ve otonom bölünmeleriçine dallar. Duyusal sinir sisteminin afferent sinirler ağrı ve dokunma hissi sorumludur, ANS beyne tüm organlardan bilgi geçişi sorumludur ise. ANS enterik sinir sistemi ayrılır, gastrointestinal sistem innerve, parasempatik sinir sistemi, hangi gevşeme için önemlidir, ve sempatik sinir sistemi (SNS), hangi aktivasyon / organların düzenlenmesi için önemlidir. SNS iki nöronlu bir sistem5uyarlar. Omurilikte preganglionik sempatik nöral aksonlar ilk olarak postganglionik symN hücre organlarının bulunduğu sempatik ganglia'ya proje lenir. Bu nöronlar daha sonra vücuttaki her organın hedef dokuları innerve etmek için uzun projeksiyonlar göndermek. Preganglionik nöronlar tarafından iletilen sinyaller kolinerjiktir, postganglionik symNs adrenerjik ve böylece ekspres norepinefrin (NE) ana nörotransmitter olarak. Postgangliyonik birkaç önemli istisnalar vardır, kolinerjik sempatik nöronlar, kan damarları innerve olanlar da dahil olmak üzere. Adrenerjik postgangliyonik nöronlar tirozin hidroksilaz (TH), aromatik L-amino asit dekarboksilaz (AAAD), dopamin β-hidroksilaz (DBH) ve monoamin oksidaz (MAO-A), tüm üreten ve metabolize NE sorumlu enzimleri ifade. Ayrıca, ne geri dönüşüm taşıyıcıları ve /veya reseptörleri α-adrenerjik reseptör (ADRA2), β-adrenerjik reseptör (ADR2B), norepinefrin taşıyıcı (NET1) ve vesiküler monoamin taşıyıcı (VMAT1/2) ifade ederler.
Geliştirme Embriyonik gelişim symNs sırasında nöral tepecik türetilmiştir (NC), hangi nöral tüp ve overlaying ektoderm arasında ortaya çıkar6, ve birden fazla hücre soyları ayırt edebilirsiniz, melanositler de dahil olmak üzere, osteoblastlar, adipositler, glia, enterik nöronlar, duyusal nöronlar, ve otonom nöronlar7. Nöral krest hücreleri (NVR) embriyo ile çeşitli yolları almak son derece göçmen hücrelerdir. NC gelişiminin bu erken aşamasında, hücreler işaretleri SNAIL1/2, FOXD3 ve SOX108,9,,10,11ifade . Benimsedikleri eksenel konumla birlikte geçiş rotası, geliştirecekleri NC alt türünü belirler. Bu NC alt tipleri kendi özel HOX gen ekspresyonu ile ayırt edilebilir: Kranial NCC'ler HOX genlerini ifade etmez, vagal NCC'ler HOX 1-5 ekspres, gövde NCCs ekspres HOX 6-9, ve sakral NCCs ekspres HOX 10-1112. Bunlar arasında, gövde NCCs symNs ana kaynağı olarak kabul edilmektedir. SymN öncüleri transkripsiyon faktörü MASH1/ASCL113ifade , PHOX2B14 ve INSM115ifade teşvik . GATA ailesi transkripsiyon faktörleri geç sempatik gelişim sırasında ifade edilir. GATA2 ve GATA3 symNs ifade edilir, hangi sırayla DBH16aktive . Transkripsiyon faktörü HAND2 de ifade ve DBH ve TH17bakım için önemlidir.
HPSCs (örneğin, embriyonik ve indüklenen pluripotent kök hücreler) güçlü bir araç18 gelişimsel paradigmalar özetlemek ve daha sonra çeşitli insan bozukluklarının hastalık modelleme için istihdam edilebilir symNs oluşturmak. Bu nedenle, hPSCs gelen symNs oluştururken, gelişimsel yönergeleri takip etmek ve farklılaşma süreci boyunca uygun belirteçleri ifade değerlendirmek çok önemlidir.
Önceki symN protokolü Birkaç araştırma grupları daha önce hPSCs19,,20,,21gelen symNs nesil bildirdin. Birbirlerine bu protokollerin doğrudan karşılaştırma ve bizim son zamanlarda22gözden geçirildi . 201623yılında symN karakterli otonom nöronların üretimi için bir ayırım protokolü yayınladık (Şekil 1A). Bu protokol, hem farklılaşmamış hPSC'lerin bakımında hem de hücre farklılaşmasında kullanılan KSR tabanlı ortam kullanılmıştır. Ayrıca fare embriyonik fibroblastlarında (MEF besleyici hücreler) hPSC'ler tutuldu. Biz bozukluğu modellemek için FD hastalarından bu protokol ve PSCs istihdam23. 2019 yılında, bu eski protokol24daha ayrıntılı bir sürümünü açıkladı. Özetle, nöral kader ilk 2 gün içinde TGF-β ve BMP sinyalini engellemek için çift SMAD inhibisyonu25 ile indüklendi. CHIR99021 kullanarak WNT aktivasyonu NC hücreleri haline nöral ataları terfi etti. 11. günde hücreler, CD49D+ veya SOX10+ popülasyonlar26,23için FACS tarafından sıralandırıldı, bu da yaklaşık %40 NC üretim verimliliği elde etti. Böylece, farklılaşma sonraki adımlar için verimlilik ve saflık sağlamak için sıralama gerekli oldu. NNC'ler FGF2 ve CHIR kombine tedavisi ile küresel olarak muhafaza edildi ve güçlendirilmiş. 4 gün sonra, bakım NC spheroids kaplama ve BDNF verildi, GDNF, ve NGF symN olgunlaşma bitirmek için. Bu symN'ler ASCL1, TH, DBH ve PHOX2A gibi güçlü symN belirteçlerini ifade etse ler de, nikotinik asetilkolin reseptörünün (CHRNA3/CHRNB4) ve vezikül taşıyıcısının (VMAT1/2) ekspresyonu da dahil olmak üzere daha olgun symN'ler için belirteçler 70 günlük farklılaşmadan sonra bile düşüktü. Bu protokoldeki HOX genleri resmi olarak test edilmedi ve hücrelerin elektrofizyolojik aktivitesi de dahil olmak üzere olgun nöral özellikler doğrulanmadı.
Burada, symNs oluşturmak için optimize edilmiş bir protokol salıyoruz (Şekil 1B). HPSC'ler besleyicisiz koşullarda, vitronektin (VTN) kaplamalı yemeklerde, Essential 8 (E8) media27kullanılarak muhafaza edilir. Farklılaşma ortamının formülü her aşamada değiştirilerek NC popülasyonunun yüzdesi28'dir. SymN olgunlaşma CD49D+/SOX10+ sıralanmış veya sıralanmamış toplu NCC popülasyonları üzerinde yapılabilir. Her ikisi de 30. Ayrıca, bu protokol ile oluşturulan symNs elektrofizyolojik kayıt ve symN aktivatör ve inhibitör bileşikleri ile tedavilere duyarlıdır.

<table><tbody><tr><td>100 mm hücre kültürü kapları</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konik doku kültürü tüpleri</td><td>VWR/Corning</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu doku kültürü plakaları</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>24 kuyulu ultra düşük bağlantılı plakalar</td><td>Corning</td><td>07 200 601 ve 07 200 602</td><td></td></tr><tr><td>%5 CO2/%20 O2 doku kültürü inkübatörü</td><td>Thermo Fisher/Life Teknolojiler</td><td>Heracell VIOS 160i</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konik doku kültürü tüpleri</td><td>VWR/Corning</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu doku kültürü plakaları</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovation Cell Technologies</td><td>AT104500</td><td>Hücre ayrışma solüsyonu</td></tr><tr><td>Anti-AP2a antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab108311</td><td>Ev sahibi: Tavşan; 1:400 seyreltme</td></tr><tr><td>Anti-Ascl1 antikoru</td><td>BD Pharmingen</td><td>556604</td><td>Konakçı: Fare IgG1; 1:200 seyreltme</td></tr><tr><td>Anti-CD49D antikoru</td><td>BioLegend</td><td>304313</td><td>Ev sahibi: Fare IgG1; 5 ve mu; 100 &mu'da l/milyon hücre; l hacim</td></tr><tr><td>Anti-CD49D antikoru (izotip)</td> <td>BioLegend</td><td>400125</td><td>Ana bilgisayar: Fare IgG1; 5 & mu; 100 &mu'da l/milyon hücre; l hacim</td></tr><tr><td>DAPI boya</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>1:1000 seyreltme</td></tr><tr><td>Anti-DBH antikoru</td><td>Immunostar</td><td>22806</td><td>Ev sahibi: Tavşan; 1:500 seyreltme</td></tr><tr><td>Anti-GFP antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td>Ev sahibi: Tavuk; 1:1000 seyreltme</td></tr><tr><td>Anti-HOXC9 antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab50839</td><td>Ev sahibi: Fare; 1:100 seyreltme</td></tr><tr><td>Anti-NET1 antikoru</td><td>Mab</td><td>NET17-1</td><td>Ev sahibi: Fare; 1:1000 seyreltme</td></tr><tr><td>Anti-PRPH antikoru</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>SC-377093/H0112</td><td>Ana bilgisayar: Fare IgG2a; 1:200 seyreltme</td></tr><tr><td>Anti-SOX10 antikoru</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-365692</td><td>Ana bilgisayar: Fare IgG1; 1:100 seyreltme</td></tr><tr><td>Anti-TH antikoru</td><td>Pel-Freez</td><td>P40101- 150</td><td>Ev sahibi: Tavşan; 1:500 seyreltme</td></tr><tr><td>Askorbik asit</td><td>Sigma</td><td>A8960-5G</td><td>Stok konsantrasyonu: 100 mM</td></tr><tr><td>B27 takviyesi</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>12587-010</td><td>Stok konsantrasyonu: 50x</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>R& D Systems</td><td>248-BD</td><td>Stok konsantrasyonu: 10 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>314-BP</td><td>Stok konsantrasyonu: 6 mM</td></tr><tr><td>Hücre sayacı</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>Countess II</td><td></td></tr><tr><td>Hücre sayma odası slaytları</td><td>Invitrogen</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>57021& 5424R</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>4423</td><td>Stok konsantrasyonu: 6 mM</td></tr><tr><td>Cryo-flakon</td><td>Thermo Fisher/Yaşam Teknolojileri</td><td>375353</td><td></td></tr><tr><td>dbcAMP</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td>Stok konsantrasyonu: 100 mM</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher/Yaşam Teknolojileri</td><td>10829-018</td><td>Stok konsantrasyonu: 1x</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher/Yaşam Teknolojileri</td><td>11330-057</td><td>Stok konsantrasyonu: 1x</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Fisher/Yaşam Teknolojileri</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>E6 orta</td><td>gibco</td><td>A15165-01</td><td></td></tr><tr><td>E8 orta</td><td>gibco</td><td>A15169-01</td><td>Stok konsantrasyonu: 1x</td></tr><tr><td>E8 takviyesi</td><td>gibco</td><td>A15171-01</td><td>Stok konsantrasyonu: 50x</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>ED2SS</td><td>Stok konsantrasyonu: 0,5 M</td></tr><tr><td>Elektrofizyoloji plakaları (AXION sitoview MEA96)</td><td>Axion BioSystems</td><td>M768-tMEA-96W</td><td></td></tr><tr><td>FACS makinesi</td><td>Beckman Coulter</td><td>CytoFLEX (FACS için)</td><td></td></tr><tr><td>FACS makinesi</td><td>Beckman Coulter</td><td>MoFlo Astrios EQ (sıralama için)</td><td></td></tr><tr><td>FACS tüpleri (mavi filtre kapağı)</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>FACS tüpleri (beyaz kapak)</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>PeproTech</td><td>450</td><td>Stok konsantrasyonu: 10 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Invitrogen</td><td>A1413202</td><td>Bazal membran matrisi; Stok konsantrasyonu: 100x</td></tr><tr><td>hPSC Thomson</td><td>ve diğerleri, (1998)</td><td>WA09</td><td></td></tr><tr><td>hPSC'ler</td><td>Oh ve ark. (2016)</td><td>H9-PHOX2B::eGFP</td><td></td></tr><tr><td>İnsan fibronektini (FN)</td><td>VWR/Corning</td><td>47743-654</td><td>Stok konsantrasyonu: 1 mg/mL</td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Thermo Fisher/Gibco</td><td>25030-081</td><td>Stok konsantrasyonu: 200 mM</td></tr><tr><td>LN tankı</td><td>Özel Biyojenik Sistemler</td><td>V-1500AB</td><td></td></tr><tr><td>MEA okuyucu</td><td>Axion BioSystems</td><td>Maestro Pro</td><td></td></tr><tr><td>Fare laminin I (LM)</td> <td>R & D Systems</td><td>3400-010-01</td><td>Stok konsantrasyonu: 1 mg/mL</td></tr><tr><td>N2 takviyesi</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>Stok konsantrasyonu: 100x</td></tr><tr><td>Neurobazal medium</td><td>gibco</td><td>21103-049</td><td>Stok konsantrasyonu: 1x</td></tr><tr><td>NGF</td><td>PeproTech</td><td>450-01</td><td>Stok konsantrasyonu: 25 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td>Stok konsantrasyonu: 1x</td></tr><tr><td>Poli-L-ornitin hidrobromür (PO)</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td>Stok konsantrasyonu: 15 mg/mL</td></tr><tr><td>Primocin (antibiyotikler)</td><td>InvivoGen</td><td>ANTPM1</td><td>Stok konsantrasyonu: 50 mg/mL</td></tr><tr><td>qPCR makinesi</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>C1000 Touch</td><td></td></tr><tr><td>qPCR plakaları</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>rekombinant FGF2</td><td>R& D Sistemleri</td><td>233-FB/CF</td><td>Stok konsantrasyonu: 10 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Retinoik asit</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Stok konsantrasyonu: 1 mM</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris/R& D Systems</td><td>1614</td><td>Stok konsantrasyonu: 10 mM</td></tr><tr><td>Tripan mavisi</td><td>Corning</td><td>MT-25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin (VTN)</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>A14700</td><td>Stok konsantrasyonu: 0,5 mg/mL</td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td>VWR/Corning</td><td>706308</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>R& D Systems</td><td>1254</td><td>Stok konsantrasyonu: 10 mM</td></tr></tbody></table>

besleyicisiz ve kimyasal olarak tanımlanmış kültür koşulları altında İnsan pluripotent kök hücreleri kullanan postgangliyonik sempatik nöronların verimli farklılaşması

Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions

İnsan pluripotent kök hücreleri (hPSCs) hastalık modelleme ve in vitro insan embriyonik gelişim çalışması için güçlü bir araç haline gelmiştir. Daha önce otonom nöropatili hastalara uygulanan sempatik karakterli otonom nöronların türemesi için bir ayırım protokolü sunmuştuk. Ancak protokol Knock Out Serum Replasmanı (KSR) ve besleyici tabanlı kültür koşulları üzerine inşa edildi ve yüksek farklılaşma verimliliği sağlamak için hücre sıralamagerekliydi. Bu faktörler yüksek değişkenlik, yüksek maliyet ve düşük tekrarlanabilirlik neden olur. Ayrıca, elektriksel aktivite de dahil olmak üzere olgun sempatik özellikleri doğrulanmamıştır. Burada, PSC kültürünün ve farklılaşmasının besleyicisiz ve kimyasal olarak tanımlanmış kültür koşullarında gerçekleştirildiği optimize edilmiş bir protokol salıyoruz. Gövde nöral ibikini tanımlayan genetik belirteçler tanımlanır. Postgangliyonik sempatik nöronlar içine daha fazla farklılaşma hücre sıralama gerek kalmadan 20 gün sonra elde edilir. Elektrofizyolojik kayıt fonksiyonel nöron kimliğini daha da gösterir. Bizim farklılaşmış nöronlar tespit Ateş nikotin tarafından geliştirilmiş ve adrenerjik reseptör antagonist propranolol tarafından bastırılmış olabilir. Bu protokoldeki orta sempatik nöral atalar, kültürlerin genişlemesine olanak sağlayan 2 haftaya kadar nöral küresel olarak muhafaza edilebilir. Özetle, bizim güncellenmiş sempatik nöron farklılaşma protokolü yüksek farklılaşma verimliliği gösterir, daha iyi tekrarlanabilirlik, daha fazla esneklik, ve önceki sürüme göre daha iyi nöral olgunlaşma. Bu protokol otonom sinir sistemini etkileyen insan bozuklukları incelemek için gerekli hücreleri ile araştırmacılar sağlayacaktır.

Bu protokolde, hPSC'lerden symN'lerin nasıl üretilenlere ilişkin talimatlar veriyoruz. Burada gösterilen kültür koşulları daha önce yayınlanmış bir protokol23,24 (Şekil 1A)ile besleyicisiz ve kimyasal olarak tanımlanmış koşullara(Şekil 1B)iyileştirilmiştir. İki seçenek sağlanır, biri 20 gün içinde symN'lerin yapıldığı, diğeri ise Daha sonra symN'lere ayrıştırılabilen daha fazla hücre oluşturmak için 2 ha...

Bu protokolde, postgangliyonik sempatik nöronların insan pluripotent kök hücrelerinden üretimi için istikrarlı ve yüksek verimli bir ayırım stratejisi tanımlıyoruz. Bu model nöronlar birden fazla otonom bozuklukların çalışmalarının kullanımı için kullanılabilir hale getirecek.

Besleyicisiz ve Kimyasal Olarak Tanımlanmış Kültür Koşulları Altında İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Kullanan Postgangliyonik Sempatik Nöronların Verimli Farklılaşması

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have become a powerful tool for disease modeling and the study of human embryonic development in vitro. We previously ...

Bu protokol insan pluripotent kök hücrelerden sempatik nöronların türemiş sağlar. Bu hücreler sempatik sinir sistemini etkileyen insan bozuklukları çalışma bir bilim adamı sağlayacaktır. Bu teknik, yüksek ölçeklenebilir verimlilikte bölünmüş besleyicisiz toplantı koşullarında sempatik nöronların türemesine olanak sağlar.20 gün içinde elektriksel olarak aktif nöronlarla sonuçlanır. Bu teknik, disfonksiyonel sempatik sinir sisteminin neden olduğu hastalıklara uygulanabilir, aynı zamanda hastalık modelleme, rejeneratif tıp ve ilaç taraması için de kullanılabilir. Bu hücreler, örneğin kardiyak doku regülasyonu nun incelenmesinde, bir ortak kültür sistemi içindeki herhangi bir dokuyu yenilik yapmak için in vitro olarak kullanılabilir.İnsan pluripotent kök hücre kültürü %80-90 biraraya geldiğinde, pürüzsüz parlak kenarlı büyük kolonilere dikkat edilmelidir. Bölme için, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit 0,25 molar EDTA dört mililitre ile hücreleri tedavi etmeden önce PBS ile kültür yıkayın. İki dakika sonra, plakayı 10 mililitre E8 orta sıyla yıkayın ve müstakil hücre süspansiyonuna 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.Daha sonra 500 mikrolitre hücreyi 9,5 mililitrelik taze E8 ortamına aktarın. Ve kök hücreleri yeni vitronektin kaplamalı 100 milimetrelik tabaklara yerleştirin. Diferansiyasyon indüksiyonundan bir gün önce, her kuyuda iki mililitre lik iki mililitre lik altı kuyu plakası içeren uygun sayıda kaplama.Ve tabakları bir gecede 4 derece saklayın. Ertesi sabah, oda sıcaklığına plakaları ısıtın ve yıkama başına taze PBS ile iki kez insan pluripotent kök hücre kültürünü bölmek için hazır yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, yüzen insan pluripotent kök hücreleri spirating ve 50 mililitrelik tüp içine hasat hücreleri transfer önce hücre kültürü kuluçka 15 dakika boyunca 0.5 milimolar EDTA yedi mililitre ile hücreleri tedavi.EDTA seyreltmek ve santrifüj ile hücreleri toplamak için tüpe PBS eşit hacimli ekleyin. Muhasebe için uygun bir ortam hacmi eklemeden önce 01 farklılaştırma aracının bir mililitresinde peleti yeniden askıya alın. Hücreleri 1,25 çarpı 10 ile santimetre kare konsantrasyonbaşına beşinci hücrelere seyrelterek her kuyu başına mililitre farklılaşma ortamına dönüştürün.Daha önce altı iyi plaka için hazırlanan her kuyudan tüm bodrum membran matris çözeltisi aspire. Sonra her kuyuya iki mililitre hücre tohumu ve hücre kültürü kuluçka içine plaka yerleştirin. Ertesi sabah, günlük 3 mililitre ile hücreleri beslemek 01 farklılaşma orta iyi başına.Farklılaşmanın ikinci gününde, hücreleri her gün 2 ila 10 farklılaştırma ortamıyla üç mililitre ile besleyin, sonra 10. Nöral krest hücrelerini küresel lere toplamak için, 10. Ve her kuyuya iki mililitre ayrışma ortamı ekleyin.Hücre kültürü kuluçka 20 dakika sonra, 50 mililitrekonik tüp içine yüzen hücreleri aktarın ve taze PBS ile 50 mililitre tüp süspansiyon hacmi getirmek. Santrifüj ile hücreleri toplayın. Ve gün 10 ila 14 küresel orta yeterli hacimde sayım için pelet resuspend.Saydıktan sonra, gün 10 ila 14 küresel orta kullanarak 500 mikrolitre konsantrasyonu başına beş kez 10 beşinci hücrelere hücreleri seyreltin. Ve 500 mikrolitre hücreyi her bir kuyuya, ultra düşük eki 24-iyi bir plakanın içine yerleştirin. Sonra hücreleri hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürün.Minimal küresel kültür neden olmak için, kültür gün 11, iyi başına gün 10 ila 14 küresel orta ek 500 mikrolitre ile nöral ibik sferoidler beslemek. 12. günde, plakanın bir tarafında ki küreselleri birikmesi için plakayı yatırın. Ve spheroidleri aspire etmeden her kuyudan mümkün olduğunca orta derecede aspire edin.Sonra iyi başına gün 10 ila 14 küresel orta bir mililitre ile küresel beslemek. Genişletilmiş bir küresel kültür ikna etmek için, gün 1.5 mililitre ile küresel beslemek 10 için 14 küresel orta iyi başına 0.5 mikromolar retinoik asit ile takviye. Sonra küresel leri hücre kültürü kuluçka makinesine geri ver.Sempatik nöron farklılaşması için, 14 veya 28. Sempatik nöron orta bir mililitre ile hücreleri beslemek. Büyük küresel agregaları daha küçük küresel lere ayırmak için, kuyu başına en fazla bir mililitre orta ekleyin ve parçalanmadan önce sferoidleri 5-10 kez pipetler.Ve daha önce hazırlanmış 24-iyi plakalar fazla laminin fibronectin kaldırın. 24 kuyulu küresel kültür plakası üzerindeki her kuyudan bir mililitre küresel spheroid plakayı, yeni kaplamalı 24 kuyunun dört ayrı kuyusu arasında bölün. Her kuyuya 250 mikrolitre taze sempatik nöron ortamı ekleyin.Ve plakayı hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin. Ertesi sabah, sempatik nöron orta 0.125 mikromolar retinoik asit ile takviye sempatik nöron orta her kuyuda orta değiştirin ve hücre kültürü kuluçka için plaka dönmek. Gün sonra 35, dikkatle taze orta ile her kuyuda mevcut ortamın sadece yarısını değiştirerek nöronlar beslemek.Farklılaşmadan önce, insan pluripotent kök hücre kolonileri parlak, pürüzsüz kenarları ve hiçbir farklılaşma için çok az yuvarlak olmalıdır. Hücreler nöral krest belirteci Sox10'u 4 günden 10 güne kadar ifade eder. Nöral krest hücreleri altıncı günden itibaren görülebilen yoğun karanlık sırtlarda ortaya çıkar.Bu sırtlar da Sox10 ifade. Nöral krest hücreleri aşamasında, Sox10 hücre yüzey marker CD49D ile ilişkilidir, hangi nöral krest hücreleri sıralamak için kullanılabilir. Pozitif sıralanmış ve sıralanmamış popülasyonlar benzer bir şekilde nöral krest spheroidler üretti.Negatif sıralanmış hücreler düzgün bir araya gelmezken, yuvarlak, pürüzsüz sağlıklı görünümlü spheroidler üretmez ve üç ila dört gün içinde ölür. Ayrıca, nöral krest spheroidler 14. Gün 20 veya 35, ilgili minimal veya genişletilmiş protokoller, nöroidler bağlı küresel bir radyal desen büyüyen görülebilir.Norepinefrin sentezi ve taşınması ile ilgili belirteçler bu aşamada ifade edilir, yanı sıra Hox6 ile dokuz gövde nöral krest genleri. Elektrofizyolojik kayıt da 20. Bu tür aktivite gelişmiş veya farklılaştırılmış nöronların işlevselliğini ayarlayan sempatik nöronların otoreseptörleri hedef ilaçlar tarafından bastırılmış olabilir.İnsan taraftarları kendilerini farklılaşma gün sıfır dan başlayarak sağlıklı olmalıdır, aksi takdirde, deney büyük olasılıkla başarısız olacaktır. Farmakolojik inhibitörleri veya aktivatörler normal veya patolojik davranışlarını anlamak için nöronlar eklenebilir. Bu yöntem sempatik biyoloji ve patoloji yi incelemek için yeni bir yol açılmaktadır, çünkü artık insanlardan sempatik nöronların biyopsilerini kolayca elde etmek mümkündür.

efficient-differentiation-postganglionic-sympathetic-neurons-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz insan nöronal atalarıdır ve sinir onarımı için gelişmekte olan MSS nöronal hücre tipleri büyük bir arz türetme sağlayan küçük moleküller ile tanımlanan koşullar altında tutulan pluripotent insan embriyonik kök hücreleri doğrudan neuroblasts indüksiyonu için bir protokol kurduk.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Nöronal atalarıdır ve Nöronlar Verimli türetilmesi

Pluripotent insan kök hücrelerinin nöronal farklılaşma (hPSCs) için Protokoller genellikle zaman alıcı ve önemli hücre kültürü becerileri gerektirir. Burada, kontrollü bir şekilde insan nöronlarının, basit, hızlı ve verimli üretimi sağlayan bir multititre plaka biçiminde küçük bir moleküldür tabanlı farklılaşma prosedürü adapte var.

Bir Multititre Plaka Biçimi İnsan Pluripotent Kök Hücreler Nöron Hızlı ve Verimli Üretim

Bu video, insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC'ler) postganglionik sempatik nöronlar oluşturmak için in vitro bir yöntemi göstermektedir. hPSC'ler, bir farklılaşma ortamı kullanılarak bir bazal membran matris desteği üzerinde nöral krest hücrelerine (NCC'ler) farklılaştırılır. NCC'ler daha sonra ayrışır ve başka bir farklılaşma ortamı kullanılarak sferoidler haline getirilir. Son olarak, sferoidler, sempatik bir nöron ortamı kullanılarak postganglionik sempatik nöronlara dönüştürülür.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Postganglionik Sempatik Nöronların Üretilmesi

Bu video, transgenik olmayan ve transgenik insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC'ler) nöral progenitör hücrelerin oluşumunu göstermektedir. hPSC'ler, bir nöronal farklılaşma ortamı kullanılarak nöral progenitör hücrelere farklılaştırılır. Farklılaşma, küçük moleküller kullanılarak transgenik olmayan hücrelerde indüklenirken, transgenik hPSC'ler, nöronal farklılaşmaya özgü bir transkripsiyon faktörü için promotörü indükleyen bir antibiyotik eklenerek farklılaştırılır.

Transgenik Olmayan ve Transgenik İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinin Nöral Progenitör Hücrelere Ayırt Edilmesi

Bu video, insan iPSC'lerini motor nöronlara ayırma sürecini göstermektedir. Gerekçe, belirli transkripsiyon faktörlerini ifade etmek için genetik olarak değiştirilmiş iPSC'lerin kullanılmasını içerir. Doksisiklin içeren bir ortamda kültürlendiğinde, bu antibiyotik transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonunu tetikler, böylece motor nöron progenitörlerine iPSC farklılaşmasını teşvik eder. Nihayetinde, progenitörler, olgun ve işlevsel motor nöronlar elde etmek için nöronal bir ortamda kültürlenir.

Tasarlanmış İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Fonksiyonel Motor Nöronlara Farklılaşması

Biz, gelişimsel biyolojiden elde edilen bilgilere ve yayınlanmış araştırmalara dayanarak, hem insan embriyonik kök hücrelerinden hem de insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden A9 orta beyin dopaminerjik nöronlarını verimli bir şekilde üretmek için optimize edilmiş bir protokol geliştirdik, bu da Parkinson hastalığı için hastalık modellemesi ve hücre replasman tedavisi için yararlı olacaktır.

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri dopaminerjik Nöron Farklılaşma Yönetmen

Farklılaşmış insan nöral kök hücreleri (hNSC'ler) üzerindeki miRNA'lardaki değişiklikleri karakterize etmek amacıyla, üç boyutlu bir sistemde hNSC farklılaşmasını, miRNA PCR dizisi ile mikroRNA ekspresyonundaki değişikliklerin değerlendirilmesini ve miRNA hedef tahmini için hesaplamalı analizi ve ikili lusiferaz testi ile doğrulanmasını açıklıyoruz.

Üç Boyutlu Kültürleri, mıkroRNA Analizi ve Putatif Hedef Genler üzerinde bir İnsan Sinir Kök Hücre Hattı Farklılaşma

Bu protokol, daha önce birden fazla hafta boyunca in vitro nöral atalardan farklılaşmış insan kök hücre türetilmiş nöronlar resucan ve kültür için ayrıntılı bir prosedür açıklar. Prosedür, ışık mikroskobu ve yüksek içerikli tarama ile uyumlu bir formatta nöritler, sinapslar ve geç ifade nöronal belirteçlerin görüntüleme tabanlı tahlilleri kolaylaştırır.

Neuritogenez ve Sinaps Matürasyonu yüksek içerikli Tarama için İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Nöronların Post-differentiation Rekaplamag

Burada sunulan insan embriyonik kök hücrelerinin tek hücreli kültür ve nöral progenitor hücrelere sonraki farklılaşma için bir protokoldür. Protokol basit, sağlam, ölçeklenebilir ve ilaç tarama ve rejeneratif tıp uygulamaları için uygundur.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Tek Hücre Kültürünü Kullanarak Etkin Nöral Farklılaşma

Omurilik insan kaynaklı pluripotent kaynaklı astrositleri ve nöronları ve elektrofizyolojik kayıt için ortak kültürlerini ayırt etmek için bir yöntem tanımladık.

ALS'yi Bölgesel Olarak Spesifik İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Astrositler ve Nöronlarla Modellemek için Bir Elektrofizyolojik Platformun Kurulması

İnsan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC) enterik sinir sistemi (ENS) soylarının türetilmesi, ENS gelişimini ve hastalığını incelemek ve rejeneratif tıpta kullanmak için ölçeklenebilir bir hücre kaynağı sağlar. Burada, kimyasal olarak tanımlanmış kültür koşulları kullanılarak hPSC'lerden enterik nöronlar türetmek için ayrıntılı bir in vitro protokol sunulmaktadır.

Enterik Sinir Sistemi Soylarının İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Farklılaşması

Keşfedin, insan pluripotent kök hücrelerinden besleyicisiz koşullarda postgangliyonik sempatik nöronların 20 günde verimli farklılaşmasını. Bu yöntem, otonomik bozuklukların hastalık modellemesi ve ilaç taraması için güçlü bir platform sunar.

Besleyicisiz ve Kimyasal Olarak Tanımlanmış Kültür Koşulları Altında İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Kullanan Postgangliyonik Sempatik Nöronların Verimli Farklılaşması (Video) | JoVE Journal

Besleyicisiz ve Kimyasal Olarak Tanımlanmış Kültür Koşulları Altında İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Kullanan Postgangliyonik Sempatik Nöronların Verimli Farklılaşması

Daha fazla video keşfet